PLoS ONE: Nanoceria: En sjælden-Earth Nanopartikel som Novel antiangiogen terapeutisk middel i æggestokkene Cancer

Abstrakt

Kræft i æggestokkene (OvCa) er den femte mest almindelige dødsårsag fra alle kræfttilfælde blandt kvinder i bl.a USA og den førende dødsårsag fra gynækologiske maligniteter. Mens de fleste OvCa patienter oprindeligt reagere på kirurgisk debulking og kemoterapi, 75% af patienterne senere bukke under for sygdommen. Således er der et presserende behov for at afprøve nye terapeutiske midler til at modvirke den høje dødelighed i forbindelse med OvCa. I denne sammenhæng har vi udviklet og manipuleret Nanoceria (NCE), nanopartikler af ceriumoxid, der besidder anti-oxidant egenskaber, der skal anvendes som et terapeutisk middel i OvCa. Vi viser for første gang, at NCE signifikant inhiberede produktion af reaktive oxygenarter (ROS) i A2780-celler, svækkede vækstfaktor (SDF1, HB-EGF, VEGF

165 og HGF) medieret cellemigration og invasion af SKOV3-celler, uden påvirker celleproliferation. NCE behandling også hæmmet VEGF

165 induceret proliferation, kapillarrør dannelse, aktivering af VEGFR2 og MMP2 i humane umbilical vaskulære endotelceller (HUVEC). NCE (0,1 mg /kg krop vejer) behandling af A2780 ovariecancerceller injiceret intraperitonealt i nøgne mus viste signifikant reduktion (p 0,002) i tumorvækst ledsaget af nedsat tumorcelleproliferation som det fremgår af reduceret tumorstørrelse og Ki67-farvning. Akkumulering af NCE blev fundet i tumorer isoleret fra behandlede gruppe under anvendelse af transmissionselektronmikroskopi (TEM) og induktivt koblet plasma-massespektroskopi (ICP-MS). Reduktion af tumormassen var ledsaget af dæmpning af angiogenese, som iagttages ved reduceret CD31-farvning og specifik apoptose af vaskulære endotelceller. Tilsammen indikerer disse resultater, at ceriumoxid baseret NCE er en hidtil ukendt nanopartikel, som potentielt kan anvendes som et anti-angiogent terapeutisk middel i ovariecancer

Henvisning:. Giri S, Karakoti A, Graham RP, Maguire JL, Reilly CM, Seal S, et al. (2013) Nanoceria: En sjælden-Earth Nanopartikel som Novel antiangiogen terapeutisk middel i kræft i æggestokkene. PLoS ONE 8 (1): e54578. doi: 10,1371 /journal.pone.0054578

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Juli 6, 2011; Accepteret: December 13, 2012; Udgivet: 31 januar 2013

Copyright: © 2013 Giri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse hovedsageligt understøttet af CA123249 og støtte fra Mayo Clinic College of Medicine til VS og delvis støttet af Marsh Rivkin tilskud til SG og RR. Dette arbejde blev delvist støttet af NSF cbet, 0708172 og 0930170 til SS (for nanopartikel udvikling i biomedicinske anvendelser). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i USA, er 27.000 kvinder nyligt diagnosticeret og ca 14, 000 kvinder dør af OvCa årligt [1]. Sådanne høje dødelighed skyldes størstedelen af ​​patienterne (75%) præsentation med fremskreden (stadium III eller højere) sygdom på diagnosetidspunktet [2]. Mere end 90% af patienterne har bedre prognose, hvis der registreres kræften i dets tidligste stadier. Behandling af epitelial ovariecancer generelt indebærer kirurgisk debulking efterfulgt af kemoterapi med en kombination af platin og et taxan-holdigt middel. Men størstedelen af ​​patienterne vender tilbage og i sidste ende bukke under for deres kræftsygdom. Der er derfor et presserende behov for at udvikle nye lægemidler, der kan være mere effektive til behandling af kræft i æggestokkene og forsinke eller forhindre gentagelser. Nye behandlingsformer, der er målrettet æggestokkene tumorigenese er flittigt blevet undersøgt, men vi har endnu til at komme med en lovende lægemiddel.

