PLoS ONE: Kinome-Wide Functional Genomics Screen afslører en ny mekanisme af TNF-induceret Nuclear Ophobning af HIF-1α transskription faktor i Cancer Cells

Abstrakt

Hypoxi-inducerbare faktor-1 (HIF-1) og dets vigtigste underenhed, HIF-1α, spiller en central rolle i tumorudvikling ved at regulere gener involveret i cancer celleoverlevelse, proliferation og metastase. HIF-1α aktivitet er forbundet med cellekerneakkumulering af transkriptionsfaktoren og reguleret af flere mekanismer, herunder modulering af proteinstabilitet og nedbrydning. Blandt de seneste fremskridt er de opdagelser, inflammationsinduceret cytokiner og vækstfaktorer påvirker protein akkumulering af HIF-1α under normoxi betingelser. TNFa, en stor pro-inflammatorisk cytokin, der fremmer tumorigenese er kendt som en stimulator af HIF-1α aktivitet. For at forbedre vores forståelse af TNF-medieret regulering af HIF-1α nukleare ophobning vi screenede en kinase-specifik siRNA bibliotek ved hjælp af en celle imaging-baserede HIF-1α-eGFP kimære reporter assay. Interessant, dette systematisk analyse fastslået, at udtømning af kinaser er involveret i konventionel TNF signalering (IKK /NFKB og JNK veje) har ingen skadelig virkning på HIF-1α akkumulation. På den anden side, udtømning af PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, og TRIB2 signifikant nedsætter virkningen af ​​TNFa på HIF-1α stabilitet i osteosarcom og prostatakræft-cellelinier. Disse nyopdagede regulatorer transporteres deres aktivitet gennem en ikke-konventionel RELB-afhang NFKB signalvejen og regulering af superoxid aktivitet. Tilsammen vores data kan det konkluderes, at TNFa anvender et særskilt og kompleks signalering mekanisme til at inducere akkumulering af HIF-1α i cancerceller. Sammenfattende vores resultater belyse en ny mekanisme, hvorigennem kræft initiering og progression kan fremmes af inflammatoriske cytokiner, fremhæver nye potentielle veje til bekæmpelse af denne sygdom

Henvisning:. Schoolmeesters A, Brown DD, Fedorov Y (2012) Kinome-Wide Functional Genomics Screen afslører en ny mekanisme af TNF-induceret Nuclear Ophobning af HIF-1α transskription faktor i kræftceller. PLoS ONE 7 (2): e31270. doi: 10,1371 /journal.pone.0031270

Redaktør: Ying Xu, University of Georgia, USA

Modtaget: September 13, 2011; Accepteret: 5 januar 2012; Udgivet: 15 februar 2012

Copyright: © 2012 Schoolmeesters et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Thermo Fisher Scientific. Der er ingen nuværende eksterne finansieringskilder til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konkurrerende interesse: Alle forfatterne er ansat af Thermo Fisher Scientific. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatterne tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Inflammation er en primær forsvar proces mod forskellige ekstracellulære stimuli, såsom vira, patogener, fødevarer, og miljøforurening. Adskillige undersøgelser har vist, at tumorigenese i mange cancertyper er tæt forbundet med kronisk inflammation. Unormale cellulære forandringer, der ledsager kronisk inflammation såsom oxidativt stress, genmutation, epigenetisk forandring, og inflammatorisk cytokinfrigivelse deles med kræftfremkaldende processer, som danner en kritisk cross-forbindelsen mellem kronisk inflammation og carcinogenese. Næsten 25% af cancere er rapporteret at forekomme gennem kronisk inflammation-relaterede processer [1], [2]. De pro-inflammatoriske regulatorer, såsom TNFa og andre cytokiner og deres receptorsteder net synes at spille vigtige funktioner i tumorigenese [3].

Hypoxi-inducible factor-1 (HIF-1) og dets vigtigste underenhed, HIF -1α, spiller en central rolle i tumor progression ved at regulere gener involveret i kræft celle overlevelse, spredning og metastaser [4]. HIF-1 er en væsentlig bestanddel af den ilt sensing system, der regulerer cellulære responser til nedsat oxygen tilgængelighed. Hypoxi inducerbar transskriptionsfaktor HIF-1 er en heterodimer sammensat af helixen-loop-helix-Per-Arnt-Sim (bHLH-PAS) proteiner HIF-1α og aryl hydrocarbon nukleare translokatoren (Arnt) også kendt som HIF-1β. Transaktivering af HIF-1 transmitterer en hypoksisk signal til et væld af patofysiologiske reaktioner ved regulering af talrige målgener [4], [5].

