PLoS ONE: 1, 9-Pyrazoloanthrones nedregulerer HIF-1a og bevidstgøre kræftceller til at Cetuximab-medieret anti-EGFR Terapi

Abstrakt

Cetuximab, et monoklonalt antistof, der blokerer den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR), er i dag godkendt til behandling af flere typer af faste tumorer. Vi har tidligere vist, at cetuximab kan inhibere hypoxi-inducerbar faktor-1 alfa (HIF-1α) proteinsyntese ved at hæmme aktiveringen af ​​EGFR nedstrøms signalveje herunder Erk, Akt, og mTOR. 1, 9-pyrazoloanthrone (1, 9 PA) er en anthrapyrazolone forbindelse bedst kendt som SP600125 som specifikt inhiberer c-jun N-terminal kinase (JNK). Her rapporterer vi en, kan 9 PA nedregulerer HIF-1α uafhængigt af dets hæmning af JNK. Denne nedregulerende virkning blev afskaffet, når oxygen-afhængige domæne (ODD) af HIF-1α (HIF-1α-ΔODD, domænet ansvarlig for HIF-1α nedbrydning) blev eksperimentelt deleteret eller når aktiviteten af ​​HIF-1α prolyl hydroxylase (PHD) eller 26S proteasomalaktivitet komplekset blev inhiberet, hvilket indikerer, at 1, 9 PA nedregulerer HIF-1α ved at fremme PHD-afhængig HIF-1α nedbrydning. Vi fandt, at kombinationen af ​​1, 9 PA og cetuximab arbejdet synergistisk at inducere apoptose i cancerceller, hvori cetuximab eller 1, 9 PA alene havde ingen eller kun svag apoptotisk aktivitet. Denne synergistiske virkning blev væsentligt reduceret i cancerceller transficeret med HIF-1α-ΔODD, hvilket indikerer, at nedregulering af HIF-1α var mekanismen ved denne synergistisk virkning. Vigtigere, 1, kan 9 PA nedregulerer HIF-1α i cancerceller, der er ufølsomme over for cetuximab-induceret hæmning af HIF-1α ekspression skyldes overekspression af onkogen

Ras Salg (RasG12V). Vores resultater antyder, at 1, 9 PA er en ledende forbindelse af en ny klasse af lægemidler, der kan anvendes til at forøge responset af cancerceller over for cetuximab gennem en komplementær virkning på nedregulering af HIF-1α.

Henvisning : Lu Y, Li X, Lu H, Fan Z (2010) 1, 9-Pyrazoloanthrones nedregulerer HIF-1a og bevidstgøre kræftceller til at Cetuximab-medieret anti-EGFR Therapy. PLoS ONE 5 (12): e15823. doi: 10,1371 /journal.pone.0015823

Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: August 29, 2010; Accepteret: November 29, 2010; Udgivet: December 29, 2010

Copyright: © 2010 Lu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af en National Institutes of Health award 5R01CA129036 (til ZF), og en bevilling fra center for målrettet terapi af The University of Texas MD Anderson Cancer center (til ZF). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) spiller flere vigtige roller i udviklingen og progressionen af ​​mange typer af faste tumorer [1]. I de seneste to årtier har nye kræftbehandlinger rettet mod EGFR blevet udviklet og grundigt undersøgt [2], [3]. Nylige kliniske undersøgelser har påvist en objektiv respons hos patienter med flere typer kræft behandles enten ved at blokere EGFR med monoklonale antistoffer (cetuximab, panitumumab, etc.) eller ved at inhibere EGFR tyrosinkinaseaktivitet med små molekyler inhibitorer (gefitinib, erlotinib, etc. ) [4] – [9]. Disse undersøgelser førte til myndighedsgodkendelse af disse EGFR-målrettede midler til behandling af kolorektal, lunge- og hoved og hals kræft i kombination med konventionel kemoterapi eller strålebehandling; Men på trods af de objektivt respons, den samlede svarprocent på patienter behandlet med EGFR-målrettet terapi er lav, især når disse EGFR-målrettede midler anvendes som monoterapier [10] – [12]. Desuden er mange patienter med tumorer, der udtrykker eller endda stærkt udtrykker EGFR kan ikke have et optimalt respons på behandling med EGFR-målrettede midler [3]. For eksempel i patienter med kolorektal cancer, kun 20-30% af patienterne sygdom, som reagerede på EGFR-blokerende antistoffer [4]. Blandt de 70-80% af patienter med ikke-responderende sygdom, 30-35% havde

K-Ras

mutationer, 20% havde

B-Raf

PI3K

mutationer, og resten havde andre aberrationer [13]. Selv EGFR spiller vigtige roller i tumorigenese, cancerceller er genetisk ustabile og kan undvige effekten af ​​EGFR-målrettet terapi gennem flere velkarakteriseret og nogle ikke-endnu-kendte resistensmekanismer. Meget igangværende forskning er fokuseret på udvikling af nye kombinatoriske behandlingsformer rettet mod EGFR og molekyler i EGFR nedstrøms signalveje i et forsøg på at overvinde disse resistensmekanismer.

