PLoS ONE: Ingen Påvisning af XMRV i blodprøver og vævssnit fra prostatacancerpatienter i Nordeuropa

Abstrakt

Baggrund

Vi har for nylig offentliggjort de sjældne påvisning af xenotropisk murine leukæmi virus-relaterede virus (XMRV) (1/105) i prostatakræft (PCA) væv af patienter i det nordlige Europa ved PCR. Den kontroversielle diskussion om virus detekteres i PCA væv, blodprøver fra patienter, der lider af kronisk træthedssyndrom (CFS), samt fra et betydeligt antal raske kontrolpersoner fået os til at uddybe vores studier om påvisning af XMRV infektion anvende forskellige metoder til påvisning (PCR, samdyrkning og immunhistokemi [IHC]).

Metode /vigtigste resultater

Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) fra 92 PCA og 7 raske kontroller blev isoleret, PHA aktiveret og samdyrket med LNCaP celler i op til 8 uger. Supernatant af disse celler blev påført en reporter cellelinie, DERSE-iGFP. Desuden blev PBMC’er og samdyrket LNCaP-celler testet for tilstedeværelsen af ​​XMRV ved PCR samt Western blot-analyse. Mens alle PCR-amplifikationer og Western blot-analyser var negative for tegn på XMRV infektion, DERSE-iGFP celler udviste isoleret GFP-positive celler i tre tilfælde. I alle tre tilfælde XMRV tilstedeværelse ikke kunne bekræftes ved PCR-teknologi. Desuden har vi udført XMRV specifik IHC på PCA vævssnit. Hele vævssnit (n = 20), samt væv microarrays (TMA), herunder 50 benign prostatahyperplasi (BPH), 50 lav kvalitet og 50 høj kvalitet PCA sektioner og TMAs herunder brystcancer, coloncancer og normalt væv blev farvet med to XMRV antisera. XMRV proteinekspression blev ikke påvist i nogen kræft sektioner inkluderet. Én BPH væv viste XMRV specifikt protein udtryk i tilfældige isolerede basale celler.

Konklusion

Vi kunne ikke endegyldigt opdage XMRV i blodet fra PCA patienter eller fra raske kontrolpersoner, og der er ingen afgørende beviser af XMRV proteinekspression i PCA, brystkræft og tyktarmskræft vævssnit testet af IHC farvning

Henvisning:. Stieler K, Schindler S, Schlomm T, Hohn O, Bannert N, Simon R, et al. (2011) Nr Påvisning af XMRV i blodprøver og vævssnit fra prostatacancerpatienter i Nordeuropa. PLoS ONE 6 (10): e25592. doi: 10,1371 /journal.pone.0025592

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Juni 7, 2011; Accepteret: September 6, 2011; Udgivet: 12 oktober 2011

Copyright: © 2011 Stieler et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i øjeblikket påvisning af xenotropisk muse leukæmi virus relaterede retrovirus (XMRV) i humane bio prøver er kontroversielt diskuteret lige fra XMRV at blive associeret med to store humane sygdomme, kronisk træthedssyndrom (CFS) [1], [2] og prostatakræft (PCA) [3], [4] for at være en mænd genereret laboratorium forurenende grund xenograft passage gennem mus [5] – [18]