Udover hypoxi, nyere beviser tyder på, at HIF-1 kan være akkumuleret og aktiveret under normoxi af vækstfaktorer, cytokiner og andre faktorer forbundet med inflammation [5]. Adskillige rapporter har indikeret en vigtig rolle af TNFa i reguleringen af ​​HIF-1α stabilitet og aktivitet [6] – [8]. Men detaljerne i HIF-1 regulering af TNF fortsat uklare.

Her beskriver vi signalerer mekanismer, der tilskynder HIF-1α ophobning i respons på TNF. For at forbedre vores forståelse af HIF-1 regulering af cytokin, vi screenede en kinase-specifik lille interferens RNA (siRNA) bibliotek ved hjælp af en HIF-1α-eGFP kimære reporter assay under TNF behandling. Denne skærm fastslået, at udtømning af

ADCK2

,

PRKAR2B

,

TRIB2

TRPM7

mest markant nedregulerer nukleare ophobning af HIF-1α som svar på behandling af osteosarcomceller. Desuden er vores resultater antyder, at denne vej er også til stede i prostatacancerceller. Overraskende blev mekanismen for regulering af TNFa-fremkaldte HIF-1α akkumulering associeret med en ikke-konventionel NFKB-signalvejen og lindring af superoxid aktivitet. Tilsammen vores data tillade os at konkludere, at TNFa bruger en tydelig og kompleks signalering mekanisme til at fremkalde ophobning af HIF-1α.

Resultater

TNF er en stor inflammatorisk cytokin rapporteret at være en potent inducer af HIF-1α kerneakkumulation [5] – [8]. Vi undersøgte flere kræft cellelinjer til HIF-1α ophobning under TNF behandling. I vores eksperimenter, TNFa frembragte en signifikant stigning i kerneakkumulering af HIF-1α i flere annullere cellelinier (fig. 1a). Tilsvarende TNFa inducerede atomopbygning af en HIF-1α-eGFP kimærprotein (fig. S1a, fig. 1b, c) i HIF-1α_U2OS Omfordeling assay baseret på en osteosarcomcellelinie. Den observerede virkning var koncentrations- og tidsafhængig (fig. 1b, c). 24 timers inkubation med TNF ved 10 ng /mL blev valgt for alle screening eksperimenter for at skabe en passende vindue for at studere op- og nedregulering af HIF-1α akkumulation.

(A) TNF-induceret nukleare ophobning af HIF -1a i LNCaP, DU145, MCF10A og MDA MB231 kræft cellelinjer. Ekspression og nuklear akkumulering af HIF-1α blev bestemt ved immuncytokemi billeddannelse som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) TNFa-induceret stimulering af HIF-1α-eGFP cellekerneakkumulering i U2OS osteosarkom på en koncentrationsafhængig måde. (C) TNFa stimuleret HIF-1α-eGFP cellekerneakkumulering i U2OS celler på en tidsafhængig måde. Alle data (Median +/- MAD) normaliseret til ubehandlede celler. For hvert panel, data er repræsentative for to uafhængige forsøg udført tredobbelt *, **:. T-test p-værdi mellem behandlede celler og tilsvarende kontrolgruppe, * – p 0,01, ** – p 0,05

Der er to receptorer beskrevet for TNFa, nemlig TNF-receptor 1 (TNFR1, p55 receptor) og TNF-receptor 2 (TNFR2, p75 receptor). TNFR1 udtrykkes ubikvitært mens TNFR2 hovedsagelig udtrykkes i immunceller [9]. Selvom begge receptorer binder TNFa, den vigtigste receptor mediering cellulære virkninger i de fleste celletyper er TNFR1. I vores eksperimenter, knockdown af TNFR1 faktisk formindskes TNFa-afhængig nukleare akkumulering af HIF-1α (fig S1b). TNFa vides at aktivere flere veje nedstrøms for TNFR1 [9]. At undersøge rollen af ​​kinaser i reguleringen HIF-1α akkumulering under TNFa behandling, vi forarmet kinaser i HIF-1α-U2OS celler under anvendelse et siRNA kinase bibliotek målretning 788 kinaser og derefter analyseret cellulær akkumulering af HIF-1α-eGFP efter inkubation med TNFa ( fig. 2a). For at minimere siRNA off-target aktivitet vi brugte ON-TARGET

