PLoS ONE: CEACAM6 Fremmer Gastric Cancer invasion og metastase ved at inducere Epithelial-Mesenchymale Overgang via PI3K /AKT signalvej

Abstrakt

overudtrykt CEACAM6 i tumorvæv spiller vigtige roller i invasion, metastase og anoikis resistens i en række humane cancere. Vi har for nylig rapporteret, at CEACAM6 udtryk er opreguleret i Gastric cancer (GC) væv og fremmes GC metastaser. Her rapporterer vi, at CEACAM6 fremmer peritoneale metastaser

i

vivo

er negativt korreleret med E-cadherin udtryk i GC væv. Overudtrykt CEACAM6 induceret epitelial-mesenkymale overgang (EMT) i GC, som målt af stigninger i EMT markører N-cadherin, vimentin og Slug mens E-cadherin ekspression blev reduceret i CEACAM6-overekspression GC celler; modsatrettede resultater blev observeret i CEACAM6-tavshed celler. Endvidere blev E-cadherin ekspression negativt korreleret med dybden af ​​tumorinvasion, lymfeknudemetastase og TNM fase i GC væv. Derudover kunne CEACAM6 forhøjet matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) aktivitet i GC, og anti-MMP-9-antistof vende den stigende invasion og migration induceret af CEACAM6. CEACAM6 steg også niveauet af phosphoryleret AKT, som er involveret i udviklingen af ​​en række humane tumorer. Vi yderligere observeret, at LY294002, en PI3K-inhibitor, kunne vende CEACAM6-induceret EMT via mesenchymale-epitelial overgang. Disse resultater tyder på, at CEACAM6 forbedrer invasion og metastase i GC ved at fremme EMT via PI3K /AKT signalvej

Henvisning:. Zang M, Zhang B, Zhang Y, Li J, Su L, Zhu Z, et al . (2014) CEACAM6 Fremmer Gastric Cancer invasion og metastase ved at inducere Epithelial-Mesenchymale Overgang via PI3K /AKT signalvejen. PLoS ONE 9 (11): e112908. doi: 10,1371 /journal.pone.0112908

Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: August 7, 2014 Accepteret: Oktober 16, 2014; Udgivet: November 14, 2014

Copyright: © 2014 Zang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.172.324, No. 91.229.106, No. 81.272.749, og nr 81.372.231), og Key projekt af Shanghai uddannelsesudvalg (nr 12ZZ105 og No.12ZZ102) og Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (nr 13ZR1425600). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

GC er en af ​​de mest almindelige maligne tumorer og et stort problem sundheden på verdensplan, især i østasiatiske lande som Japan, Korea, Kina, hvor det er den anden årsag til kræft dødsfald [1] – [3]. Carcinoembryonisk antigen-relateret celleadhæsionsmolekyle 6 (CEACAM6) er et glycosylphosphatidylinositol (GPI)-bundne immunoglobulin superfamilien, der overudtrykkes i en række humane cancere, især gastrointestinale cancere [4], og fungerer som et intercellulært adhæsionsmolekyle [4] – [6]. Selvom CEACAM6 er et GPI-forankret celleoverfladen glycoprotein det mangler et transmembrant eller intracellulært domæne, men er i stand til at påvirke intracellulær signalering begivenheder og spiller en vigtig rolle i gastrointestinal cancer progression [4], [6] – [8]. GPI-forankrede molekyler er ofte co-lokaliseret til små membran mikrodomæner i plasmamembranen [9], som kan aktivere nedstrøms signalleringskaskader såsom integrin signalvejen [10]. CEACAM6 fungerer som et onkogen i tumorer og fremmer cancer invasion, metastase, anoikis modstand og kemoresistens, og hæmmer differentiering [7], [8], [11]. Vi har for nylig rapporteret, at CEACAM6 ekspression er opreguleret og associeret med lymfeknudemetastaser i GC væv [12]. Imidlertid er de mekanismer, hvorigennem CEACAM6 påvirkninger intracellulær signaltransduktion i GC mangler at blive fastlagt.