Vi har tidligere rapporteret, at cetuximab markant kan nedregulere de høje basale niveauer af hypoxi -inducerbare faktor-1 alfa (HIF-1α) ved inhibering HIF-1α proteinsyntese i cancer-cellelinier, som er følsomme over for EGFR inhibition [14], [15]. Vi viste, at inhibering af HIF-1α er påkrævet, selv om det ikke kan være tilstrækkeligt, at mediere respons af cancerceller til EGFR-målrettet terapi [14] – [17]. Knockdown af HIF-1α af RNA-interferens (RNAi) bemærkelsesværdigt sensibiliserede cancerceller med onkogen

Ras

mutationer eller dem med

PTEN

inaktivering eller sletning til cetuximab behandling [16]. I modsætning hertil overekspression af HIF-1α i cancerceller, som oprindeligt var følsomme for behandlingen tillagt betydelig modstand mod anti-EGFR-behandling [16]. Disse resultater antyder, at direkte målretning HIF-1α kan omgå adskillige kendte cetuximab-resistensmekanismer, såsom mutations aktivering af onkogener og inaktivering af tumorsuppressorgener i EGFR downstream pathways og /eller alternative aktivering af disse downstream pathways af andre vækstfaktorreceptorer . Ny kombination tilgange til målretning EGFR og HIF-1α kan derfor resultere i et forbedret terapeutisk respons hos patienter.

Adskillige strategier til målretning HIF-1α eller dens opstrøms regulatorer eller nedstrøms target gener er blevet testet i de senere år [18]. Metoder til direkte målretning HIF-1α funktion omfatter inhibering HIF-1α genekspression anvendelse af antisense eller RNA-interferens eller inhibere transkriptionel aktivitet af HIF-1α /β heterodimeren ved at interferere med dens interaktion med DNA eller cofaktorer. Disse tilgange er blevet hovedsageligt testet eksperimentelt, da de er vanskelige at teste klinisk med eksisterende teknologi. Alternativt kan HIF-1α protein målrettes indirekte ved at regulere dens proteinsyntese eller stabiliteten under anvendelse farmakologiske strategier, som kan testes klinisk [19].

I vores forsøg på at finde hidtil ukendte små molekyler blyforbindelser, der har anti -HIF-1α aktivitet og som kan optimeres yderligere til kombination med cetuximab at forbedre terapeutiske virkninger i cancerceller, opdagede vi, at 1, 9-pyrazoloanthrone (1, 9 PA), som er en anthrapyrazolone bedst kendt som SP600125 som specifikt inhiberer c -Jun N-terminal kinase (JNK) [20], [21], kan stærkt nedregulerer HIF-1α i flere kræftceller. I denne undersøgelse studerede vi forholdet mellem 1, 9 PA kendt aktivitet til at inhibere JNK og dens nyopdagede aktivitet af nedregulere HIF-1α. Vi udforskede også de biokemiske mekanismer, hvorigennem 1, 9 PA nedregulerer HIF-1α. Endelig udførte vi proof-of-evidence eksperimenter for at teste vores hypotese om, at behandling af cancerceller med en kombination af cetuximab og 1, kan 9 PA øge antitumoraktiviteten af ​​og sensibilisere cancerceller for cetuximab behandling. Vores resultater berettiger udviklingen af ​​nye derivater af 1, 9 PA, der kan anvendes i kombination med cetuximab til kræftbehandling gennem komplementær nedregulering af HIF-1α uden samtidig inhibering af JNK.

