PLoS ONE: Genistein Påvirker Histon Ændringer på Dickkopf-relateret protein 1 (DKK1) Gene i SW480 human coloncancercellelinie

Abstrakt

Genistein (GEN) er en plante-afledt isoflavon og kan blokere ukontrolleret cellevækst i tyktarmskræft ved at hæmme WNT signalvejen. Denne undersøgelse havde til formål at teste hypotesen om, at øget genekspression af Wnt signalvejen antagonist, er DKK1 af genistein behandling forbundet med epigenetiske modifikationer af genet i colon cancerceller. Genistein behandling inducerede en koncentrationsafhængig G2 fasen i den humane coloncancer cellelinie SW480 og reduceret celleproliferation. Resultater fra flere andre humane coloncancer-cellelinjer bekræftede væksthæmmende effekter af genistein. Overekspression af DKK1 bekræftede sit engagement i væksthæmning. Knockdown af DKK1 udtryk ved siRNA lidt induceret cellevækst. DKK1 genekspression blev forøget med genistein i SW480 og HCT15 celler. DNA-methylering ved DKK1 promotoren blev ikke påvirket af genistein behandling i alle de testede cellelinjer. På den anden side, genistein induceret histon H3 acetylering af DKK1 promotorregionen i SW480 og HCT15-celler. Dette indikerer, at øget histonacetylering er forbundet med genistein-inducerede DKK1 ekspression. Sammenhængen mellem histonacetylering og DKK1 genekspression bekræftes af histondeacetylaseinhibitoren Trichostatin A (TSA) behandling. Afslutningsvis genistein behandling nedsætter cellevækst og proliferation i colon cancer cellelinjer. Effekten er forbundet med den øgede DKK1 udtryk gennem induktion af histonacetylering på DKK1 promotor omegn

Henvisning:. Wang H, Li Q, Chen H (2012) Genistein Påvirker Histon Ændringer på Dickkopf-relateret protein 1 (DKK1) Gene i SW480 human coloncancer cellelinie. PLoS ONE 7 (7): e40955. doi: 10,1371 /journal.pone.0040955

Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA

Modtaget: Marts 21, 2012; Accepteret: 15 juni 2012; Udgivet: 18 Juli 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret delvist af en NIH /NCI tilskud til HC (CA135262) ​​og Illinois Soybean Association. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Soy indeholder forskellige bioaktive komponenter, der har modtaget megen opmærksomhed i deres potentielle evne til at reducere risikoen for kræft [1], [2]. Epidemiologiske undersøgelser viste, at indtagelse af højere niveauer af kosten sojaprodukter bidrager til lavere forekomst af kolorektal cancer i asiatiske lande [3], [4], [5]. Specifikt genistein (4, 5, 7-trihydroxy-isoflavon), en naturlig isoflavon rigelige i soja, har vist sig at reducere kolorektal cancer risiko [6], [7]. Disse undersøgelser giver stærke beviser for behovet for yderligere at undersøge mekanismerne bag genistein s anticancer potentiale.

I cellekultur studier har genistein blevet rapporteret til at ændre celle fysiologi i flere tyktarmskræft cellelinjer. En nylig undersøgelse foretaget af Fan et al. identificeret at coloncancerceller havde ændret morfologi, herunder chromatinkondensation og nuklear fragmentering efter genistein behandling [8]. Desuden højere koncentrationer af genistein på 10 pmol /L signifikant induceret inhibering af celleproliferation og DNA-fragmentering i en human colon-cellelinje [9]. Desuden er der i kolon cancercellelinier Caco-2 og SW620 blev celledød induceret af sojabønne ekstrakt behandling [10]. Derfor er genistein blive et lovende forbindelse i forebyggelse og behandling tyktarmskræft. I den foreliggende undersøgelse, har vi yderligere udforsket antitumoregenskaber af genistein ved at teste cellecyklusprogression og celleproliferation i flere kolorektale cancerceller som respons på behandling med stigende koncentrationer af genistein.