i 2006 er XMRV blevet identificeret i prostata væv fra patienter med velkendte prostatacancer (PCA) bærer en homozygot mutation i. RNaseL genet (R462Q) [19]. Sammenhængen mellem XMRV og PCA blev alvorligt styrket af undersøgelser, der viser XMRV proteinekspression samt tilstedeværelsen af ​​XMRV sekvenser i op til 26% af alle PCA tilfælde [3], [4], [20]. XMRV proteinekspression blev overvejende ses i ondartet epitel antyder en mere direkte rolle i tumorigenese. Der er imidlertid flere undersøgelser kun sjældent eller fuldstændigt ikke at opdage XMRV i prostatakræft prøver under anvendelse af PCR eller IHC metoder [3], [4], [9], [21] – [26]. Vi har for nylig opdaget XMRV ved lav frekvens (1%) i sporadiske PCA prøver fra Nordeuropa under anvendelse af PCR amplifikationsmetoder og RNA isoleret fra friske frosne vævsprøver [27]. Ekspression af XMRV protein samt tilstedeværelsen af ​​XMRV sekvenser i op til 26% af alle analyserede PCA prøver blev demonstreret i 2009 ved at anvende immunohistokemi (IHC) af hele mount PCA sektioner med et anti-XMRV specifikt antiserum [4], [20 ]. Men en nylig rapport hjælp Rauscher MLV gag antisera, der også genkender XMRV gag protein, ikke bekræfte disse resultater [24]. Undersøgelsen fra Schlaberg et al. fik os til at gense forekomsten af ​​XMRV i PCA prøver ved IHC siden fokale infektioner set af IHC kunne blive savnet i PCR-analyse. Derudover vurderer vi tilstedeværelsen af ​​XMRV protein ekspression i sektioner af andre maligniteter samt normale væv ved IHC. Ved at bruge den nyligt offentliggjorte anti-XMRV antiserum [4] samt en XMRV gag specifikt antiserum var vi ude af stand til at opdage XMRV gag specifik farvning af celler i PCA eller andet kræft væv. Men en godartet prostatahyperplasi (BPH) sektion vises tydeligt positive farvede celler ved hjælp af anti-XMRV gag K121 serum.

I 2009 XMRV blev identificeret i op til 68% af PBMC (mononukleære perifert blod celler) prøver fra patienter med kronisk træthedssyndrom og 3-4% af kontrollen kohorte viste tegn på XMRV infektion [2]. PCR-data blev styrket ved celle afhængige samt celle fri overførsel af virus fra blodprøver fra CFS patienter til indikator celler. Men flere efterfølgende undersøgelser foretaget af andre laboratorier undladt at bekræfte PCR-data og ingen virus transmission eksperimenter er blevet reproduceret til dato [6], [9], [10], [11], [13], [15], [17 ], [18], [28], [29], [30], [31]. For nylig blev blodprøver fra CFS patienter, der tidligere er rapporteret at indeholde XMRV sekvenser testes igen, men blev identificeret som XMRV negative ved PCR-amplifikation strategier og serologiske metoder [12], [32].

Tidligere i år, mens denne undersøgelse var i gang, flere publikationer rettet risikoen for forurening af spor af muse-DNA (paraffinsnit, cellelinjer eller andre kilder) [7], [13], [15], og risikoen for falske positive PCR-produkter fra nogle kommercielle forstærkning kits [17], [33]. Desuden farvetone og kolleger hævder, at på grund af manglende sekvensvariabilitet af XMRV genfragmenter i patienten isolater sammenlignet med sekvensvariabilitet identificeret i en XMRV positiv cellelinie 22Rv1, kan XMRV være et laboratorium kontaminant snarere end en sand exogent humant virus [11 ]. En stærk indikation af, at XMRV er en virus, der cirkulerer i den humane population er identifikationen af ​​virale integrationssteder i værtsgenomet [34]. Men nyere resultater viser, at to integration sites tidligere offentliggjorte er identiske med XMRV integration sites i en in vitro inficeret cellelinie DU145 [35]. Endvidere Paprotka og kolleger dokumenterer, at XMRV afledt fra to mus endogene pre-vira, der undergik retroviral rekombination i cellekultur hvilket antyder, at alle XMRV sekvenser rapporteret til dato har hidrører sandsynligvis fra denne cellekultur begivenhed [14]. I det præsenterede undersøgelse rettet vi påvisning af XMRV og relaterede MLV sekvenser i perifere blodceller af patienter med prostatacancer og raske kontrolpersoner motiveret af påvisning af XMRV i blodceller på 3-4% af raske kontrolpersoner [2], og vores hypotese, at XMRV replikation kan aktiveres som følge af immunsuppression, der ledsager PCA og efterfølgende detekteres i blodet hos patienter. I alt 100 blodprøver blev inkluderet i vores undersøgelse. PBMC’er blev isoleret, stimuleret og derefter anvendes til genomisk DNA isolation eller samdyrkning eksperimenter efter offentliggjorte protokoller [1], [2]. Desuden blev proteinekstrakter fra aktiverede PBMC’er genereret og analyseret for XMRV proteinekspression. Vi viser, at PBMC’er generelt kan være in vitro inficeret med XMRV, hvilket resulterer i 1-2% inficerede celler, som let kan overvåges ved PCR eller proteinekspression analyser derved bekræftede nyligt offentliggjorte resultater [10]. Selvom virale genomer er stærkt redigeret grundet Apobec restriktion, supernatanten fra XMRV inficerede PBMC’er effektivt inficerer en reporter cellelinie, DERSE-iGFP. Denne cellelinie (genereret af Vineet N. KewalRamani, National Cancer Institute, Frederick, USA) udtrykker et GFP reporter, som aktiveres ved revers transkriptase-ekspression. Selv følsomheden af ​​alle teknikker, der anvendes i vores studie er temmelig høj, blev der ikke XMRV sekvenser eller XMRV specifik proteinekspression påvist i aktiverede PBMC’er. Interessant, vi påvist i supernatanten fra 3/67 aktiverede PBMC’er og 2/67 samdyrkning eksperimenter af PBMC’er med LNCaP celler, RT-aktivitet resulterer i GFP-positive DERSE-iGFP celler, men vi var i stand til utvetydigt bevis på, at disse PBMC’er er blevet smittet med XMRV, kan andre kilder til RT-aktivitet ikke udelukkes.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i delstaten Hamburg (ingen . OB-052-04).