Resultater Salg

1, 9 PA nedregulerer HIF-1α uafhængig inhibere JNK

i denne undersøgelse fandt vi, at ud over at inhibere c-Jun-phosphorylering på en dosis-afhængig måde, 1, 9 PA markant reduceret den totale HIF -1α proteinniveau i A431 vulva skællede carcinomceller så tidligt som 15 minutter efter behandlingen, mens 1 blev 9 PA-induceret inhibering af JNK detekteret på et senere tidspunkt (figur 1A). Dette antyder, at 1, 9 PA nedregulerende virkning på HIF-1α er uafhængig af dets inhiberende virkning på JNK. Forbindelsen inducerede også en forbigående stigning i niveauerne af aktivering-specifikke phosphorylering af Akt på både T308 og S473, samt en vedvarende og gradvis stigning i niveauet af phosphoryleret Erk i cellerne, som er tidsmæssigt korreleret med genopretning af HIF -1α niveau startende fra ca. 4 timer efter behandling (figur 1A).

(A) Temporal orden og korrelation af 1, 9 PA-induceret HIF-1α nedregulering og JNK inhibering, og behandlings-induceret kompenserende aktivering af Akt og Erk. A431-celler blev behandlet med 5 pM 1, 9 PA i 0,5% FBS dyrkningsmedium til de angivne tidsintervaller. Cellelysater blev derefter fremstillet til Western blotting med de viste antistoffer. (B) dosisafhængige virkninger af 1, 9 PA på nedregulering HIF-1α, inhibering JNK, og aktivering Erk. A431-celler blev udsat for stigende koncentrationer af 1, 9 PA i 16 timer i 0,5% FBS dyrkningsmedium ved 37 ° C. Cellelysater blev derefter fremstillet til Western blotting med de viste antistoffer. (C) uafhængighed 1, 9 PA-induceret HIF-1α nedregulering fra dens JNK-inhiberende funktion. A431-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af 1, 9 PA eller 1-methyl-1, 9 PA i 1 time i 0,5% FBS dyrkningsmedium. Cellelysater blev derefter fremstillet til Western blotting med de viste antistoffer. (D) Ingen ændringer i HIF-1α niveau efter aktivering eller hæmning af JNK. A431-celler Wert transient transficeret med en kontrolvektor eller en af ​​de konstruktioner indeholdende en konstitutivt aktiv SEK1 S220E /T224D mutant (SEK1-CA), en dominant negativ SEK1 K129R mutant (SEK1-DN), eller en dominant negativ MEKK1 K432M mutant (MEKK1-DN) natten over. Cellelysater blev derefter fremstillet til Western blotting med de viste antistoffer. (E) Kompenserende aktivering af Erk efter HIF-1α silencing i sammenligning med behandling med 1, 9 PA eller 1-methyl-1, 9 PA. A431-celler blev udsat for knockdown af HIF-1α specifikke eller kontrol siRNA, eller behandlet med 10 pM 1, 9 PA eller 1-methyl-1, 9 PA i 16 timer. Cellelysater blev derefter fremstillet til Western blotting med de viste antistoffer. (F) Nedregulering af HIF-1α med 1, 9 PA i forskellige cancercellelinier. Angivne cellelinier blev eksponeret for 10 eller 40 uM 1, 9 PA i 1 time i 0,5% FBS dyrkningsmedium. Cellelysater blev derefter fremstillet til Western blotting med antistofferne vist.

behandlings-induceret nedregulering af HIF-1α og kompenserende stigning i cellesignalering var også 1, 9 PA dosisafhængig (figur 1B) . Den mindste dosis på 1, 9 PA nødvendigt at nedregulere HIF-1α var mellem 1,25 og 2,5 uM, hvilket var lidt højere end den minimale dosis, der kræves til effektivt at reducere c-Jun-phosphorylering ved inhibering af JNK (mellem 0,6 og 1,25 uM; Figur 1B ), der foreslår endvidere, at den nyopdagede nedregulerende effekt af 1, 9 PA om HIF-1α er uafhængig af dens kendte hæmmende effekt på JNK.

for at bekræfte denne observation, vi behandlede de samme celler med 1-methyl -1, 9 PA, en strukturel analog af 1, 9 PA, der er blevet anvendt som en negativ kontrol for 1, 9 PA i litteraturen, fordi det ikke inhiberer JNK. Vi bekræftede, at 1-methyl-1, havde 9 PA ikke reducere c-Jun-phosphorylering i A431-celler sammenlignet med 1, 9 PA; Men det var lige så effektiv til at nedregulere HIF-1α i disse celler (Figur 1C). På den anden side, transfektion af A431-celler med enten et konstitutivt aktiv SEK1, som aktiverer JNK, eller med dominant-negative SEK1 eller dominant-negativ MEKK1, som begge deaktivere JNK, påvirkede ikke niveauet af HIF-1α i cellerne (figur 1D). Disse yderligere kontrolforsøg har klart dokumenteret, at inhibering af JNK alene havde ingen virkning på størrelsen af ​​HIF-1α i cellen model undersøgt.