Forskellige veje og mekanismer er blevet foreslået at være ansvarlig for genistein evne til at reducere risikoen for kræft. IGF-IR-signalering, er AKT-vejen og cellevækst regulering den er forbundet med de antitumor virkninger af genistein [9], [11]. Derudover genistein også besidder antioxidant egenskaber ved at efterligne østrogen via østrogen receptor-medieret phosphorylering af ERK1 /2 og aktivering af NFKB-signalvejen [12]. Yderligere rapporter fra de seneste undersøgelser i dyr viste, at genistein hæmmede hormon-afhængige eller -uafhængige kræftceller ved at regulere samspillet mellem D-vitamin og østrogen receptor [13], [14], [15]. Genistein regulerer gentransskription i forskellige cancercellelinier efter epigenetiske forskrifter, f.eks DNA methylering og histon modifikationer [16], [17], [18]. Genistein ændrer DNA methylering af forskellige gener i rotte- og musemodeller [19], [20]. Dog forbliver mekanismerne bag genistein rolle i celledeling eller apoptose under carcinogenese dårligt forstået.

Vingeløse-int (WNT) signalvejen består af et stort antal vækstfaktorer, som er involveret i organogenese, proliferation, regenerering, celleskæbne bestemmelse og celle-celle adhæsion [21], [22]. Wnt proteiner binder til Frizzled receptorer (Frz) og low-density lipoprotein receptor-relateret protein (LRP) co-receptorer, hvilket medfører cytosolisk β-catenin stabilisering og akkumulering. Følgelig nukleare β-catenin stiger og komplekser med TCF /LEF transkriptionsfaktorer, der fører til øget transskription af målgener, herunder cyclin D1 [23]. Afvigende WNT signalering er en af ​​bidragyderne til overgangen fra normal colon epitel til maligne tumorceller [24], [25]. Genistein blev for nylig rapporteret at undertrykke WNT signalering i colon cancer cellelinjer [26], [27], som giver en potentiel mekanisme til genistein s anticancer kapacitet.

En af de vigtigste regulatorer af WNT signalvejen er dens antagonist Dickkopf 1 (DKK1). DKK1 forhindrer β-catenin-medieret signaltransduktion ved binding til LRP og Kremen proteiner, fremme celler differentiering og apoptose [28], [29], [30], [31], [32]. Den tavshed eller tab af DKK1 er blevet dokumenteret i forskellige sygdomme. I kolorektal cancer tavshed

DKK1

udtryk er tæt forbundet med mikrosatellit ustabilitet tumor undertyper [33]. Det forlyder, at tumor undertrykke kapacitet DKK1 er undertrykt af hypermethylering af sin promotor i de fremskredne stadier af kolorektal cancer [34]. I humane renale carcinomaceller, kemisk inducerende histonacetylering på DKK1 promotoren resulterede i re-aktivering af DKK1 ekspression, hvilket viser, at der ud over DNA-methylering, kan histon hale modifikationer også bidrage til transkriptionel kontrol af kritiske gener relateret til udviklingen af ​​kræft [ ,,,0],35].

i den foreliggende undersøgelse, vi undersøgte anticancer egenskaber genistein ved at identificere dens virkninger på kræftcellen fysiologi og undersøge mekanistiske grundlag af

DKK1

aktivering. Især denne undersøgelse er blandt de første til at linke genistein-medieret epigenetiske modifikationer af

DKK1

til anticancer egenskaber genistein i kolorektal cancer.

Resultater

Genistein Behandling selektivt induceret DKK1 Gene Expression men ændrede ikke DKK1 promoter methylering Mønstre

for at undersøge sammenhængen mellem DNA methylering på

DKK1

promoter CpG ø og effekten af ​​genistein behandling på

DKK1

ekspression, real-time RT-PCR blev udført for at måle

DKK1

mRNA-ekspression og methylering specifik polymerasekædereaktion (MSP) og bisulfit sekventering (BSF) i

DKK1

promotorregion blev udført at undersøge promotor status for methylering (fig. 1). Først