Nanoteknologi baserede værktøjer og teknikker er hurtigt voksende inden for medicinsk billedbehandling og målrettet drug delivery. Ceriumoxid er et sjældne jordarters oxider, der findes i lanthanidserien i det periodiske system. Nanokrystallinske cerium oxid (nanoceria) udviser en blå skift i det ultraviolette absorptionsspektrum, flytning og udvidelse af Raman tilladt modes og gitter ekspansion i forhold til bulk cerium oxid angiver dens unikke egenskaber. NCE har vist sig som en lukrativ materiale i biomedicinsk videnskab grund af sin unikke evne til at skifte oxidationstrin mellem (III) og (IV) alt efter miljøet. Evnen til at skifte mellem blandede oxidationstrin af nanoceria er sammenlignelig med biologiske antioxidanter. Dette bibringer nanoceria med en meget vigtig biologisk egenskab af radikaler, som kan indstilles baseret på tilbageholdelse af oxygenvakancer (defekter) og koncentration af Ce3 + arter i nanoceria. Reversibiliteten af ​​oxidationstrin er nøglen egenskab i fremstilling nanoceria en potent antioxidant, hvorved behovet for hyppige gentagne dosering. Tidligere undersøgelser har vist, at cerium oxide nanopartikler har gode antioxidant egenskaber og virker som potente, regenerative frie radikaler i biologiske systemer [3], [4], [5]. Disse regenerative antioxidant egenskaber skyldes til dels til valens struktur af cerium atom kombineret med iboende defekter i krystalgitteret struktur, der er forstørret på nanoskala. Det er blevet foreslået, at den unikke struktur af industrielt cerium oxide nanopartikler, med hensyn til valence og ilt defekter, fremmer celle levetid og reducerer giftige fornærmelser i kraft af sin antioxidant effekter, som opstår, når nanopartiklerne ind i cellerne [6], forebyggelse af ophobning af reaktive oxygenarter (ROS) i cellen [3].

tumorangiogenese er karakteriseret ved dannelsen af ​​nye uregelmæssig blodkar fra et allerede eksisterende vaskulære netværk. Denne unormale angiogenese er nødvendig for vækst, overlevelse og metastase af de fleste faste tumorer [7], [8]. Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) er en af ​​de vigtigste pro-angiogene faktorer, der virker som et mitogen for vaskulære endotelceller

in vitro

og som en angiogen faktor

in vivo

[9 ]. Den er overudtrykt i forskellige menneskelige kræftformer [10], [11], [12], [13], herunder OvCa. For nylig er det blevet foreslået, at ROS spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​tumor-induceret angiogenese ved at kontrollere VEGF-produktion. Forøget produktion af VEGF er blevet vist at korrelere med et dårligt resultat for patienter med både tidlig og fremskreden OvCa. Forskellige antiangiogene midler har været og er under evalueringer i kræft i æggestokkene kliniske forsøg. Et fase II studie med monoterapi bevacizumab (et monoklonalt antistof rettet mod VEGF) viste lovende resultater [14]. Derfor er VEGF signalering ved at blive fokus for antiangiogen målrettet terapi i OvCa.

I den foreliggende undersøgelse, har vi testet cerium oxid nanopartikler som et terapeutisk middel både

i

vitro

in vivo

i OvCa celler. Vores data viser, at NCE kunne inhibere vækstfaktormedieret, migration og invasion af SKOV3-celler, VEGF

165 induceret proliferation, kapillarrør dannelse og aktivering af VEGFR2 og MMP2 i HUVEC-celler. Vigtigere NCE behandling hæmmede tumorvækst

in vivo

ved at hæmme angiogenese, specielt ved at målrette vaskulære endotelceller.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

trypan Blå, MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid) og HB-EGF var fra Sigma. SDF1, VEGF

165 og HGF blev indkøbt fra R E sektioner blev undersøgt under lysmikroskop og repræsentative piktogrammer blev taget fra 5 forskellige lysbilleder af hver gruppe. For CD31-farvning, blev TRITC-mærket sekundært antistof, der anvendes og visualiseres under anvendelse af fluorescerende mikroskop. For dobbelt farvning blev objektglassene først forarbejdes til CD31-farvning efterfulgt af immunfluorescens TUNEL-farvning, ifølge producentens instruktioner.