Figur 1E viser, at behandling af A431-celler med enten 1, 9 PA eller 1 methyl-1, 9 PA, eller knockdown af HIF-1α ekspression ved RNAi førte til en kompensatorisk stigning i niveauet af phosphoryleret Erk i disse celler, hvilket yderligere understøtter den konklusion, at stigningen i cellesignalering efter 1, 9 PA behandling er en kompenserende respons, der sandsynligvis relateret til nedregulering af HIF-1α, men ikke til inhiberingen af ​​JNK.

Udover A431 vulva skællede carcinomceller, fandt vi, at 1, kunne 9 PA nedregulerer HIF-1α i PC3 prostatacancerceller, MDA468 brystcancerceller, MCF7 brystcancerceller transficeret med et højt niveau af HER2, og H3255 og HCC827 ikke-småcellet lungekræft celler (figur 1F). Alle disse fund tyder kraftigt, at 1, kan 9 PA nedregulerer HIF-1α i humane cancerceller gennem en mekanisme (r), der er uafhængig af mekanismen (er), hvorved det hæmmer JNK. Disse resultater antyder også, at cellerne reagerer på 1, 9 PA eller 1-methyl-1, 9 PA-induceret nedregulering af HIF-1α eller RNAi-medieret HIF-1α silencing gennem en kompensatorisk reaktion af aktivering af celle signalveje, der er kendt for at øge HIF-1α udtryk [22] – [26].

1, 9 PA nedsætter HIF-1α niveau ved at fremme ubiquitinering af HIF-1α

Vi derefter udforskes mekanismen (er) hvorved 1, 9 PA nedregulerer HIF-1α. HIF-1α er et meget ustabilt protein under normoxiske betingelser, fordi det har den ilt-afhængige domæne (ODD), der er underlagt posttranslationel regulering gennem protein ubiquitinering og nedbrydning [27], [28]. Fordi 1, 9 PA dramatisk reduceret HIF-1α niveau på mindre end 15 min (0,25 h figur 1A), vi hypotese, at 1, 9 PA virker via en mekanisme, der forbedrer HIF-1α proteinnedbrydning. Figur 2A viser, at sammenlignet med vehikelkontrol behandling af A431-celler efter blokade af ny proteinsyntese med cycloheximid, behandling af cellerne med 1, 9 PA markant fremskyndet nedbrydning af HIF-1α; nedbrydningstiden blev forkortet fra 60 min i kontrolcellerne til mindre end 20 min i celler behandlet med 1, 9 PA. Endvidere 1, 9 PA-induceret nedregulering af HIF-1α blev fuldstændigt blokeret ved behandling af A431-celler med MG132 (figur 2B), som hæmmer 26S proteasomalaktivitet kompleks, hvilket indikerer, at reduktionen i HIF-1α efter 1, 9 PA-behandling var medieret ved at øge proteinnedbrydning.

(A) Reduceret HIF-1α protein stabilitet i nærvær af 1, 9 PA (1, 9 PA). A431-celler blev behandlet med 10 pM cycloheximid (CHX) plus 10 uM 1, 9 PA eller DMSO vehikelkontrol i 0,5% FBS dyrkningsmedium i op til 60 minutter ved 37 ° C. Cellelysater fremstilledes efter behandling på hvert tidspunkt og analyseredes ved Western blotting med de viste antistoffer. (B) Inhibering af 1, 9 PA-induceret HIF-1α nedbrydning af proteasomalaktivitet inhibitor MG132. A431-celler blev behandlet med 10 pM 1, 9 PA ± 10 pM MG132 for de angivne tidsintervaller. Cellelysater fremstilledes efter behandling på hvert tidspunkt og analyseredes ved Western blotting med antistofferne vist.