plus

version af menneskelige kinaser samling af SMART

pool

siRNA reagenser [10]. Den samme kinase bibliotek blev screenet i en kontrol cellelinie, som udtrykker kun eGFP at fratrække mulige ikke-specifikke virkninger. HIF-1α-eGFP screeningsdata blev underkastet Student t-test p-værdi analyse, Benjamini-Hochberg multiple sammenligninger korrektion [11], og ydeevne ranking efterfulgt af sammenligning mellem to uafhængige screeningsforsøg med en tærskelværdi 1,5 gange ændring. Resulterende data blev yderligere sammenlignet med data fra counter-skærmen med celler, der udtrykker eGFP kun (1,2 fold tærskel for eGFP forandring kun, Fig S2) og overlappende hits afskediget. Blandt de 788 kinaser screenet af siRNA-medieret dæmpning, udtømning af 77 gener øget HIF-1α-eGFP akkumulering over 2 gange (tabel S1) og udtømning af yderligere syv målgener faldt akkumulering under TNF behandling (fig. 2a). Generne, der påviser en siRNA-medieret formindskelse af HIF-1α akkumulering var af særlig interesse, fordi disse potentielt kan repræsentere medlemmer af TNFa signalveje. Disse omfatter

PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, RIOK2, TRIO, ADRA1B og TRIB2

. For at bekræfte, at faldet i TNF-induceret HIF-1α ophobning i siRNA-transficerede celler var direkte knyttet til manglen på udvalgte mål, vi gentog dette eksperiment ved hjælp nyligt syntetiserede siRNA pools (Fig. 2b). Kun én ud af syv udvalgte hit kandidater blev ikke bekræftet:. SiRNA målretning

ADRA1B

(data ikke vist), som efterfølgende blev udeladt fra yderligere analyse

(A) Repræsentative datasæt fra en kinome dækkende skærm af 788 siRNAs. Data (Median +/- MAD) er repræsentative for tre individuelle transfektioner og normaliseres til kontrolværdier siRNA. (B) De valgte siRNA ramt kandidater blev testet i separate forsøg. siRNA’er rettet mod

ADCK2, RIOK2, PRKAR2B, TRIB2, TRIO og TRPM7

blev bekræftet som hit kandidater og underkastes yderligere analyse. Alle data normaliseret til celler transficeret med kontrol siRNA NTC1. (C) Effekt af udvalgte siRNA hit kandidater på HIF-1α akkumulering i LNCaP prostatacancer-cellelinie. Data (Median +/- MAD) er repræsentative for tre uafhængige forsøg udført in triplo. Alle data normaliseret til TNFa-behandlede celler. *, **:. T-test p-værdi mellem behandlede celler og tilsvarende kontrolgruppe, * – p 0,01, ** – p 0,05

Et højt indhold Analyse tilgang muliggør samtidig erhvervelse af flere datastrømme fra det samme sæt af prøver. Vi udnyttet denne tilgang til yderligere at analysere screening data. Indsamlede data (celle nummer per felt) foreslog, at ingen af ​​de udvalgte siRNA’er (

PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, RIOK2, TRIO, og TRIB2)

produceret nogen virkning på cellers levedygtighed (Fig S3). Ud over kontrollen af ​​proteinstabilitet, kan HIF-1α funktion reguleres ved processer, der påvirker dets subcellulære lokalisering, f.eks cytoplasmatisk vs. nukleare. Samtidig måling af HIF-1α akkumulering i kerner og cytoplasma viste, at ingen af ​​de siRNA mål udvalgt til et fald i kerneakkumulation producerede en stigning i cytoplasmatisk tilbageholdelse af HIF-1α (data ikke vist).