DKK1

genekspression blev analyseret i tilgængelige tyktarmskræft cellelinjer at undersøge virkningerne fra genistein behandling. Blandt de testede cellelinier, SW480 og HCT15 celler viste induktion af DKK1 genekspression ved genistein (fig. 1A). Analyse af DNA-methylering ved

DKK1

promotorregion bekræftede, at DKK1 genekspression i almindelighed er omvendt proportional med den methylering niveau af regionen testet (-159 /+ 109, fig. 1B, 1C, og 1D) . Specifikt RKO, SW48, og DLD-1-celler udviste meget høj, hvis ikke fuldstændig, methylering af regionen (fig. 1C, og 1D). Denne hypermethylering er omvendt relateret til niveauet af DKK1 genekspression som vist i fig. 1A. For DKK1-udtrykkende cellelinier HCT15, HT29, og SW480, der er minimal DNA-methylering observeret (fig. 1C og 1D). Vigtigere er, at genistein behandling ikke ændrer DNA methylering af

DKK1

promotorregion i alle testede cellelinier, uanset niveauet af methylering af DNA i regionen (fig. 1C og 1D).

SW480, DLD-1, HCT15, HT29, RKO og SW48 celler blev behandlet med genistein i 2 d før prøvetagning til yderligere analyse. A) Relativ DKK1 mRNA-ekspression. mRNA-ekspression blev analyseret under anvendelse af RT-PCR. Data blev normaliseret til den interne kontrol L7a. Tre uafhængige celleprøver blev analyseret og præsenteret som gennemsnit ± SEM. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans sammenlignet med kontrol inden for den samme cellelinje (p 0,05). B) Skematisk tegning af DKK1 promotorregionen. Vandrette bjælke repræsenterer CpG ø inden promotorregionen. De lodrette streger indikerer individuelle CpG sites. Sorte pilespidser angiver positionerne af primerne anvendt i PCR-amplifikationer for bisulfit sekventering (-159 til 109). Pile repræsenterer positionerne af primere anvendt til PCR-amplifikationer i MSP (-60 + 73). C) MSP af DKK1 promotorregionen i HCT15, HT29, RKO og SW48. Y-aksen repræsenterer methylering niveau og værdierne er beregnet som procentdel af M /(M + UM). Når den ikke er set, fejl barer er inden for de kolonner. D) bisulfit sekventering af DKK1 promotorregionen i SW480 og DLD-1-celler. Hver åben cirkel repræsenterer et ikke-methyleret C i en CpG mens en udfyldt cirkel betegner en methyleret C i en CpG. Hver række af cirkler repræsenterer en individuel klon anvendt til sekventering.

Genistein dosis- og Time-afhængigt induceret DKK1 Gene Expression

Real-time RT-PCR blev udført for at måle

DKK1

mRNA ekspressionsniveauer i respons på forskellige genistein doser og eksponeringstider. Samlet,

DKK1

ekspression blev forøget med genistein på en dosis-afhængig måde (Fig. 2A). Efter 2 d af genistein behandling,

DKK1

mRNA-ekspression var 3 gange og 8 gange højere efter 50 og 75 pmol /L genistein behandlinger, når det blev sammenlignet med den ikke-genistein kontrol (p 0,05, fig. 2A). MRNA-niveauet af

DKK1

i SW480-celler blev også forøget med genistein behandling (75 pmol /l) i en tidsafhængig måde (Fig 2B.) Og nåede et 10-gange induktion ved d4 sammenlignet til niveauet i DMSO kontrol.

A) SW480 celler blev behandlet ved forskellige koncentrationer af genistein i 2 d. mRNA-ekspression blev analyseret ved RT-PCR. X-aksen viser genistein koncentrationer og y-aksen viser relative mRNA-ekspression niveau. Data blev normaliseret til den interne kontrol L7a. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans i forhold til 0 mmol /l genistein (

s

0,05). B) Tidsforløb for

DKK1

udtryk i SW480 efter genistein behandling. SW480-celler blev behandlet med 75 mmol /l af genistein og stikprøven på dag 1, 2, 3 og 4 i behandlingen. Data blev normaliseret til den interne kontrol L7a. Tre uafhængige forsøg blev udført, og præsenteret som middelværdi ± SEM. Hvor usynlige, er fejlbjælker indeholdt i søjlerne. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans i forhold til d 1 af 75 pmol /L genistein (