Undersøgelse befolkning og prøvetagning. Undersøgelse befolkning og prøvetagning

Blodprøver fra 92 prostata cancer patienter (alder 44-77) blev indsamlet en dag før radikal prostatektomi. Kliniske data er sammenfattet i tabel 1. Desuden blev blodprøver fra 7 mænd (alder 30-44) uden tegn på PCA inkluderet i undersøgelsen. Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke til videnskabelig brug af blodprøver; EDTA-blod fra patienter og raske kontroller blev forarbejdet ved densitetsgradientcentrifugering under anvendelse af Ficoll (Biocoll, Biochrom L6715). Primære mononukleære blodceller (PBMC’er) blev separeret, og dyrket som beskrevet nedenfor.

Cellelinjer

human prostatacancer LNCaP (ATCC # CRL-1740), LNCaP DERSE- iGFP (venligst tilvejebragt af Vineet N. KewalRamani, National cancer Institute, Frederick, USA) og XMRV positive human prostatacancer-cellelinie 22Rv1 (ATCC # CRL-2505) blev dyrket i RPMI 1640 (Gibco) suppleret med 10% FCS, 5 % Penicillin /streptomycin og L-glutamin. Kronisk inficerede LNCaP-celler (XMRV) blev dannet ved transfektion af proviralt XMRV VP62 DNA som tidligere [36] offentliggøres og opretholdes i flere uger. PBMC blev isoleret fra 10 ml EDTA-blod og dyrket i RPMI 1640 (Gibco) ligner etablerede prostata cancercellelinier men derudover suppleret med PHA (5 pg /ml, Thermo Fisher Scientific) og rhIL-2 (180 IU /ml, R inde primer: NP116F 5′-CATGGGACAGACCGTAACTACC-3’and NP117R 5′-GCAGATCGGGACGGAGGTTG-3 ‘. For at bestemme følsomheden af ​​Gag PCR oprindeligt udgivet af Urisman et al. de følgende primere blev anvendt: GAG AF 5’-CGCGTCTGATTTGTTTTGTT-3 ‘, GAG ELLER 5’CCGCCTCTTCTTCATTGTTC-3’, GAG IF 5’TCTCGAGATCATGGGACAGA-3 ‘og GAG IR 5′- AGAGGGTAAGGGCAGGGTAA [19]. Env PCR blev udført som for nylig offentliggjort [3] under anvendelse af de følgende primerpar F 5’-ACCAGACTAAGAACTTAGAACCTCG-3 ‘, R5′-AGCTGTTCAGTGATCACGGGATTAG-3′, IF 5’-GAACAGCATGGAAAGTCCAGCGTTC-3 ‘og IR 5′-CAGTGGATCGATACAGTCTTAGTCC-3’ . Integriteten af ​​DNA-prøverne og tilstedeværelsen af ​​formodede inhibiters blev kontrolleret ved amplifikation GAPDH, F 5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘og R 5′- GAAGATGG TGATGGGATTTC-3’.