For at undersøge hvis udvalgte kandidat hits kan påvirke TNF-medieret akkumulering af HIF-1α i andre celletyper vi bestemt HIF-1α nukleare oprustning i prostata cancer cellelinjer. HIF-1α akkumulering i LNCaP og DU145 celler viste sig at være følsomme over for TNFa mens PC3, en prostata-cellelinie med betydelig invasive potentiale [12], viste ingen sådan følsomhed (fig. 1a,). Udtømning af

PRKAR2B

,

ADCK2

,

TRPM7

TRIB2

faldt betydeligt HIF-1α ophobning i LNCaP, en androgen-følsomme menneskelige prostata adenocarcinom celle linje med lav invasiv potentiale (fig. 2c). Data svarende til U2OS og LNCaP blev også opnået fra MCF10A, en ikke-tumorigen brystepitel- cellelinie (fig S4A). I DU145-celler, en prostatacancer-cellelinie med moderat invasiv potentiale, kun

TRIB2

udtømning var effektivt til ophævelse TNFa-induceret HIF-1α akkumulering (fig s4b). På baggrund af ovenstående resultater

PRKAR2B, ADCK2, TRPM7 og TRIB2

blev udvalgt til yderligere analyse. siRNA pools målrettet mod disse gener produceret koncentrationsafhængige virkninger på TNFa-stimuleret HIF-1α akkumulering i U2OS osteosarkomceller (fig. 3a)

(A) De valgte siRNA’er reducere TNFa-medieret HIF-1α akkumulering på en koncentrationsafhængig maner. (B) siRNA puljer og individuelle siRNA molekyler produceret sammenlignelige effekter på HIF-1α akkumulation. (C) siRNA puljer og individuelle siRNA molekyler for de valgte hit kandidater yde effektiv target gen udtynding. U2OS celler blev inkuberet med TNFa i 24 timer. Alle data normaliseret til celler transficeret med kontrol siRNA NTC1. Data er repræsentative for to uafhængige forsøg, tre (A, B, Median +/- MAD) eller to (C, Mean +/- STDEV) individuelle transfektioner hver.

I alle vores eksperimenter vi ansat strategier der er kendt for at mindske siRNA off-target effekter: anvendelse af kemisk modificerede siRNA molekyler og brugen af ​​en siRNA pooling strategi. For yderligere at bekræfte, at faldet i TNFa-induceret HIF-1α akkumulering i siRNA-transficerede celler var direkte relateret til on target virkninger af siRNA, gentog vi dette forsøg under anvendelse af nyligt syntetiserede siRNA pools og fire separate siRNA-duplexer (der omfatter hver pulje ) at depletere alle fire cellulære mål. Disse eksperimenter givet resultater ligner screeningen data – for alle fire mål siRNA pools og fire individuelle siRNA-duplexer producerede signifikant fald i HIF-1α akkumulation ( 2 fold, figur 3b.). Effektiviteten af ​​target-gen knockdown for udvalgte siRNA hits blev bestemt ved anvendelse af Q-PCR og Solaris-sonder. Target gen udtømning korrelerer med HIF-1α fænotypisk analyse – for alle fire mål for siRNA puljer anvendes i screeningen kampagne og fire individuelle siRNA-duplexer viste potent knockdown ( 60%, figur 3c.). TRPM7 er dårligt udtrykt i U2OS celler og anvendelse af enhver RNAi reagens effektivt elimineret udtryk for dette mål til et målbart niveau (fig. 3c).

TNF er kendt for at regulere ekspressionen af ​​proteiner i sine egne signalering kaskader. Vi fandt, at ekspressionen af ​​ADCK2 og TRIB2 mRNA reguleres af TNF i U2OS kræftceller (Fig S5). Ingen statistisk blev påvist væsentlige ændringer for PRKAR2B og TRPM7.

Seneste rapporter viser, at HIF-1α stabilitet og aktivitet kan reguleres gennem oxidative stress-sensitive veje [6], [13], [14]. Sådanne veje er også velkendte regulatorer af TNFa signalering [6], [15]. For at undersøge en mulig rolle af oxidative stress mekanismer i TNF-stimuleret HIF-1α ophobning undersøgte vi effekten af ​​eksogene hydrogenperoxid. Mens hydrogenperoxid alene frembragte en signifikant stigning i HIF-1α akkumulering, blev der observeret en modsat virkning på TNFa-forbehandlede celler (fig. 4a). Dette resultat tyder på mulige negative regulering af HIF-1α ophobning af superoxid, en vigtigste kilde til intracellulær peroxid [16]. Vi antager, at nyopdagede positive regulatorer af HIF-1α ophobning kan styre enten superoxid produktion eller en konvertering til peroxid. I U2OS celler, TNFa robust forøget ekspression af MnSOD, en af ​​de største superoxid /peroxid konvertering enzymer (fig S6). Imidlertid, udtømning af de identificerede positive regulatorer af HIF-1α akkumulering havde ingen virkning på ekspression af MnSOD (Fig S6).