Levende tumormålinger.

Maksimal diameter på levedygtig tumor blev beregnet ved RPG som summen den største uni-dimensional diameter af hver fragment af tumor under anvendelse af Olympus BX-41-mikroskop og et mikrometer. Ligeledes blev nekrotiske områder målt og den sammensatte levende tumorstørrelse blev beregnet ud fra hvert dias.

Endothelial rør formation.

For at undersøge effekten af ​​IOU på rør dannelse i HUVEC celler, matrigel matrix var ensartet udpladet på 8-brønds kammerobjektglas (0,15 ml) og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. HUVEC-celler blev talt og fortyndet til 2 × 10

5 /ml i medium. Celler blev behandlet med NCE (25-50 uM) blev blandet med celler i nærvær eller fravær af VEGF

165 (25 ng /ml) og overført til hver brønd (200 pi) overtrukket med matrigel. Pladerne eller Objektglassene blev inkuberet ved 37 ° C i 16 timer og afbildet under en fasekontrast omvendt mikroskop ved 10 × objektiv forstørrelse.

Statistisk analyse.

Data blev analyseret statistisk under anvendelse af to- tailed t-test (Prism). *** P 0,001; ** P 0,01, * P 0,05; NS:. Ikke signifikant sammenlignet med ubehandlet

Resultater

Syntese og karakterisering af Cerium Oxide Nanopartikler

ceriumoxid nanopartikler, der anvendes i denne undersøgelse indeholder individuelle krystallitter på 3-5 nm, som er løst agglomereret til 15-25 nm. Som syntesen processen er fri for enhver organisk overfladeaktivt middel, er det hårde agglomerering af nanopartikler styret gennem en streng pH nanopartiklerne under 3,5 under syntese for at holde dem i kolloid interval. Nanopartikler kan fortyndes i vandige eller cellulære medier efter syntesen. Figur 1 A og B viser høj opløsning transmission elektronmikrofotografier (HRTEM) af IOU nanopartikler. Det fremgår af det billede, nanopartikler løst agglomereres til ca. 15-25 nm aggregater, som også kunne fremkaldes ved tørringsprocessen. Den hydrodynamiske radius (37,8 nm ± 0,8) fra den multimodale størrelsesfordeling (volumen%) analyse af DLS målinger enig med den løse agglomerat størrelse HRTEM analyse. Høj forstørrelse billede bekræfter gitter fly af IOU i de enkelte 3-5 nm krystallitter. UV-Visible spektroskopi blev anvendt til at analysere oxidationstrin ceriumoxid nanopartikler før og efter ældning behandling. Figur 1 viser UV-Visible spektre fra friske og alderen cerium oxid nanopartikler klart angiver overvægten af ​​Ce

3 oxidationstrin fra absorption toppe på 252 nm i forhold til absorption toppe på 298 nm for Ce

4+ . Yderligere bekræftelse på oxidationstrin af nanopartikler blev opnået fra XPS-analyse. XPS-spektret af cerium er meget kompleks, som indeholder flere toppe fra spin orbit kobling af 3d orbitaler [26]. Adskillige toppe i Ce3d region, der er blevet tilskrevet 3d

3/2 (899,5, 900,9, 903,5, 906,4 og 916,6) og 3d

5/2 (880,2, 882,1, 8885, 888,1 og 898) som følge af multiple valenstilstande af cerium. Spektret fra NCE viser en overvægt af cerium i tre oxidationstrin som afbildet af de karakteristiske toppe på 880,2, 885,0, 899,5 og 903,5 eV. Tilsammen data fra karakterisering af IOU er i overensstemmelse med tidligere rapporter, hvori cerium kan bevares i trivalent oxidation ved at mindske størrelsen af ​​nanopartiklerne [15], [16], [17], [26].

høj opløsning transmission elektronmikrofotografier viser tilstedeværelsen af ​​en løs agglomerater af 15-20 nm ved lav forstørrelse B individuelle 3-5 nm krystallitter. D afstand på 0,31 nm viser tilstedeværelse af planer af ceriumoxid mens det valgte område elektron diffraktion (Sæd) mønster bekræfter tilstedeværelsen af ​​fluorit gitter af ceriumoxid. Tendensen i oxidationstilstand nanoceria i C viser, at de syntetiserede nanopartikler har overvægt af trivalent oxidationstilstand som undergår en langsom omdannelse til Ce