s

0,05). C) DKK1 proteinekspression. Hele celle proteinekstrakter blev indsamlet fra SW480-celler og western blot-analyse af DKK1 blev udført som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. En skamplet fra western analyse vises, og kvantificeringen repræsenterer middelværdien ± SEM fra 3 uafhængige stikprøver. Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans i forhold til at styre 0 mmol /l genistein (

s

0,05).

Induktion af

DKK1

blev bekræftet af måle dens protein ekspressionsniveau i SW480-celler (fig. 2C). DKK1 proteinekspression viste en 3-fold induktion med 75 pmol /L i genistein behandling i SW480 celler efter en 4-d behandling, når sammenlignet med kontrollen.

Genistein Hæmmet cellecyklusprogression i SW480 celler

for at undersøge effekten af ​​genistein på cellecyklusprogression af SW480-celler blev DNA-indhold af SW480-celler målt efter område fit-analyse efter den flowcytometrianalyse. Histogrammer viste, at populationen af ​​celler ved G1 markant reduceret med 75 pmol /L i genistein behandling sammenlignet med no-genistein kontrol, med et fald af celler i S-fasen (fig. 3A). På den anden side, genistein behandling resulterede i en ophobning af celler ved G2 /M-fasen i SW480-celler.

SW480-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af genistein i 2 dage før prøvetagning. A) Repræsentative DNA histogrammer af genistein behandling af 0 og 75 mmol /l ved flowcytometri. Y-aksen repræsenterer relativ DNA-indhold og x-aksen viser cellecyklus faser. B) Cellecyklusanalyse af genistein behandlede celler. Procentdelen af ​​celler i G1 (•), S (▴) eller G2 /M (▪) er vist. Data repræsenterer middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg. C) WST-1 proliferation assay. WST-1 signaler fra hver brønd blev aflæst ved 450 nm for absorbans mod en referencebølgelængde på 630 nm. Absorbans blev omdannet til faktiske celleantal under anvendelse af en standard genereret af serielle fortyndinger af et kendt antal celler. Tre uafhængige celleprøver blev analyseret og præsenteret som gennemsnit ± SEM. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans i forhold til 0 pmol /l genistein (

s

0,05).

Virkningerne af genistein på cellecyklusprogression blev yderligere analyseret ved behandling af celler med genistein i koncentrationer fra 1 til 75 pmol /L. Procentdelen af ​​celler i forskellige faser blev beregnet som forholdet mellem gated celler til den samlede cellepopulation. Genistein koncentrationer over 5 mmol /l forøgede procentdelen af ​​celler i G2 /M-fase signifikant (p 0,05) med den højeste akkumulering observeret ved 75 pmol /l genistein (p 0,05, figur 3B.). Resultaterne viser, at procentdelen af ​​celler i G1-fasen blev ophævet efter 75 pmol /l genistein behandling (fig. 3B). Procentdelen af ​​S-fase celler var signifikant reduceret (p 0,05) efter 50 og 75 pmol /L genistein behandlinger efter en kortvarig stigning med 25 pmol /L genistein sammenlignet med no-genistein kontrol. Tilsammen blev cellecyklusprogression i SW480-celler reguleres af genistein på en dosis-afhængig måde.