(A) Medens tilsætning af hydrogenperoxid (100 pM, 3 timers inkubation) kan stimulere HIF -1α akkumulering, det mindsker sådan akkumulering i TNFa-behandlede celler (21 timers inkubation med TNFa alene efterfulgt af 3 timers inkubation i nærvær af både TNFa og hydrogenperoxid). Data (Median +/- MAD) normaliseret til celler transficeret med kontrol siRNA NTC1 og behandlet med DMSO. (B) Superoxide skraldemanden redning HIF-1α akkumulation i celler transficeret med siRNA’er rettet mod

ADCK2

TRIB2

men ikke

PRKAR2B

eller

TRPM7

. Celler blev behandlet med TNFa svarende til (A) og inkuberet med Tiron (0,3 mM), 4-hydroxy-TEMPO (0,1 mM) eller DMSO (vehikelkontrol) i 3 timer. Data (Median +/- MAD) normaliseret til celler transficeret med kontrol siRNA NTC1 og behandlet med DMSO. For hvert panel data er repræsentative for to uafhængige eksperimenter udført firdobbelt. *, **:. T-test p-værdi mellem behandlede celler og tilsvarende kontrolgruppe, * – p 0,01, ** – p 0,05

Vi observerede, at superoxid skraldemanden Tiron og TEMPOL er i stand til at redde HIF-1α akkumulering i TNFa-behandlede celler transficeret med siRNA mod ADCK2, og TRIB2 når de anvendes i en koncentration, der ikke påvirker kontrolceller (fig. 4b). Celler transficeret med PRKAR2B og TRPM7 siRNA var upåvirket af superoxid skyllevæsker (Fig. 4b). Tilsammen vores data tyder på, at TNF medierer HIF-1α akkumulation gennem en mekanisme, der afbøder superoxid produktion, og ADCK2, PRKAR2B og TRIB2 er positive regulatorer af denne mekanisme.

Flere veje og faktorer er rapporteret som regulatorer af HIF- 1α-aktivitet i andre eksperimentelle systemer og betingelser, herunder konventionel NFKB, JNK, STAT3, og proteasomaktivitet [5]. Desuden er TNFa vides at inducere signalering gennem den konventionelle NFKB pathway [9], [17]. Analyse af vores resultater viste, at udtømning af kinaser, som er nødvendige for disse veje produceret nogen negativ indvirkning på TNFa-medieret HIF-1α akkumulering. I vores eksperimenter, TNFa ingen signifikant virkning på STAT3-afhængige vej (fig S7a). Vi antager, at fordi TNFa inducerer HIF-1α akkumulering, kan den også inhibere proteasomaktivitet. Til dette formål testede vi TNF som en mulig agonist i U2OS_E6-AP: p53 nedbrydning og U2OS_SCF-Skp2 E3: p27 nedbrydning Videredistribution analyser. Proteasomaktivitet inhibitor MG132 induceret akkumulering af eGFP kimærer i begge assays, mens inkubering med TNFa havde nogen virkning (fig S7b, c).

Data fra vores screeningsforsøg antyder, at udtømning af opstrøms regulatorer af JNK-vejen resulterer i en forøgelse af HIF-1α akkumulering som reaktion på TNFa behandling (tabel S1). Udtømning af de opstrøms regulatorer af den konventionelle NFKB vej

Chuk, IKBKB eller IKBKE

ikke modulere HIF-1α ophobning i respons på TNF-behandling (Fig S8). Desuden siRNA-medieret udtømning afslørede, at NFkB proteiner RELA og NFκB2 kan fungere som negative regulatorer af sådan akkumulering, fordi deres knockdown produceret kraftig stigning i HIF-1α akkumulation (fig. 5a). I modsætning hertil NFkB proteiner RELB, CreL og NFκB1 synes at være nødvendig for TNFa-induceret HIF-1α akkumulering, fordi udtømning af tilsvarende gener producerede stærkt negative virkninger på akkumulering (fig. 5A). Aktivering af NFKB-proteiner korrelerer med deres intracellulære translokation [17]. Vi fandt, at i U2OS osteosarkomceller, TNF stimulerer translokation af RELB og CREL mellem kernen og cytoplasmaet, med RELB at blive udelukket fra kernen og CREL akkumulere i kernen. Svarende til udtømning af TNFR1, udtømning af TRIB2 og TRPM7 forhindrede nukleare udelukkelse af RELB (fig. 5b). CreL translokation blev ikke påvirket af udtømning af udvalgte mål (data ikke vist). Endvidere blev virkningen af ​​RELB depletion svækket ved superoxid skyllevæsker Tiron og TEMPOL (fig. 5c). Tilsammen vores resultater antyder, at TNFa-medieret HIF-1α akkumulation kan i det mindste delvist styret af en ikke-konventionel NFKB signalvejen aktiveret af TRIB2 og TRPM7.