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT) er ikke kun en fysiologisk proces under fosterudviklingen eller væv regenerering, men også en patologisk element i cancer progression, involverer tumormetastase, apoptose og senescens resistens [13] – [15]. EMT angiver altid en dårlig klinisk prognose i humane cancere. En række mekanismer er relevante for EMT initiering er blevet dokumenteret, herunder TGF-β, IL-6, PI3K /AKT, RAF /MAPK, og SRC pathways [15] – [18]. I vores tidligere undersøgelse, observerede vi CEACAM6-induceret SRC aktivering i GC celler [12], og observerede forøgede antal af spindel-formet CEACAM6-overekspression celler sammenlignet med kontrol celler. Derfor var vi meget interesserede i at bestemme forholdet mellem CEACAM6 og EMT i GC celler. Selv negativ korrelation mellem CEACAM6 og EMT er blevet registreret i bugspytkirtelcarcinomer [19], de mekanismer, hvorved CEACAM6 regulerer EMT er dårligt forstået.

I denne undersøgelse har vi yderligere undersøgt virkningerne og potentielle veje for CEACAM6 i GC invasion og metastase, og undersøgt dens korrelation med EMT.

Materialer og metoder

Etik Statement

skriftligt informeret samtykke i studiet er indhentet fra alle deltagere. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den etiske komité i Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. procedurer Animal blev udført i henhold til en protokol godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Kina.

cellelinjer og vævsprøver

Den menneskelige GC cellelinjer SGC-7901, MKN-45 og MKN-28 blev købt fra Shanghai Institutes for Biologisk Institut, Chinese Academy of Sciences. Celler blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2 og mætning fugtighed i RPMI-1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum.

Gastric tumor og tilstødende ikke-tumorvævet blev opnået fra 93 patienter med GC som gennemgik helbredende operation på Shanghai Jiaotong University School of Medicine Affiliated Ruijin Hospital fra 2010 til 2013. patienterne bestod af 69 mænd og 24 kvinder med en gennemsnitsalder på 62,1 år (interval, 30-85 år). Ingen af ​​patienterne havde modtaget strålebehandling eller kemoterapi før kirurgi. Klinisk-patologisk data blev indsamlet og patologisk tumor iscenesættelse blev bestemt ifølge UICC TNM klassifikationen. Histologisk typning blev udført af mindst to sagkyndige patologer arbejder selvstændigt i en dobbelt-blindet mode. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Shanghai Ruijin Hospital, og alle patienter var fuldt informeret om de eksperimentelle procedurer.

Vector konstruktion og transfektion

Fuld-længde CEACAM6 cDNA blev opnået ved RT PCR fra totalt RNA ekstraheret fra GC-prøver. Primersekvenserne var 5′-CCGGAATTCCCATGGGACCCCCCTCAGCCC-3 ‘(fremad) og 5′-TCCCCCGGGGCTATATCAGAGCCACCCTGG-3’ (revers). Vi samlede et pIRES2-eGFP-CEACAM6 konstruktionen ved at indsætte CEACAM6 cDNA i pIRES2-eGFP vektor. Vi næste transficerede pIRES2-eGFP-CEACAM6 eller pIRES2-eGFP vektor i SGC-7901 og MKN-45 celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. Stabile kloner blev udvalgt ved kontinuerlig behandling med G418 (1,2 mg /ml; Gibco, New York, USA)

Lentiviral vektor konstruktion

Baseret på humane CEACAM6 gen data, et par oligonukleotidsekvenser. og negative kontrolprøver sekvenser blev udformet og syntetiseret ved Shanghai Novobio Scientific Co., Ltd shRNA sekvenser var som følger: CEACAM6, 5′-CACCGCCGGACAGTTCCATGTATACGAATATACATGGAACTGTCCGG-3 ‘(fremad), og 5′-AAAACCGGACAGTTCCATGTATATTCGTATACATGGAACTGTCCGGC-3′ (revers); kontrol, 5’-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3 ‘(fremad), og 5′-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3’ (revers). CEACAM6 shRNA blev subklonet ind pL /shRNA /F lentiviral vektor for at opnå en PL /shRNA /SHR-CEACAM6 konstrukt. Derefter pL /shRNA /SHR-CEACAM6 eller kontrol lentivirale vektorer blev transficeret ind MKN-28 GC-celler. Stabilt transficerede celler blev udvalgt ved behandling med 5 ug /ml blasticidin og blev anvendt til identifikation og yderligere forskning.