Mens 1, 9 PA markant nedreguleret HIF-1α under normoxiske betingelser, vi fandt, at evnen hos 1 , 9 PA at nedregulere HIF-1α blev markant reduceret, når oxygen ikke var tilgængelige, eller, når cellerne blev behandlet med deferoxamin (DFO), en jern-chelateringsmiddel (figur 3A); både O

2 og Fe

2+ er nødvendige for HIF-1α prolyl hydroxylase (PHD) aktivitet hydroxylere HIF-1α for anerkendelse fra VHL ubiquitinligase [29], [30]. Resultatet af behandling med DFO svarede til det af behandling med MG132: den ubiquitineret HIF-1α blev inhiberet mod nedbrydning gennem proteasomforløb (figur 3A). Disse resultater tyder på, at en, kan 9 PA direkte eller indirekte påvirker ubiquitinering af HIF-1α [29], [30].

(A) Krav om O

2 og Fe

2+ i 1, 9 PA-induceret nedregulering af HIF-1α. A431-celler var ubehandlede eller behandlet med 10 pM 1, 9 PA i 0,5% FBS dyrkningsmedium under normoxiske betingelser i fravær eller nærvær af DFO (100 uM) eller MG132 (10 uM), og under hypoxiske betingelser i 16 timer ved 37 ° C. Cellelysater blev derefter fremstillet til Western blotting med de viste antistoffer. (B) rolle ODD af HIF-1α i 1, 9 PA-induceret nedregulering af HIF-1α. A431-celler blev transient transficeret med HIF-1α-ΔODD konstruere eller en kontrolvektor i 48 timer og blev derefter enten ubehandlet eller behandlet med de angivne koncentrationer af 1, 9 PA i 1 time ved 37 ° C. Cellelysater blev derefter fremstillet til Western blotting med de viste antistoffer. (C) Resistens af A431 /HIF-1α-ΔODD celler til 1, 9 PA-induceret nedregulering af HIF-1α. A431-celler, der stabilt udtrykker HIF-1α-ΔODD konstrukt blev behandlet som beskrevet i (A). Cellelysater blev derefter forberedt til Western blotting med antistofferne vist.

For yderligere at teste denne hypotese undersøgte vi evnen af ​​1, 9 PA at regulere en HIF-1α mutant, hvor PHD /VHL interagerende domæne på HIF-1α, dvs. ODD, blev slettet (HIF-1α-ΔODD). Som forventet, mens 1, 9 PA faldt niveauet for vildtype-HIF-1α, det ikke påvirke niveauet for HIF-1α-ΔODD i A431-celler transient transficeret med HIF-1α-ΔODD konstruktion (figur 3B). Vi derefter etableret puljede A431-celler, der stabilt udtrykte HIF-1α-ΔODD og længere bekræftede resultaterne opnået i de parentale A431-celler ved behandling af A431-celler, der udtrykker HIF-1α-ΔODD på samme måde (figur 3C). Tilsammen udgør disse fund støtter stærkt den konklusion, 1, 9 PA nedregulerer HIF-1α gennem en mekanisme, der involverer samspillet mellem PHD /VHL og ODD af HIF-1α. Når de centrale elementer (O

2, Fe

2+, og 26S proteasom), der kræves for PHD aktivitet hydroxylere HIF-1α og for den efterfølgende VHL-medieret ubiquitinering og nedbrydning mangler eller hæmmes, eller når ODD af HIF-1α, som er målrettet domæne af VHL-ubiquitin ligase kompleks, er fraværende, 1, 9 PA mister sin evne til at nedregulere HIF-1α.

for at opnå direkte bevis for, at 1, 9 PA fremmer ubiquitinering af HIF-1α, underkastede vi HIF-1α immunpræcipiteret fra lysater af 1, 9 PA-behandlede A431-celler til Western blotting med et anti-ubiquitin antistof. Vi fandt, at niveauet af polyubiquitinated HIF-1α klart blev forøget inden for 10 minutter efter 1, 9 PA-behandling (figur 4A). Tilstedeværelsen af ​​proteasomalaktivitet inhibitor MG132 under 1, 9 PA behandling inhiberede ubiquitineret HIF-1α i at blive nedbrudt (figur 4B).

(A). A431-celler blev behandlet med 10 pM 1, 9 PA for angivne tidsrum. Cellelysater blev fremstillet til HIF-1α immunfældning, efterfulgt af Western blotting af de immunpræcipitater med antistoffer rettet mod ubiquitin (øverst), HIF-1α og β-actin. (B) A431-celler var ubehandlede eller behandlet med 10 pM 1, 9 PA i nærvær af 10 uM MG132 i 1 time i 0,5% FBS-medium. HIF-1α blev immunpræcipiteret efterfulgt af Western blot-analyse med et anti-HIF-1α antistof.