(A) Udtømning af NFκB1, RELB og CreL men ikke NFκB2 og RELA forstyrre HIF-1α akkumulering i TNFa-behandlede celler. (B) Udtømning af ADCK2 og PRKAR2B forhindrer ophobning af RELB i kerner af TNFa-behandlede celler. (C) Effekt af udtømning af RELB er reddet af ROS skraldemanden. Celler blev behandlet i lighed med fig. 4C. (D) Alle data (Median +/- MAD) er normaliseret til celler transficeret med kontrol siRNA NTC1 behandlet med TNF (10 ng /ml, 24 timer). Dataene er repræsentative for to uafhængige forsøg udført in triplo. *, **:. T-test p-værdi mellem behandlede celler og tilsvarende kontrolgruppe, * – p 0,01, ** – p 0,05

Diskussion

TNF er velkendt at fremkalde multiple signaleringsmekanismer hvor forskellige kinaser spiller uerstattelige roller. Nylige fremskridt i funktionel genomforskning og celle billeddiagnostiske teknikker tilladt os at udføre en systematisk undersøgelse af mulige mekanismer for TNF-medieret HIF-1α akkumulation. At undersøge rollen af ​​kinaser i reguleringen HIF-1-aktivitet under behandling med TNF-α, vi forarmet kinaser i U2OS osteosarkomceller bruger kemisk modificerede siRNA kinase bibliotek målretning 778 kinaser og derefter analyseret nukleare akkumulering af HIF-1α-eGFP kimæren udtrykkes konstitutivt i disse celler. I dette assay TNFa stærkt forøget HIF-1α-eGFP proteinakkumulering (fig. 1b, c).

Under normale fysiologiske betingelser HIF-1α akkumulation er stærkt undertrykt af flere regulatoriske pathways. Kinaser og beslægtede proteiner er velkendte for at spille en vigtig rolle i sådanne pathways. Forventede vi således, at størstedelen af ​​siRNA hit kandidater ville give en frigivelse fra undertrykkelsen af ​​HIF-1α akkumulering. Faktisk blandt de 788 kinaser screenet af siRNA-medieret dæmpning, udtømning af 6 kinaser faldt betydeligt HIF-1α ophobning og nedbrydning af en anden 89 kinaser øget HIF-1-aktivitet i celler behandlet med TNF (fig. 2a, b og tabel S1).

til en vis grad, vores data rekapitulerer tidligere resultater vedrørende negative regulatorer af HIF-1α aktivitet [18]. Det blev rapporteret, at SMG-1 undertrykker HIF-1-aktivitet under hypoxiske betingelser, og at siRNA-medieret depletion af genproduktet øger aktivitet af en HIF-1α-følsom reporter [18]. Resultater af vores screening forsøg viser, at udtømning af SMG-1 specifikt opregulerer TNFa-induceret HIF-1α ophobning (data ikke vist).

Flere veje viste sig at være betydeligt overrepræsenteret i gruppen af ​​77 negative regulatorer: 16 gener repræsenterer GO: 0.007.049 cellecyklus (

NEK4

,

TAF1L

,

CKS2

,

TTK

,

MAP3K8

,

PIM2

,

TLK1

,

PPP2CA

,

NEK9

,

PRKAG1-

,

NEK6

,

PLK4

,

DGKZ

,

DUSP1

,

PIM1

,

PRKAA2

), 11 gener repræsenterer GO: 0.000.165 MAPKKK signaleringskaskade (

PPP2CA

,

RPS6KA3

,

DUSP5

,

MAPKAPK3

,

MAPK8IP3

,

MAP4K5

,

DUSP2

,

MAPK11

,

MAP4K1

,

DUSP1

,

MAP3K9

), og fire kinaser repræsenterer GO: 0.007.254 JNK kaskadesystem (

MAP4K1

,

MAP4K5

,

MAPK8IP3

,

MAP3K9

) (tabel S1). Disse data tyder på, at sådanne pathways kan modsætte TNFa signalering og inhiberer HIF-1α akkumulering.