Western blotting

Celler blev høstet og lyseret ved hjælp RIPA buffer (Solarbio, Beijing, Kina ) indeholdende 1% PMSF proteaseinhibitorer. En BCA assay kit (Pierce, Rockford, USA) blev anvendt til at måle den totale proteinkoncentration. Ækvivalente mængder af protein blev separeret ved 10% SDS-PAGE, og de opløste proteiner overført til PVDF-membraner. Membranerne blev blokeret med 5% skummetmælk i 2 timer og derefter inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Primære antistoffer var som følger: CEACAM6 (1:500, Abcam, USA), E-cadherin (1:500; Cell Signaling Technology (CST), USA), N-cadherin (1:500, CST, USA), vimentin ( 1:1000, CST, USA), Slug (1:500, CST, USA), p-AKT (Ser473) (1:1000, CST, USA), total AKT (1:1000, CST, USA) og GAPDH ( 1:10000, Abcam, USA). Membraner blev derefter inkuberet med sekundært antistof i 2 timer ved stuetemperatur og blev visualiseret ved anvendelse af et forøget kemiluminescens påvisningssystem (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) i overensstemmelse med producentens protokol.

immunfluorescensfarvning

Celler blev dyrket på dækglas i 24 timer og derefter fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter. Celler blev vasket med PBS, derefter permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i 20 minutter og blokeret med 5% BSA i 30 minutter ved stuetemperatur. Dernæst farves cellerne med CEACAM6 antistof (1:50; Abcam) ved 37 ° C i 2 timer, efterfulgt af inkubation med fluorescerende sekundære antistof i 1 time ved stuetemperatur. Kernerne blev farvet med DAPI. Rhodamin phalloidin antistof (1:150; Cytoskeleton) blev anvendt til at visualisere cytoskelettet af GC-celler. Objektglas blev analyseret og afbildes på et fluorescensmikroskop.

Immunhistokemi

Sektioner af 4 um tykke, blev skåret fra paraffinindlejrede vævsblokke og derefter afparaffiniseret og rehydreret. Immunohistokemisk farvning af snit blev udført i overensstemmelse med DAKO-protokollen, under anvendelse af muse-anti-CEACAM6 (1:100; Abcam) og E-cadherin (1:100; CST) ved 4 ° C natten over. Objektglas blev derefter inkuberet med HRP-mærket sekundært antistof og visualiseret ved diaminobenzidin. To patologer, der var blindet eventuelle patientdata uafhængigt evalueret og scorede sektionerne. Immunhistokemi plet score = positiv celle score + farvning intensitet score. Procentdelen af ​​positive celler blev scoret som følger: 0 (10%), 1 (10-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) og 4 ( 75%). Immunohistokemisk farvning intensitet blev bedømt som følger: 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning), 2 (brun farvning), og 3 (mørkebrun farvning). Total score på ≥3 blev defineret som positivt at forenkle dataanalyse. At analysere sammenhængen mellem CEACAM6 og E-cadherin ekspression, Image-Pro Plus version 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) blev anvendt til at kvantificere ekspressionen af ​​CEACAM6 og E-cadherin på 20 prøver.

gelatinezymografi

For at undersøge MMP-9-aktivitet, blev zymografi udført under anvendelse af 10% SDS-PAGE geler indeholdende 1 mg /ml gelatine (Sigma). Kort fortalt, GC celler blev dyrket i serumfrit RPMI-1640 medium i 24 timer, og supernatanten blev derefter opsamlet og centrifugeret ved 1000 rpm i 5 min. Gelerne blev vasket to gange i renatureringsbuffer (2,5% Triton X-100) i 30 minutter hver gang for at fjerne SDS efter elektroforese og derefter inkuberet ved 37 ° C i 24 timer i en reaktionsbuffer (50 mM Tris-HCI pH 7,5, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl). Dernæst farves gelerne med 0,5% Coomassie brilliant blue R-250 i 2 timer og affarvet gelerne i buffer (30% methanol, 10% eddikesyre). Klare gennemsigtige bånd i baggrunden af ​​blåfarvning repræsenterede gelatinase aktiviteter.