Western Blot

Cellelysater blev dannet ved anvendelse RIPA puffer indeholdende 1% Triton-X 100 og proteasehæmmer mix (Roche). Specifikke proteinbånd blev påvist ved polyklonalt Env antistof Rauscher 77S85 (gave fra C. Stocking, Heinrich-Pette Institut, Hamburg, Tyskland), XMRV specifik kanin polyklonalt Gag antiserum K121 og p30-Gag genkende hybridomsupernatant fra CRL-1912-celler (ATCC) . Lige protein beløb pr bane blev sikret med anti-human actin antistof mAB 1501 (Chemicon) inkubation. Til påvisning af XMRV partikler i cellekultursupernatanter blev sterilfiltreret dyrkningsmedium af inficerede celler ultracentrifugeret 1 time, 110.000 x g ved 4 ° C (Beckman SW60Ti). Pillen af ​​11 ml supernatant blev resuspenderet i 10 pi PBS og analyseret ved immunoblotting.

cellelinje paraffinsnit og TMA’er

1 × 10

7 celler (LNCaP, LNCaP kronisk inficeret med XMRV , 293T, 293T kronisk inficeret med XMRV og mus SC1 celler) blev fikseret i 20 timer i 10% phosphatpufret formalin, indlejret i agar og bearbejdes til paraffinvoks [37].

En allerede eksisterende TMA indeholder prostata væv ( 50 PCA lav kvalitet, 50 høj kvalitet PCA og 50 godartet prostatahyperplasi (BPH)) blev anvendt til IHC.

Immunhistochemistry

Slides med paraffinsnit af prostatakræft patienter blev oprindeligt afparaffiniseret hjælp xylen. For antigen hentning Sektionerne blev opvarmet 4 × 2 min i en citratbuffer ved anvendelse af en mikrobølgeovn (650W) og derefter afkølet til stuetemperatur i 30 minutter. Blokering blev udført i 30 minutter ved stuetemperatur med 10% svineserum i antistof fortyndingspuffer (Dako). Bagefter endogen biotin blev blokeret af Avidin /Biotin Kit (Dako). Primært antistof (fortyndet i antistof fortyndingsbuffer med 2% svineserum, anti-XMRV 1:7500; XMRV anti-gag K121 1:5000) blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Kontroller blev enten overtrukket med den tilsvarende præ serum (samme fortynding) eller kun med antistof fortynding buffer med 2% svineserum. Inkubationen med det sekundære antistof – biotin /streptavidin mærket – blev udført i 30 minutter ved stuetemperatur. For en senere detektion af bundne antistoffer mærkede sektioner blev overtrukket med alkalisk phosphatase-opløsning (Dako, AK 5000) ifølge fabrikantens instruktioner. IHC-farvning opløsning indeholdende levamisol til inhibering endogen alkalisk phosphatase blev tilsat til objektglassene i 15-20 min, medens kontrastfarvning udførtes med Mayers Hamin løsninger. Anti-XMRV serum blev venligst stillet til rådighed af Ila Singh (University of Utah, USA).

Resultater

XMRV proteinekspression i PCA væv ved IHC metoder

I 2009 konstateringen af ​​23% af PCA sektioner positive for XMRV proteinekspression er blevet rapporteret [4]. XMRV proteinekspression som i de fleste tilfælde lokaliseret til tumoren epitel stærkt korreleret med højere Gleason kvaliteter. Interessant har proteinekspressionen data ikke korrelere med PCR-resultater. En formodet forklaring er få fokale inficerede XMRV celler i prostata, som næppe detekterbar ved PCR under anvendelse af DNA fra hele mount vævssnit som skabelon. Imidlertid blev disse resultater ikke bekræftet af en anden undersøgelse [24]. At bidrage til forklaring af de uoverensstemmelser, vi screenet hele PCA sektioner samt TMA’er bruger den nyligt offentliggjorte anti-XMRV serum [4] og en kanin polyklonalt anti-XMRV gag serum (gag K121).