Udtømning af adskillige målgener inhiberer TNFa-medieret HIF-1α akkumulering (fig. 2). Disse gener kan repræsentere en eller flere TNFa signaling mekanismer, og er af særlig interesse. I vores screening kampagne identificerede vi seks mål af denne art (fig. 2b). Desuden er vores resultater tyder på, at fire af disse gener –

ADCK2

,

PRKAR2B

,

TRIB2

TRPM7

– synes at regulere HIF-1α akkumulation i flere cancercellelinier (fig. 2, fig S4). Alle fire gener er tidligere beskrevet i forbindelse med regulering af kræft celledeling og motilitet, men eksisterende data ikke tyder deres deltagelse i TNF signalering [19] – [23]. Funktionerne af

ADCK2

protein er endnu ikke klart. Det vides ikke, om det har proteinkinaseaktivitet og hvilken type substrat ville phosphorylere. Adskillige rapporter etableret en forbindelse af

ADCK2

til kræft celledeling og motilitet [20].

PRKAR2B

koder for cAMP-afhængig proteinkinase type II-beta regulatoriske underenhed. CAMP-afhængig proteinkinase A (PKA) er et allestedsnærværende serin /threoninproteinkinase. PKA er accepteret som en vigtig formidler af intracellulære cAMP-signaler i eukaryoter. Til dato er der blevet rapporteret et stort antal cytoplasmatiske og et par nukleare PKA substrater [23]. Interessant, udtømning af

PRKAA1

(den katalytiske underenhed af PKA) producerede også et fald i HIF-1α akkumulering, selv i en mindre grad end

PRKAR2B

depletion (data ikke vist). Yderligere undersøgelser er nødvendige for at klarlægge den nøjagtige rolle PKA i TNF-stimuleret HIF-1α akkumulation. Selvom den molekylære funktion TRIB2 (Tribbles homolog 2) er stadig uklart, er det blevet identificeret som en potentiel drivkraft for lunge tumorigenese og en myeloid onkogen [21], [22]. TRPM7 er en ubikvitært udtrykt og konstitutivt aktive divalent kation kanal. Det giver en mekanisme til Mg2 + indrejse og dermed er det vigtigt for celle overlevelse og spredning [19], [24]

Vigtige regulatorer af TNFa- signalveje er reaktive ilt arter (ROS;.

f.eks

., superoxid, hydrogenperoxid og hydroxylradikal) [6], [15]. ROS er blevet foreslået at modulere TNFa signalering, giver både positiv og negativ regulering af NFKB systemet nedstrøms for TNFR1 afhængigt af eksperimentelle system og [6], [25]. Vores resultater antyder, at hydrogenperoxid undertrykker TNFa-medieret HIF-1α akkumulering (fig. 4a). Disse data antyder, at kilden til intracellulær hydrogenperoxid, kan superoxid anion inhibere TNFa-medieret HIF-1α akkumulering samt. Vi antager, at de nyligt beskrevne regulatorer af akkumulering kan fremkalde deres virkning gennem modulering af superoxid-produktion. Faktisk lindring af superoxid anion aktivitet redder HIF-1α akkumulering på baggrund af udtømning af ADCK2 og TRIB2 (fig. 4b). Alle disse resultater antyder, at TNFa-induceret HIF-1α ophobning kan reguleres af en superoxid følsom pathway, og at de ovennævnte tre proteiner kan være involveret i negativ regulering af superoxid-produktion (fig. 6).

Vores resultater tyder at TNFR1 receptoren kan formidle sin virkning gennem en kompleks mekanisme, som omfatter en ikke-konventionel NFkB-afhængige vej. Denne mekanisme kan have en negativ regulere produktionen af ​​reaktive ilt arter og synes at være kontrolleret af TRIB2, ADCK2 og PRKAR2B.