Cell migration og invasion analyser

For celle migration og invasion analyser, i alt 1 × 10

5 celler suspenderet i serumfrit RPMI-1640 med eller uden MMP-9-antistof (Abcam, 2 ug /200 ul) og udpladet i transwell kamre (8 um til 24-brønds plader; Corning Costar, NY, USA) med eller uden Matrigel ( BD Bioscience, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokoller. For begge assays blev medium indeholdende 10% FBS tilsat til det nederste kammer som en kemoattraktant. Efter 24 timer dyrkning blev cellerne fikseret med 10% formalin og farvet med 0,5% krystalviolet. Endelig blev cellerne i det nedre kammer fotograferet og talt ved inverteret mikroskopi.

Nude mus xenograftmodel

Fire uger gamle BALB /c nøgne mus (Institute of Zoology, Kina Academy of Sciences) blev anvendt til at evaluere rolle CEACAM6 i peritoneal breder

i

vivo

. Nøgne mus blev opstaldet på en SPF-miljø i Animal Laboratory Unit, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Kina. Mus fik human pleje og undersøgelsens protokoller blev udført i overensstemmelse med en protokol godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Kina. I alt 2 × 10

6 SGC-7901-CEACAM6 eller SGC-7901-NC-celler blev injiceret i fem mus bughule hver gruppe (randomisering). Mus blev aflivet den 30. dag efter injektion, og den abdominale masserne blev afbildet og fotograferet. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de officielle anbefalinger fra den kinesiske dyresamfund.

Statistik

Studerendes

t

-test blev anvendt til at undersøge de statistiske forskelle mellem de to grupper . Korrelationer mellem E-cadherinekspression i GC væv og klinisk-patologiske parametre og CEACAM6 udtryk blev analyseret ved chi-square eller Fishers eksakte test eller Pearson korrelationskoefficient analyse. Data er vist som middelværdi ± SD.

P

0,05 og

P

. 0,01 blev betragtet som statistisk signifikant og meget signifikant, henholdsvis

Resultater

CEACAM6 påvirker celle morfologi og cytoskelet

Vores tidligere resultater indebar, at MKN-28 GC celler sagens natur udtrykker høje niveauer af CEACAM6, hvorimod SGC-7901 og MKN-45 GC celler udtrykker lave niveauer [12]. Overekspression af CEACAM6 i SGC-7901 og MKN-45 GC-celler og dæmpning af CEACAM6 ekspression i MKN-28 GC-celler ved pL /shRNA /SHR-CEACAM6 lentivirale vektorer blev bekræftet på proteinniveau ved Western blot analyse (fig. 1A). Immunofluorescensassays altid viste, at SGC-7901-CEACAM6 celler udtrykkes mere CEACAM6 protein end SGC-7901-NC-celler (fig. 1B).

(A) Stabil overekspression og undertrykkelse af CEACAM6 i GC celler. (B) CEACAM6 ekspression blev analyseret ved immunofluorescens, og mere CEACAM6 ekspression blev detekteret i CEACAM6-overudtrykkende celler end i kontrolceller (200 ×). Blå: DAPI; rød: CEACAM6. (C) Overekspression af CEACAM6 i SGC-7901 og MKN-45 celler inducerede en mesenchymal morfologi, mens knockdown af CEACAM6 i MKN-28 celler induceret en epitelial morfologi (200 ×). (D) immunfarvning af F-actin i CEACAM6-overudtrykkende celler og kontrolceller (400 ×). Rød: F-actin; blå:. DAPI

Interessant nok blev cellemorfologi ændret efter CEACAM6 dæmpning og overekspression. Sammenlignet med kontrolcellerne, SGC-7901-CEACAM6 og MKN-45-CEACAM6 celler udviste en mere mesenchymal-lignende morfologi, og var spindle- og fusiform-formet (fig. 1C). Omvendt blev typisk overgang fra mesenkymale til epithelmorfologi påvist i MKN-28-SH-celler sammenlignet med MKN-28-nc celler (Fig. 1C). Det var imidlertid uklart, om CEACAM6 overekspression havde en virkning på cytoskelettet, således immunfluorescensfarvning af F-actin-farvning blev udført. Interessant nok blev større størrelse tenformede-formede celler observeret for MKN-45-CEACAM6 og SGC-7901-CEACAM6 linjer sammenlignet med kontrolcellerne (fig. 1D).