Begge sera er blevet testet i Western Blot analyser med gag K121 serum specifikt genkender xenotropisk gag protein, mens der vises ingen krydsreaktivitet med eventuelle cellulære proteiner. I modsætning [4] anti-XMRV serum også anerkendt cellulære proteiner i ikke inficerede mennesker og mus cellelinjer (supplerende Figur S1). Vi genererede paraffinsnit repræsenterer humane cellelinjer 293T, LNCaP begge cellelinjer inficeret med XMRV og en mus cellelinie SC1. Begge antisera genkender XMRV protein udtrykkende celler i paraffinsnit viser granulær farvning af cytoplasmaet (figur 1). Ingen farvning af ikke-inficerede celler og ingen farvning af SC1 museceller blev detekteret. I alt 100 PCA (lav kvalitet og høj kvalitet PCA) og 50 BPH repræsenteret i en TMA samt 10 store dele af prostatacancer (med høj Gleason score) blev analyseret med gag K121 serum (Tabel 2). Derudover en TMA indeholdende bryst-, tyktarms- og prostatakræft samt flere normale væv blev testet for XMRV proteinekspression. Hver IHC-farvning blev kontrolleret ved herunder positive kontroller (paraffinsnit af cellelinier) og negative kontroller (uden tilsætning af første antistof) samt højere fortyndinger af det første antistof. Ingen farvning af cancer sektioner blev observeret samt hovedparten af ​​kontrol væv var negative for gag K121-farvning. Kun en del af BPH viste meget få tilfældige basale celler der farves positivt med anti-gag K121 serum (figur 2). Ingen af ​​TMA blev testet med anti-XMRV serum siden high baggrund skyldes generation procedure TMA er blevet observeret.

Paraffinsnit af cellelinie array med XMRV inficerede cellelinier samt ikke-inficerede cellelinjer blev farvet for XMRV proteinekspression under anvendelse af anti-XMRV serum (A) eller anti-gag K121 polyklonalt kaninserum (B). Større forstørrelser vises for XMRV inficerede celler såvel som for en vildtlevende mus cellelinie, SC1.

I 1/50 BPH blev tilfældige positive farvede celler observeret, som kan være basale celler baseret på deres lokalisering i prostata.

Aktiverede PBMC’er kan være inficeret med XMRV, men XMRV replikation er begrænset i PBMC’er.

efter hypotesen publiceret af Lombardi et al, at XMRV kan påvises i PBMC’er fra op til 67% af CFS patienter samt i op til 4% af raske kontroller [2] vi bestemt at aktivere PBMC’er fra PCA patienter og kontrolpatienter og skærm for XMRV infektion anvende forskellige metoder. Vi først etableret vores XMRV detektionsmetoder på PBMC’er som har været in vitro inficeret med viral supernatant indeholdende VP62 XMRV. Proviralt DNA blev anvendt til at fremstille XMRV infektiøse supernatanter i LNCaP-celler der i høj grad XMRV replikation på grund af stærk aktivering af LTR samt manglen på retroviral begrænsning faktorer Apobec 3G-ekspression [36], [38] – [41]. PHA aktiverede PBMC’er var in vitro inficeret med de angivne mængder af viral supernatant (figur 3), som blev dyrket i nærvær af IL2 i yderligere 7 d. Virusholdige supernatant blev derefter underkastet ultracentrifugering og virale pellets (figur 3A) samt cellelysat (figur 3B) fra de inficerede PBMC’er blev analyseret ved Western Blotting sikre ekspressionen af ​​XMRV specifikke proteiner. Baseret på Western blot eksperimenter under anvendelse af kronisk inficerede LNCaP-celler fortyndet med det angivne celleantal af uinficerede 293T-celler (figur S2) kan vi anslår, at ca. 1-2% af PBMC’er inficeret med XMRV. Kun hvis vi inficere PBMC’er med høje virustitere effektivt detekteret vi XMRV i det virale pellet efter ultracentrifugering og Western Blot-analyse (figur 3A). Genomisk DNA isoleret fra disse in vitro XMRV inficerede PBMC’er var positive for XMRV sekvenser ved PCR under anvendelse 650 ng genomisk DNA og to forskellige primersæt rettet mod gag- og env (figur 4A og figur S3). Følsomhed af alle PCR-reaktioner er angivet i supplerende Figur S4 med alle PCR påvisning 1-10 inficerede celler i en baggrund af 10

6-inficerede celler.