Tilsammen vore data giver stærke beviser for, 1, 9 PA nedsætter HIF-1α via en mekanisme, der forbedrer samspillet mellem ODD af HIF-1α og PHD /VHL /ubiquitinering kompleks, og derved fører til en forøget nedbrydning af HIF-1α gennem proteasomforløb.

1, 9 PA synergizes med cetuximab at inducere apoptose gennem co-nedregulering HIF-1α

Vi har tidligere vist, at cetuximab nedregulerer HIF-1α i cancerceller følsomme over for anti-EGFR-behandling gennem hæmning af HIF-1α proteinsyntese, der blev forhindret ved ekspression af et myristoyleret Akt, der er konstitutivt aktiv [16]. Figur 5A viser vores nuværende resultater, som svarer til dem vi tidligere rapporteret; Interessant, i modsætning til vores tidligere resultater, ekspression af det konstitutivt aktive Akt påvirkede ikke 1, 9 PA-induceret nedregulering af HIF-1α (figur 5B), implicerer at den rolle, 1, 9 PA-inducerede stigning i Akt aktivitet (se figur 1A) var ikke at modvirke 1, 9 PA-induceret HIF-1α proteinnedbrydning, men snarere at kompensere for 1, 9 PA-induceret HIF-1α proteinnedbrydning ved at stimulere ny HIF-1α proteinsyntese.

A431 celler blev transient transficeret med en kontrolvektor eller en myristoylerede Akt (Myr-Akt) i 24 timer i 0,5% FBS-medium. Den vektor- eller Myr-Akt-transficerede celler blev derefter behandlet med enten 20 nM cetuximab eller PBS natten over (A), eller med 10 uM 1, 9 PA eller DMSO vehikelkontrol i 1 time (B). Efter behandling blev cellelysater fremstillet til Western blotting med antistofferne vist.

Vores hypotese således at kombinationen af ​​1, 9 PA og cetuximab, som kan hæmme Akt og Erk veje og derved blokere kompenserende mekanismer, ville have en additiv eller endda synergistisk effekt på nedregulering af HIF-1α. Vi testede denne hypotese i 3 cancer cellelinjer, der er følsomme over for cetuximab behandling: A431, HN5 (hoved- og halscancer), og Difi (kolorektal cancer). Fordi Difi celler er ekstremt følsomme over for cetuximab, blev de behandlet med 2 nM cetuximab; A431 og HN5 celler, som ikke er så følsom over for cetuximab som Difi celler, blev behandlet med 10 nM cetuximab. Figur 6A viser, at når nogen af ​​de 3 cellelinjer blev behandlet med enten 10 eller 40 uM 1, 9 PA eller cetuximab alene, blev HIF-1α nedreguleres. Når cellerne blev behandlet med både 1, 9 PA og cetuximab, blev HIF-1α yderligere nedreguleret. Behandle cellerne med cetuximab eller 1, 9 PA alene inducerede kun minimal eller ingen spaltning af PARP, en markør af apoptose; Kombinationen af ​​cetuximab og 1, 9 PA markant forbedret induktion af PARP-spaltning i alle 3 cellelinier.

(A) Induktion af PARP-spaltning ved kombination af 1, 9 PA og cetuximab. A431, HN5, og Difi celler ubehandlet eller behandlet med cetuximab (10 nM for A431 og HN5 celler og 2 nM for Difi celler i 16 timer), 1, 9 PA (10 pM eller 40 pM tilføjet den sidste time før cellelyse) eller begge i 0,5% FBS dyrkningsmedium. Cellelysater blev fremstillet og analyseret ved Western blotting med de viste antistoffer. (B) Øget induktion af apoptose ved kombinationen af ​​1, 9 PA og cetuximab. A431-celler blev behandlet som beskrevet i (A). Cellelysater blev fremstillet og analyseret ved apoptose ELISA. De relative absorbansværdier er plottet.

s Drømmeholdet værdi var 0,01, når man sammenligner niveauet af apoptose med 1, 9 PA alene (10 eller 40 uM) eller cetuximab alene med den for apoptose ved kombination af de 2 agenter (bemærk: kun

s Salg værdier sammenligne 10 uM 1, 9 PA alene og i kombination med cetuximab er vist). (C) Afhængighed af induktion af apoptose ved kombinationen af ​​1, 9 PA og cetuximab på HIF-1α nedregulering. A431neo og A431 /HIF-1α-ΔODD celler blev behandlet som angivet, og cellelysaterne blev fremstillet og analyseret som beskrevet i (A).