CEACAM6 er negativt forbundet med E-cadherin i GC væv

immunhistokemisk analyse blev anvendt til at bestemme indholdet af E-cadherin udtryk i kræft væv og parrede tilstødende ikke-tumor-væv. Immunohistokemisk farvning viste E-cadherin-ekspression var lavere i tumorvæv end i tilstødende ikke-tumor-væv, og afslørede, at E-cadherin hovedsagelig ligger i cytomembrane af epitelceller (fig. 2D, E, F). Dernæst undersøgte vi forholdet mellem E-cadherin-ekspression og klinisk-patologiske træk ved GC, og fandt, at nedreguleret E-cadherin var forbundet med dybden af ​​invasion (

P

= 0,046), lymfeknudemetastase (

P

= 0,013), og TNM stadie (

P

= 0,035), men ikke med andre klinisk-patologiske faktorer, herunder køn, alder, eller differentiering (tabel 1). Derudover CEACAM6 var negativt korreleret med EMT i bugspytkirtelcarcinomer [19] og CEACAM6 undertrykkelse kunne øge E-cadherin promotor-aktivitet i kolorektal cancer [20].

(A) Negativ CEACAM6 udtryk i ikke-tumor maveslimhinden. (B, C) Positiv eller negativ CEACAM6 udtryk i GC prøver. (D) Kraftig positiv E-cadherin-ekspression i ikke-tumorøse maveslimhinden. (E, F) Negativ eller positiv E-cadherinekspression i GC prøver. (G) Negativ korrelation mellem CEACAM6 og E-cadherin ekspression blev påvist i GC væv (R = -0,636,

P

0,01). (200 ×)

Endvidere undersøgte vi sammenhængen mellem E-cadherin og CEACAM6 ekspression i GC’ers ved seriel sektion immunhistokemi (20 prøver). CEACAM6 udtryk i tumorvæv var højere end i matchede ikke-tumorform væv (Fig. 2A, B, C), i overensstemmelse med vores tidligere resultater [12]. Interessant, fandt vi, at CEACAM6 udtryk negativt var korreleret med E-cadherin udtryk i GC væv af Pearson korrelationskoefficient analyse (

P

0,01;. Figur 2G).

CEACAM6 inducerer EMT i GC celler

EMT-relaterede proteiner i GC-celler blev evalueret ved Western blot analyse. Vi observerede, at N-cadherin, vimentin og Slug proteinniveauer blev forøget, mens E-cadherin blev reduceret i CEACAM6-overudtrykkende celler sammenlignet med deres respektive kontrolceller (fig. 3A, B). Converse resultater blev opnået efter CEACAM6 blev slået ned i MKN-28-celler (fig. 3C, D). Disse resultater foreslog en funktionel rolle for CEACAM6 i regulering EMT i GC celler. Desuden disse observationer i GC celler var ens med resultaterne i GC væv.

(A, C) De protein niveauer af EMT markører blev analyseret ved western blot analyse GC celler med CEACAM6 overekspression eller knockdown. (B, D) Relativ EMT markør ekspression i CEACAM6-overudtrykkende og -silenced GC-celler blev beregnet ved skaleringsforhold grå. Resultaterne er hjælp af tre uafhængige eksperimenter i søjlediagrammer. *

P

0,05, **

P

. 0,01

CEACAM6 hæver aktiviteten af ​​MMP-9 i GC celler

Det er velkendt, at vedhæftning, nedbrydning og migration er vigtige spørgsmål i kræft metastaser. Gelatinezymografi blev udført for at undersøge effekten af ​​CEACAM6 på aktiviteten af ​​MMP-9, hvilket er vigtigt i ECM nedbrydning. MMP-9-aktivitet i SGC-7901-CEACAM6 og MKN-45-CEACAM6 celler blev forøget i forhold til deres kontrolgrupper (fig. 4A, B). Derefter undersøgte vi, om den øgede aktivitet af MMP-9 induceret af CEACAM6 i GC-celler resulterede i en sand stigning i antallet af invaderende og migrerende celler. Vi undersøgte således bidraget fra aktive anti-MMP-9 antistof eller PBS til CEACAM6 overudtrykker GC-celler. Som forventet var der betydelige forskelle i antallet af invaderende og migrerende celler i antistof-behandlede celler sammenlignet med PBS-behandlede celler (

P

0,01;. Figur 4C, D, E, F).