PBMC’er fra to forskellige donorer blev isoleret, samlet, PHA stimulerede og efterfølgende inficeret med de angivne mængder af XMRV indeholdende supernatant (bane 1-5). Western blot analyse af cellelysat fra inficerede PBMC’er blev udført 7 d tidligere infektion (B). Supernatant af de inficerede PBMC’er blev beriget med viruspartikler ved ultracentrifugering og farvet for CA-ekspression (A). (C) 500 pi XMRV supernatant stammede fra PBMC’er er vist i A og B blev anvendt til at inficere DERSE-iGFP celler, som blev analyseret for GFP-ekspression 7 d tidligere infektion ved FACS. Titere angives som GFP infektiøse enheder /ml. (D) Infektion af DERSE-iGFP celler 100fold øges ved samdyrkning af inficerede PBMC’er (vist i (A)) med LNCaP-celler i 7 dage, blev SN fra LNCaP-celler dernæst påført DERSE-iGFP celler, som blev analyseret ved FACS 5 d pi.

(B) DERSE-iGFP celler blev inficeret med 500 pi supernatant fra 22Rv1 celler, mock inficerede celler eller LNCaP celler dyrket sammen med XMRV inficerede PBMC’er til 14 d. 72 h forløbne infektion DERSE-iGFP celler blev overvåget for GFP-positive celler ved mikroskopi.

Samdyrkning af XMRV inficerede PBMC’er med LNCaP celler øger følsomheden af ​​XMRV afsløring.

DERSE-iGFP celler blev udsat for filtreret kultursupernatant fra XMRV inficerede PBMC’er. 500 pi supernatant blev tilsat til 5 x 10

4 DERSE-iGFP celler, som blev scoret for GFP-ekspression 7 d p.i. ved mikroskopi og FACS-analyse (figur 3C). Generelt viral supernatant fra PBMC’er er infektiøse, men påvistes kun meget få GFP-positive celler. Interessant, hvis vi cocultivate de XMRV inficerede PBMC’er med LNCaP celler til 5 d, høste supernatanten og reinfect DERSE-iGFP celler med filtreret supernatant, følsomhed XMRV påvisning ved DERSE-iGFP celler 100fold øget Figur 3D og figur 4B.

PBMCer fra PCA patienter er negative for XMRV detektion af PCR-analyse

Brug denne tilgang, vi isoleret PBMC fra 92 PCA patienter og 7 raske frivillige ved Ficoll gradient; isolerede PBMC’er blev PHA aktiveret og dyrket i nærværelse af IL-2 i 7 dage. PBMC’er blev underkastet forskellige assays som skitserer i figur 5A: genomisk DNA-isolering efterfulgt af XMRV specifik nested PCR anvender to offentliggjorte XMRV PCR-strategier [1], [3], [19]; samdyrkning af aktiverede PBMC’er med LNCaP-celler i 8 uger med efterfølgende infektion af DERSE-iGFP celler under anvendelse supernatant 6 uger og 8 uger efter samdyrkning. Lokalisering af de forskellige anvendte primersæt er vist i fig S3 og følsomhed af de forskellige XMRV PCR’er afspejles i figur S4. Integriteten af ​​det genomiske DNA sammen med fraværet af formodede PCR-inhibitorer blev sikret ved GAPDH-amplifikation (figur S4). Dyrkningen af ​​PBMC’er, DNA-præparater og PCR-amplifikation blev udført i laboratorier af Heinrich-Pette Institut, hvor ingen anden XMRV blev udført. Desuden alle nestede PCR’er detektere XMRV sekvenser under anvendelse af to forskellige primerpar rettet mod gag, både nyligt offentliggjorte blev samt et env PCR drives af to operatører, der anvender 650 ng genomisk DNA som template. Alle DNA-prøver viste sig at være konsekvent negative (tabel 3). PCR-reaktioner blev rutinemæssigt kontrolleret for kontamination mus under anvendelse af primere rettet mod retrotransposoner, intracisternal En partikel (IAP), som for nylig offentliggjort [15]. Ingen af ​​PCR-reaktioner var positive for muse-DNA-sekvenser (data ikke vist).