Vi valgte A431-celler For yderligere at bekræfte dette resultat ved hjælp af en uafhængig apoptose ELISA, der kvantitativt måler niveauet af histon-associerede DNA-fragmentering i cytoplasmaet efter apoptose (figur 6B). 1, 9 PA alene ved koncentrationer på 10 og 40 uM ikke mærkbart øger niveauet af apoptose; cetuximab alene kun moderat øget niveau af histon-associerede DNA-fragmentering i cytoplasmaet. Vi fandt imidlertid, at kombinationsbehandlingen signifikant øget niveauet af apoptose (

s

0,01). For yderligere at bekræfte, om induktionen af ​​apoptose set med kombinationsbehandlingen blev medieret af de komplementære virkninger på nedreguleringen af ​​HIF-1α af disse 2 midler, vi forsøgene gentages i A431-celler, der udtrykker HIF-1α-ΔODD celler. Figur 6C viser, at sammenlignet med dets virkning i styrevektor-transficerede A431neo celler, kombinationsbehandlingen havde en markant lavere effekt på PARP-spaltning i A431 /HIF-1α-ΔODD celler. Virkningen af ​​1, 9 PA på nedregulering af endogen HIF-1α blev også reduceret i A431 /HIF-1α-ΔODD celler sammenlignet med A431neo celler. Disse data indikerer, at nedregulering af HIF-1α var mekanismen til synergiske virkning af kombinationen af ​​1, 9 PA og cetuximab.

1, 9 PA overvinder oncogen Ras-induceret cetuximab modstand

onkogen mutation af

Ras

har vist sig at være en væsentlig mekanisme af cetuximab modstand hos patienter med kolorektal cancer [10]. Vi har tidligere vist som en proof of concept, at knockdown af HIF-1α gennem RNAi væsentligt gendanner følsomheden af ​​A431 celler transficeret med et onkogen

H-Ras Hotel (G12V) mutant til cetuximab behandling [16]. For yderligere at bevise dette nye koncept, vi undersøgte effekten af ​​1, 9 PA alene og i kombination med cetuximab i A431-celler transficeret med

Ras-G12V

(A431 /RasG12V). Figur 7A viser, at sammenlignet med kontrol vektor-transficerede A431neo celler, A431 /RasG12V celler havde en højere basalt niveau af Akt phosphorylering og var resistente over for cetuximab-induceret hæmning af Akt phosphorylering, nedregulering af HIF-1α, og spaltning af PARP. Derudover, 1, 9 PA alene hæmmede både den basale og Ras-induceret opregulering af Akt phosphorylering og nedreguleret HIF-1α i både A431neo og A431 /RasG12V celler, men det havde ingen påviselig virkning på induktionen af ​​PARP-spaltning i enten cellelinie . Kombinationen af ​​1, 9 PA og cetuximab imidlertid markant forøget spaltning af PARP i både A431neo og A431 /RasG12V celler. Spaltningen af ​​PARP i A431 /RasG12V celler er især vigtigt, fordi cetuximab alene ikke var i stand til at inducere PARP-spaltning i disse celler som følge af ekspression af onkogene

Ras

; henviser kombinationsbehandlingen i A431 /RasG12V celler resulterede i et niveau af PARP-spaltning, der svarede til niveauet for PARP-spaltning i A431neo celler, hvilket indikerer en synergisme mellem 1, 9 PA og cetuximab i inducere apoptose i Cetuximabs-resistente cancerceller.

(A) Effekt af 1, 9 PA og cetuximab, enten alene eller i kombination, på HIF-1α niveau og induktion af apoptose. A431neo og A431 /RasG12V celler blev ubehandlet eller behandlet med cetuximab (10 nM i 16 timer), 10 uM 1, 9 PA (tilføjet den sidste time før cellelyse) eller begge i 0,5% FBS dyrkningsmedium. Cellelysater blev fremstillet og analyseret ved Western blotting med de viste antistoffer. (B) 1, 9 PA-medieret overfølsomhed cetuximab-induceret væksthæmning. A431neo og A431 /RasG12V celler blev behandlet med stigende koncentrationer af cetuximab ± 5 pM 1, 9 PA i 0,5% FBS dyrkningsmedium i 5 dage. Efter behandling blev cellerne underkastet en MTT assay. De optiske densitetsværdier på de behandlede grupper blev normaliseret til værdierne for kontrolgrupperne (med eller uden 1, 9 PA behandling) og udtrykt som en procentdel af den respektive kontrol. Procentdelen af ​​overlevende celler blev afbildet som en funktion af behandling med stigende koncentrationer af cetuximab. Forskellene i celle overlevelse mellem de to grupper var statistisk signifikant (