3 oxidationstrin over en periode på 28 dage D x-ray photoelectron spectrum fra en reference ceria prøve, i hvilken cerium er overvejende +4 oxidationstrin sammenlignes med spektret fra en 4 uger alderen prøve af nanoceria demonstrerer den høje koncentration af Ce i +3 oxidationstrin. E. basale niveauer af ROS i æggestokkræft cellelinje. A2780 celler blev behandlet med NCE (50-100 uM) i 48 timer. Celler blev vasket med PBS og fyldt med DCF-DA farvestof (5 uM) og fluorescens blev registreret ved excitation 485 nm og emission 530 nm for forskellige tidsperioder (5-60 min). Brønde indeholdende kun celler uden DCFDA farvestof (cross) eller uden celler indeholdende DCFDA farvestof (fyldt diamant) blev anvendt som et råemne. F. Søjlediagram repræsenterer ROS niveauer på 60 min af behandling med DCF-DA farvestof. Resultaterne er vist som middelværdi ± S.D. af 4 prøver. *** P 0,001 IOU ved 100 uM; * P. 0,05 IOU i forhold til ubehandlede celler ved hjælp af to-tailed t-test (Prism)

NCE Behandling inhiberer Produktion af ROS Niveauer i A2780 cellelinje

Cerium oxid nanopartikler har vist sig at virke som fri-radikal-scavengers ved at hæmme produktionen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) [3], [4], [5]. Da er det veletableret, at ROS akkumulering spiller en vigtig rolle i initieringen og progressionen af ​​tumorigenese i human ovariecancer [27], [28], [29], undersøgte vi virkningen af ​​NCE på ROS-generering i æggestokkene cancercellelinie A2780. A2780 cellelinje blev behandlet med NCE (50-100 uM) og post 48 h behandling blev ROS-generering målt under anvendelse DCFH2-DA farvestof efterfulgt af fluorescens læsning. Som vist i figur 1E-F, NCE behandling inhiberede signifikant ROS-niveauer i A2780 cellelinje, hvilket antyder, at NCE behandling inhiberer basale niveauer af oxidativt stress i A2780 OvCa cellelinje.

NCE påvirkede ikke celleproliferation i æggestokkene cellelinier

for at afgøre, om IOU behandling hæmmede celleproliferation, blev A2780, C200 og SKOV3 forgyldt med 96 brønde ved 4 × 10

3 celler /brønd og behandlet med forskellige koncentrationer af IOU (25-200 uM). Cellelevedygtighed blev bestemt ved 72 timer efter MTT-assay. Som vist i figur 2A, NCE behandling havde ingen signifikant virkning på proliferation eller overlevelse af æggestokkene cancercellelinier. I overensstemmelse med denne observation, vores klonogene assays viste også ingen ændring i spredning sats med stigende IOU koncentration (Fig. 2B). [3H] thymidin optagelse i A2780, C200 og SKOV3 celler (Fig. S1), bekræftede også, at NCE behandling ikke ændrede hastigheden af ​​spredning. Lignende resultater blev opnået i yderligere ovariekræft cellelinjer, herunder CaOV3 og TOV21G (data ikke vist). Tilsammen indikerer disse resultater, at NCE behandling ikke signifikant inhiberer væksten af ​​ovariecancerceller linjer

in vitro

.

A. Procent levedygtighed A2780, C200 og SKOV3-celler behandlet med angivne doser af NCE (25-200 uM) som bestemt ved MTT-assayet. Dataene er repræsenterer tre individuelle forsøg gennemført in triplo. NS: ikke signifikant, sammenlignet med ubehandlede celler ved respektive tidspunkt ved hjælp af to-halet t-test (Prism). B. For kolonidannelse, 2000 celler /brønd (A2780, C200 og SKOV3) blev udpladet i 6-brønds plader og behandlet med angivne koncentrationer af nce, hver tredje dag i 2 uger, indtil kolonier blev dannet. Kolonierne blev farvet med MTT og talt. Dataene repræsenterer tre separate forsøg gennemført in triplo. NS:. Ikke signifikant sammenlignet med ubehandlede celler ved hjælp af to-tailed t-test (Prism)