(a) metoder anvendes til screening for XMRV i PBMC’er af PCA patienter og raske kontroller. (B) DERSE-iGFP celler 72 timer p.i. med SN fra LNCaP celler samdyrket i 8 uger med patient afledte PBMC’er (øverste paneler). De nederste paneler viser DERSE-iGFP celler 72 timer p.i. med SN fra patient afledte PBMC’er der blev aktiveret med PHA til 7d.

67 PBMC prøver blev dyrket sammen med LNCaP celler i op til 8 uger og SN af LNCaP celler blev anvendt til reporteren cellelinie DERSE-iGFP. Denne cellelinie bærer en MLV vektor, hvilket fører til ekspression af et GFP reporter hvis revers transkriptase udtrykkes. 72 timer p.i. DERSE-iGFP celler blev overvåget for GFP-ekspression ved mikroskopi. Af 67 prøver supernatant fra PBMC’er samdyrket med LNCaP-celler, to resulterede i 2-3 GFP-positive celler i 5 × 10

4 celler (figur 5B). Vi observerede ikke en stigning i GFP-positive celler over tid indikerer, at der var ingen spredning af viral infektion. Interessant supernatanten af ​​de aktiverede PBMC’er fra disse to patienter uden co-dyrkning resulterede også i 1-2 GFP-positive DERSE-iGFP celler pr. I et tilfælde blev udført to uafhængige PBMC isoleringer fra den samme patient (# 99 og # 100), som begge resulterede i 1-2 GFP-positive DERSE-iGFP celler. Imidlertid blev begge isolationer udført på samme dag af samme driftsleder. PCR fra LNCaP celler dyrket sammen med PBMC’er disse to patienter resulterede ikke i påvisning af XMRV specifikke sekvenser såvel som vi var ude af stand til kultur og udvide GFP-positive DERSE-iGFP celler til efterfølgende analyser.

Diskussion

i denne undersøgelse har vi undersøgt påvisning af XMRV hos patienter med prostatacancer ved at studere forskellige diagnostiske bio prøver for tilstedeværelsen af ​​XMRV eller beslægtede MLV-sekvenser. Især vi analyserede PCA vævsprøver samt vævssnit fra andre maligniteter og normale væv for XMRV protein-ekspression ved IHC. Desuden blev PBMC’er fra 92 PCA og 7 raske kontroller screenes for tilstedeværelsen af ​​XMRV sekvenser og udvinding af infektiøs virus. PBMC’er blev PHA aktiveret, samdyrket i op til 8 uger og XMRV tilstedeværelse blev undersøgt ved enten nested PCR målretning to forskellige XMRV regioner, Western blot-analyser under anvendelse af forskellige anti-XMRV antistoffer eller infektion af DERSE-iGFP celler anvender supernatant fra aktiverede PBMC’er eller supernatant fra kan påvises LNCaP celler samdyrket med PBMC’er i op til 8 uger.

Vi var i stand til at endegyldigt viser, at XMRV sekvenser i aktiverede PBMCer fra PCA patienter, selv i to patienter GFP blev påvist positive DERSE-iGFP celler. I begge tilfælde efterfølgende PCR analyser af aktiverede PBMC’er samt dyrket sammen LNCaP celler var negative for XMRV sekvenser såvel som vi ikke fandt XMRV proteinekspression i PCA afsnit af en af ​​disse patienter.