s

0,01), når koncentrationen af ​​cetuximab var større end 0,625 nM i A431neo celler og 1,25 nM i A431 /RasG12V celler. (C) 1, 9 PA-medieret overfølsomhed cetuximab-induceret hæmning af VEGF-produktion. A431neo og A431 /RasG12V celler blev ubehandlet eller behandlet med 10 nM cetuximab, 10 uM 1, 9 PA, eller begge i 0,5% FBS dyrkningsmedium i 16 timer. VEGF udskilt i det konditionerede medium af cellerne blev målt ved ELISA.

s

-værdier for angivne sammenligninger blev vist. (D) Sammenligning af A431 og GEO celler til behandling med 1, 9 PA og cetuximab, enten alene eller i kombination. A431 og GEO-celler blev behandlet som beskrevet i (A). Cellelysater blev fremstillet og analyseret ved Western blotting med de viste antistoffer. (E). 1, 9 PA-medieret overfølsomhed GEO celler til cetuximab-induceret væksthæmning. GEO-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af cetuximab ± 5 pM 1, 9 PA i 0,5% FBS dyrkningsmedium i 5 dage. Efter behandling blev cellerne underkastet en MTT assay. Dataene blev forarbejdet som beskrevet i (B). Forskellene i celle overlevelse mellem de to grupper var statistisk signifikant (

s

0,01). På alle koncentrationer af cetuximab testet

For at opnå yderligere bevis på celleniveau for at støtte pro-apoptotiske effekt af kombinationsbehandlingen, udførte vi en konventionel vækst og overlevelse celleassay sammenligning af cetuximab dosisafhængig virkning med og uden 1, 9 PA i A431neo og A431 /RasG12V celler. Vi fandt, at 1, 9 PA sensibiliserede både A431neo og A431 /RasG12V celler til cetuximab (figur 7B). Tilsætning af 1, 9 PA til cetuximab flyttet IC

50 af cetuximab 3-10 nM til mindre end 1 nM i A431neo celler, og endnu vigtigere, det opnåede en IC

50 af 3 nM for cetuximab i A431 /RasG12V celler; i modsætning hertil IC

50 af cetuximab alene blev ikke nået (figur 7B), selv ved koncentrationer på over 10 nM (data ikke vist).

Vi fandt, at behandling A431neo celler med 1, 9 PA alene ikke mærkbart hæmmer VEGF produktion i forhold til behandling af disse celler med cetuximab alene; tilsætte 1, har 9 PA ikke yderligere sænke niveauet af VEGF produktion, der blev hæmmet af cetuximab (Figur 7C). Interessant, men når A431-celler blev resistens over for cetuximab-induceret hæmning af VEGF-produktion på grund af ekspression af den onkogene RasG12V, tilsætning af 1, 9 PA betydeligt sænkede niveauet af VEGF-produktion (

s Restaurant 0,01 ).

Endelig at afgøre, om en, kan 9 PA også bevidstgøre kræftceller med naturligt forekommende

Ras

mutationer, vi undersøgte effekten af ​​kombinationen af ​​1, 9 PA og cetuximab på GEO kolorektal cancer celler, som er kendt for at have muteret

Ras

[31]. Trods bærer en muteret

Ras

på exon 2, GEO-celler reagerede på 1, 9 PA og cetuximab på en lignende måde som A431-celler gjorde. 1, 9 PA førte til en kompensatorisk stigning i niveauet af phosphoryleret Erk efter overnight behandling (16 timer) i begge A431 og GEO celler, som blev reduceret ved tilstedeværelse af cetuximab. Kombinationen af ​​disse 2 midler forbedret PARP-spaltning i begge typer celler (figur 7D) og sensibiliserede GEO celler til cetuximab-induceret hæmning af cellevækst og overlevelse (figur 7E).

Sammenfattende vores resultater viser, at 1, kan 9 PA sensibilisere cancerceller til cetuximab-medieret anti-EGFR-behandling ved at nedregulere HIF-1α og kan øge cellulære respons på cetuximab behandling i cancerceller, der bærer onkogen

Ras

mutationer.

diskussion

Her rapporterer vi 2 vigtige resultater, som, så vidt vi ved, er ikke tidligere blevet rapporteret.