(A) supernatanten fra GC-celler blev opsamlet efter 24 timer. Derefter MMP-9-aktivitet blev undersøgt ved gelatinezymografi. (B) Relativ MMP-9-ekspression i GC-celler. (C, E) Transwell assay. Billeder viser celler, der var rejst igennem mikroporemediet membran med eller uden matrigel (200 ×). (D, F) Histogrammer viste antallet af migrerende celler og invaderende celler. Resultaterne er hjælp af tre uafhængige eksperimenter i søjlediagrammer. *

P

0,05, **

P

. 0,01

CEACAM6 opregulerer phosphoryleret AKT i GC celler

Vi har tidligere observeret at SRC aktivitet blev fremkaldt ved CEACAM6 i SGC-7901 GC celler. AKT er en nedstrøms protein på SRC og dramatisk forbundet med EMT, invasion og metastase i tumorudvikling. Vi evaluerede derfor AKT-aktivitet i CEACAM6 overudtrykker GC-celler. Western blotting viste, at AKT-phosphorylering i serin 473 blev markant forøget i CEACAM6 overudtrykker GC-celler sammenlignet med kontrolgrupperne (fig. 5A, B). For at undersøge om EMT ændringer blev induceret af CEACAM6 via PI3K /AKT pathway blev SGC-7901-CEACAM6 og MKN-45-CEACAM6 celler behandlet med 100 nM LY294002 i 24 timer. Interessant nok blev E-cadherin forøget og N-cadherin blev reduceret i LY294002-behandlede CEACAM6-overudtrykkende celler sammenlignet med kontrollerne, som målt ved Western blot analyse (fig. 5C, D).

(A) Western blot-analyse viste, at overekspression af CEACAM6 forøget p-AKT (Ser473) phosphorylering. GAPDH og total AKT blev anvendt som indlæsning kontroller. (B) Kvantificeringen af ​​p-AKT (Ser473) ekspression i GC-celler. (C) E-cadherin ekspression blev forøget, mens N-cadherin ekspression blev reduceret i CEACAM6 overudtrykker GC celler behandlet med LY294002, en PI3K-inhibitor. (D) Relativ E-cadherin og N-cadherin-ekspression i CEACAM6 overekspression og LY294002-behandlede GC-celler blev beregnet ved skaleringsforhold grå. Resultaterne er hjælp af tre uafhængige eksperimenter i søjlediagrammer. *

P

. 0,05

CEACAM6 fremmer peritoneal breder in vivo

Endelig har vi undersøgt virkningerne af CEACAM6 overekspression på peritoneal breder og metastase

i

vivo

. Vi injicerede SGC-7901-CEACAM6 og SGC-7901-NC celler i abdomen nøgne mus. Omfattende peritoneal spredning blev observeret i SGC-7901-CEACAM6 gruppen sammenlignet med SGC-7901-NC-gruppe (fig. 6A). Der var betydeligt mere synlige peritoneale knuder i SGC-7901-CEACAM6 gruppe end i kontrolgruppen (5,400 ± 0,510

vs

1,400 ± 0,245,

P

. 0,01;. Fig 6B ). Derudover overekspression af CEACAM6 styrke metastaser

i

vivo

er også blevet rapporteret i bugspytkirtelkræft [19].

(A) Øget antal metastatiske knuder blev observeret i SGC-7901-CEACAM6 gruppe end kontrolgruppen, som angivet ved de sorte pile. (B) Gennemsnitligt antal peritoneale knuder i to grupper. Flere knuder fandt sted i SGC-7901-CEACAM6 gruppe end SGC-7901-NC-gruppe.

Diskussion

GC er den anden årsag til kræft dødsfald på verdensplan [1] . Stigende tyder på, at CEACAM6 spiller en vigtig rolle i gastrointestinal cancer progression [7], [20] – [22], og CEACAM6 er mere udbredt end CEA (CEACAM5) i normale væv, med betydelig udtryk i mange epitel [4]. CEACAM6 påvirkninger intracellulære signalsystemer begivenheder gennem homofil og heterofil vedhæftning med andre CEACAMs eller integriner [23], [24]. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge bidrag GPI-forankret protein CEACAM6 i GC progression.