Vi har tidligere offentliggjort, at XMRV sekvenser er kun sjældent påvises i Tyskland anvendelse af cDNA genereret fra PCA tissue RNA amplificeret ved PCR [27]. Lignende resultater for en undersøgelse i USA har for nylig blevet offentliggjort af Switzer et al., [26]. Men der er flere undersøgelser, der ikke identificerer nogen XMRV sekvenser i PCA væv samt der er studier med højere forekomst af XMRV i PCA [3], [9], [21] – [24], [31], [42] . Overvejer muligheden af ​​fokal XMRV infektion i prostata, som kan blive savnet af PCR-amplifikation på grund af kun et mindretal af celler inficeret vi etableret IHC farvning ved hjælp af den offentliggjorte anti-XMRV serum og en XMRV specifikke anti-gag serum. Vi kunne ikke detektere XMRV proteinekspression i PCA væv, brystcancer eller coloncancer væv samt de fleste kontrolvæv (herunder 10 sektioner hver: binyre, colon, endometrium, epididymis, hjerte, nyre, lunge, bugspytkirtel, placenta, ørespytkirtlen , milt, mave, tværstribede muskler, thymus, tonsil, og testis) viste ingen positiv farvning for gag K121 serum. Interessant, ved hjælp af anti-gag K121 serum vi opdaget 1/50 BPH sektioner positive for XMRV proteinekspression. Proteinekspression blev identificeret i nogle få isolerede basale celler i prostata epitel. Basale celler er fraværende i PCA, støtter det faktum, at XMRV højst sandsynligt er ikke direkte involveret i PCA udvikling. Det lille antal hele mount vævssnit undersøgt kunne forklare uoverensstemmelsen mellem vores resultater og tidligere resultater af Schlaberg et al. [4]. Vi kun farves ti hele mount vævssnit med både antisera blev den anti-XMRV serum [4] ikke bruges på TMA strækninger på grund af høj baggrundsfarvning. Aloia et al. og Sakuma et al. både diskutere en krydsreaktivitet af anti-XMRV serum med humane protein-antigener resulterer i IHC positiv farvning i PCA sektioner [16], [24]. Vi registrerer nogen krydsreaktivitet med den offentliggjorte anti-XMRV serum på Western blots analysere cellelysater fra inficerede og ikke-inficerede celler, men der var ingen baggrund observeret på paraffinsnit af cellelinier eller på hele sektioner af PCA væv anvendelse af serum i de angivne fortyndinger . Negativ IHC farvning udelukker ikke muligheden for få celler der bærer XMRV provirussekvenser som vi kan gå glip af PCR-amplifikation. Vi har ikke anvendt DNA FISH-teknologi til at opdage XMRV proviral integration i humant væv. Evaluering af FISH positivt signal i 0,1% eller mindre af cellerne, især hvis kun én viral kopi per celle er forventes, er stærkt fejlbehæftet.

For nylig Lombardi et al. rapporterede detektering og overførsel af smitsomme XMRV fra PBMC’er eller plasma af patienter med CFS ved co-dyrkning med LNCaP celler [2]. Interessant nok blev 3-4% af PBMC’er isoleret fra kontrol patienter identificeret til at være positive for XMRV smitsom virus resulterer i den generelle bekymring om sikkerheden af ​​blodprodukter. Adskillige efterfølgende undersøgelser motiveret af disse resultater ikke var i stand til at bekræfte de oprindelige afgørelser. Årsager til uoverensstemmelse er uklare og er i øjeblikket undersøgt. Mens størstedelen af ​​undersøgelser fokuserede på PCR teknikker samt påvisning af XMRV specifikke antistoffer kun én undersøgelse omfattede samdyrkning af aktiverede PBMC’er fra CFS patienter med LNCaP celler [10] og en nyere undersøgelse testet transmissionen af ​​XMRV fra plasma (afledt af CFS patienter) til LNCaP celler [43]. Begge undersøgelser ikke påvise XMRV i nogen af ​​de testede prøver. Fokus på muligheden for, at XMRV er en tilskuer virus reaktiveret i patienter med prostatacancer sammen med konstateringen af, at der kan påvises XMRV i PBMC’er af patienterne [2] vi søgt efter tegn på XMRV infektion i blodceller af PCA patienter anvender PCR-teknologi og samdyrkning af aktiverede PBMC’er med indikatorceller.