Det er velkendt, at konventionelle og ikke-konventionelle NFKB signalering kaskader er store mekanismer, der formidler effekter af TNF på intra-cellulær fysiologi [26]. Vores screening resultater antyder, at udtømning af positive regulatorer opstrøms konventionel NFKB – IKK-α (

CHUK

), IKK-β (

IKKB

) eller IKK-ε (

IKBKE

) – produceret nogen negativ indvirkning på HIF-1α nukleare akkumulation (fig S8)

også fandt vi, at udtømning af

RELA

og

NFKB2

resulterer i en betydelig. opregulering af HIF-1α akkumulation mens udtømning af

RELB

,

CREL

og

NFKB1

giver et fald i HIF-1α akkumulation. En sådan nedgang kan reddes ved afbødning af superoxid anion aktivitet (fig. 5). Desuden udtynding

TRIB2

TRPM7

fandtes at forhindre intracellulær translokation af RELB efter behandling med TNF. Disse fund tilladt os at spekulere, at TNFa kan regulere HIF-1α akkumulering gennem både konventionelle og ikke-konventionelle NFKB pathways. Den faktiske mængde af akkumuleret HIF-1α vil så afhænge af en balance mellem forskellige TNFa-induceret NFKB veje. Den foreslåede model synes at være i overensstemmelse med den kendte kompleksitet inflammation-cancer relationer [3].

Samlet vore resultater antyder, at TNFa-induceret HIF-1α buildup reguleres af en flere veje (fig. 6 ). I det mindste delvis, kan TNFa formidle sin virkning gennem TNFR1 receptorsignalering fører til en ikke-konventionel NFKB-afhængig mekanisme, der negativt regulerer produktionen af ​​reaktive oxygenarter. Denne mekanisme synes at være kontrolleret af ADCK2 og TRIB2. TRPM7 synes at stimulere RELB translokation, men dens udtømning fænotype kan ikke reddes ved lindring af superoxid aktivitet. Således kan TRPM7 udgøre en uafhængig vej for regulering af HIF-1α akkumulering. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå den større kompleksitet af TNF-afhængig stimulering af HIF-1α nukleare ophobning og dens rolle i tumorigenese og tumor progression.

Materialer og Metoder

Cellelinjer

PC3, DU145, LNCaP, MCF10A, MDAMB-231, blev MCF7, SW480 og HepG2 opnået fra ATCC og vedligeholdt i henhold til anbefalede protokoller.

HIF-1α_U2OS Omfordeling assay blev brugt i screening kampagne for at overvåge HIF- 1α kerneakkumulation: rekombinante U2OS celler, der stabilt udtrykker human

HIF-1α

(NM_001530) fusioneret til den C-terminale ende af et forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP). U2OS celler er vedhængende epitelceller fra humant osteosarkom. Ekspression af eGFP-HIF-1α styres af en standard CMV-promotor og kontinuerlig ekspression opretholdes ved tilsætning af G418 til dyrkningsmediet ifølge producentens protokol. U2OS stabil cellelinie, som udtrykker eGFP kun blev anvendt som en subtraktion kontrol i screeningkampagne

Udover HIF-1α_U2OS virkningen af ​​TNFa behandling blev testet i tre separate Thermo Fisher Scientific Gendistribution Assays:. Den STAT3_U2OS redistributionsassay , E6-AP: p53 nedbrydning Omfordeling Assay (U2OS), og SCF-Skp2 E3 Ligase: p27 nedbrydning Omfordeling Assay (U2OS). Assays blev udført ifølge producentens protokoller for alle referencestoffer. Til TNFa-behandling, blev hvert assay cellelinie behandlet i 24 timer ved 37 ° C med TNFa i følgende koncentrationer: 80 ng /ml, 40 ng /ml, 20 ng /ml, 10 ng /ml, 5 ng /ml, 2,5 ng /ml, 1,25 ng /ml og 0,63 ng /ml. Hver TNFa titrering blev udført i fire eksemplarer på 96-brønds assayplader, og hver assayplade blev udført tre gange. Efter TNFa behandling blev pladerne fikseret, farvet med Hoechst 33258, og afbildes som beskrevet nedenfor. TNF blev købt fra R & D Systems, hydrogenperoxid, Hoechst 33258, Tiron og 4-hydroxy-TEMPO (TEMPOL) blev købt fra Thermo Fisher Scientific

transfektion

Alle cellelinier blev transficeret. med Dharmafect (DF) transfektion reagenser (Thermo Fisher Scientific): DF1 (HepG2, MCF7, MCF10A), DF2 (SW480), DF3 (HIF-1α_U2OS, DU145, LNCaP, PC3) og DF4 (MDA-MB-231).