Interessant, vi observeret, at celle morfologi og cytoskeletal struktur blev ændret af stabil opregulering og nedregulering CEACAM6 i GC celler. CEACAM6-overudtrykkende celler var mere mesenchymale-lignende og udviste en spindel og tenformet form, og flere actin stress fibre blev detekteret i forhold til kontrolgrupperne, i en proces defineret som EMT. Den mesenkymale fænotype forlener celler med flere vandrende og invasive egenskaber [15]. Denne observation var i overensstemmelse med den

i

vivo

resultater hvorved CEACAM6 inducerede omfattende peritoneal breder sig i nøgne mus. MET blev observeret følgende lyddæmpning af CEACAM6 i GC celler. Disse observationer viste, at CEACAM6 kan være involveret i at fremkalde EMT i GC. Vi undersøgte dernæst sammenhængen mellem CEACAM6 og E-cadherin, en markør for EMT, i GC væv ved immunhistokemisk farvning. Som forventet blev der observeret signifikant negativ korrelation mellem CEACAM6 og E-cadherin, og E-cadherin ekspression var forbundet med dybden af ​​tumorinvasion, lymfeknudemetastase og TNM fase i GC væv. Derudover CEACAM6 forfremmet lymfeknude metastaser (

P

= 0,001) i 98 GC væv i vores tidligere undersøgelse [12]. Tidligere resultater viste, at CEACAM6 dæmpning øget E-cadherin promotoraktivitet i colorektal cancer [20]. Baseret på de ovennævnte resultater, vi postulerede, at CEACAM6 fremmet GC invasion og metastase ved at inducere EMT og kan tjene som en mesenchymal markør.

Metastase er den førende årsag til cancer-associeret død, men har været vanskeligt at studere, fordi det indebærer en række sjældne, stokastiske hændelser. En række potentielle signalveje relevante for cancermetastase er blevet illustreret, herunder PI3K /AKT, MAPK /ERK, FAK-SRC, JAK /STAT, NF-kβ, og MMP’er pathways [25] – [27]. I denne undersøgelse overekspression af CEACAM6 forhøjede MMP-9-aktivitet og anti-MMP-9-antistof kunne vende den stigende invasive og migrerende egenskaber induceret af CEACAM6. EMT indvielse er signifikant korreleret med kræft metastase, og inducerer stamceller egenskaber, forhindrer apoptose og ældning, og bidrager til immunosuppression i kræft progression [15]. EMT kan induceres ved aktivering af PI3K /AKT signalvej [28], [29]. CEACAM6 fungerer som en intercellulære adhæsionsmolekyle og kan danne større lipidklumper ved at interagere med sig selv eller andre CEACAMs og dermed aktivere de nedstrøms signalering kaskader, såsom integrin og PI3K /AKT veje [10], [30]. Derfor undersøgte vi effekten af ​​CEACAM6 overekspression på niveauerne af AKT-phosphorylering i GC celler. Phosphorylerede AKT niveauer blev forøget i CEACAM6-overudtrykkende celler, i overensstemmelse med tidligere opnåede resultater som i bugspytkirtelcarcinomer [8], [11]. Ifølge disse betragtninger foreslår vi en hypotese, hvor CEACAM6-induceret EMT sker gennem aktivering af PI3K /AKT signaleringskaskade i GC. Desuden CEACAM6-overekspression celler behandlet med LY294002, en PI3K-inhibitor, undergik en tilbageførsel af EMT via MET. , Konkluderer således vi, at CEACAM6 inducerer EMT ved at aktivere PI3K /AKT signalvejen i GC og kan tjene som et potentielt mål i tumor behandling.

Som konklusion har vi illustreret, at CEACAM6 fungerer som et onkogen ved at fremme EMT via PI3K /AKT aktivering i GC. Endvidere er E-cadherin markant nedreguleret i GC væv end parrede hosliggende ikke-tumor-væv. CEACAM6 fremmer invasion og metastase

i

vitro

i

vivo

, og kan være en potentiel ny diagnostisk og prognostisk markør og nye mål for GC terapi.

Støtte oplysninger

Tjekliste S1.

ANKOMMER retningslinjer. Alle in vivo forsøg i vores manuskript blev eksporteret i overensstemmelse med de ANKOMMER retningslinjer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0112908.s001

(DOC)

Tak

Vi vil gerne takke Xuehua Chen og Jianian Zhang til teknisk bistand, til Beiqin Yu for hendes materiel støtte.