NCE Hæmmet vækstfaktor-medieret Cell Migration og Invasion

in vitro

Da havde NCE behandling ikke påvirke celleproliferation, vi evaluerede effekten af ​​IOU på vækstfaktor medieret celle migration og invasion. SKOV3 celler dyrket natten over i lavt serum (0,2%) indeholdende medium blev ridset under anvendelse af en steril 200 gl pipettespids, når de nåede 90% konfluens. Forskellige vækstfaktorer, herunder SDF1, HB-EGF, VEGF

165 og HGF (25 ng /ml) blev tilsat individuelt til medium i nærvær eller fravær af NCE (100 uM). 24 timer senere blev hastigheden af ​​sårlukning beregnet. Som vist i figur 3A, NCE inhiberede alle vækstfaktormedieret cellemigration i SKOV3 cellelinie. Lignende resultater blev opnået for A2780 og C200-cellelinjer (data ikke vist). Næste vurderede vi virkningen af ​​NCE inhibering GF-medieret invasion af SKOV3-celler under anvendelse Boyden kammer migration assay (BD Bioscience) som tidligere beskrevet [18]. Figur 3B viser klart, at 100 pM NCE behandling signifikant hæmmet al vækst faktor induceret invasion af SKOV3-celler sammenlignet med ubehandlede celler. Disse resultater indikerer, at NCE har evnen til at inhibere migration og invasion af ovariecancerceller uden at påvirke celleproliferation.

A. Virkning af NCE på forskellige vækstfaktorer medieret cellemigrering blev undersøgt under anvendelse sårlukning assay som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Resultaterne er vist som middelværdi ± S.D. af n = 7. B. For at undersøge effekten af ​​nce om invasion, 1 × 10

5 SKOV3 celler blev podet ind i de øverste brønde med 100 uM nce i FIA kammer i 500 pi dyrkningsmedium. Forskellige vækstfaktorer (EGF, VEGF

165 og SDF1) (25 ng /ml) blev tilsat til de underliggende medier. 24 timer senere, invasion blev bestemt følgende producentens anvisninger. Resultaterne er vist som middelværdi ± S.D. af triplikater. *** P 0,001 vækstfaktor behandlet sammenlignet med kontrol. $$$ P 0,001 IOU behandlet i forhold til vækst faktor ved hjælp af to-tailed t-test (Prism)

NCE Behandling Svækket tumorvækst i Human A2780 æggestokkene karcinom cellelinje Bearing Nude Mouse Model

for at bestemme virkningen af ​​NCE

in vivo

, nøgne mus blev intraperitonealt injiceret med A2780-celler. Mus blev behandlet med NCE (0,1 mg /kg legemsvægt) givet intraperitonealt hver tredje dag indtil slutningen af ​​undersøgelsen (dag 30) som beskrevet i materialer og metoder. Figur 4A (øverste panel) viser et repræsentativt fotografi af en NCE behandlet og ubehandlet mus bærende A2780 xenotransplantat i slutningen af ​​studiet (dag 30). Den abdominale omkreds, indikerer tumorbelastning i bughinden (. Fig 4B), og tumoren vægt (. Figur 4C) i NCE behandlede mus var signifikant (p 0,002) reducerede sammenlignet med ubehandlede mus. Gennemsnitsvægten af ​​de udskårne tumorer var ca. 33% mindre i NCE (4,56 + 0,345 g) behandlede mus sammenlignet med bærer (PBS) mus (6,79 + 0,53 g) (fig. 4C). Disse data viser tydeligt, at IOU har evnen til at begrænse æggestokkene tumorvækst

in vivo

når det administreres selv ved en meget lav dosis (0,1 mg /kg).

A. Gross morfologi af repræsentative mus med tumorer på dag 30 (n = 6). B. Kumulativ abdominal omkreds ved enden af ​​studiet. C. udskåret tumorvægt fra køretøjet (PBS) behandles og NCE (0,1 mg /kg bd wt; hver tredje dag). Resultaterne er vist som middelværdi ± S.D. af seks individuelle dyr. Som vist i fig. Som vist i fig.