Genistein Hæmmet celleproliferation i SW480 og flere andre Colon Cancer Cell Lines

Celleproliferation blev testet ved WST-1 assay, hvilket viste, at genistein behandlinger reducerede celleantal af SW480-celler på en dosis-afhængig måde (fig. 3C). Ved genistein koncentrationer over 15 pmol /L celletal var betydeligt reducerede sammenlignet med no-genistein kontrol (p 0,05). Denne anti-proliferative effekt af genistein blev bekræftet i flere coloncancer-cellelinjer (fig S1). Den AnnexinV-propidiumiodid assay viste ingen ændring af nogen af ​​genistein behandlinger, hvilket viser, at genistein ikke påvirker apoptose sats (data ikke vist). Disse resultater indikerer, at væksten-undertrykke effekt af genistein er generaliseres til de fælles menneskelige tyktarmskræft cellelinjer.

cyclin D1 mRNA ekspression Nedsat efter Genistein Behandling i SW480 Celler

cellecykluskontrol gener

p21

,

cyclin D1

c-myc

er stærkt korreleret til reguleringen af ​​cellevækst. Baseret på data præsenteret ovenfor, cellecyklusstop fandt sted i G2 i SW480 celler ved genistein behandling. For yderligere at undersøge virkningerne af genistein på cellecyklus progression, mRNA ekspressionen af ​​cellecyklus kontrol gener

p21

,

cyclin D1

c-myc

blev målt ved real-time RT-PCR. Vores resultater viste, at ekspressionen af ​​

cyclin D1

blev reduceret signifikant (p 0,05) med 50 og 75 pmol /l genistein sammenlignet med kontrol (figur 4, s. 0,05). Udtrykket af

p21

c-myc

blev ikke påvirket af nogen af ​​genistein behandlinger. Den faldt udtryk for

cyclin D1

er i overensstemmelse med cellecyklus data fra flowcytometri viser, at cellecyklusprogression blev hæmmet af genistein behandling.

SW480 celler blev behandlet med 0, 1, 5 , 15, 25, 50 eller 75 pmol /L genistein i 2 dage. MRNA ekspressionsniveauer af

p21, cyklin D1

c-MYC

blev målt ved RT-PCR. L7a blev anvendt som den interne kontrol. Tre uafhængige forsøg blev analyseret og præsenteret som middelværdi ± SEM. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans i forhold til kontrol, 0 mmol /l genistein (

s

0,05).

Overekspression af DKK1 Hæmmet cellecyklusprogression og Cell Proliferation i SW480 celler

for at undersøge den potentielle rolle for

DKK1

i cellecyklusprogression, SW480 celler blev transficeret med en pCMV-XL5 plasmid indeholdende humant

DKK1

. Overekspression af

DKK1

blev bekræftet ved RT-PCR-analyse af mRNA og western blot-analyse af protein (fig. 5A og 5B). Analyse af

cyclin D1

ekspression viste, at overekspression af DKK1 inducerede lignende undertrykkelse af genekspression som genistein behandling (fig. 5A). Overekspression af

DKK1

signifikant forøget procentdelen af ​​celler i G2 /M-fasen i forhold til vektoren kontrol (p. 0,05, figur 5C), om end i mindre grad sammenlignet med genistein behandling. I mellemtiden, procentdelen af ​​celler i G1-fasen blev signifikant reduceret i celler, der overudtrykker DKK1 (p 0,05), og der var ingen signifikant ændring i antallet af celler i S-fase. Resultater fra WST-1 assay viste, at overekspression af

DKK1

reducerede proliferation af SW480-celler, om end i meget mindre grad i forhold til genistein behandling (p 0,05, figur 5D.). Samlet set overekspression af

DKK1

produceret lignende virkninger på at hæmme celle progression og celledeling, som gjorde genistein behandling, hvilket tyder på en rolle DKK1 i disse cellulære begivenheder.

pCMV vektor indeholdende humant

DKK1

genet blev anvendt til transfektion celler før prøvetagning til analyse. Tøm pCMV vektor blev anvendt som kontrol for overekspression eksperimenter. Tre uafhængige celleprøver blev analyseret og præsenteret som gennemsnit ± SEM. A) mRNA udtryk for

DKK1

cyclin D1

i regelmæssig og

DKK1

transficerede SW480-celler. MRNA-ekspression blev analyseret ved RT-PCR. Data blev normaliseret til den interne kontrol L7a. B) DKK1 proteinekspression i regelmæssige celler og transficeret SW480 celler. Hele celle proteinekstrakter blev opsamlet fra transficerede SW480-celler og western blot-analyse af DKK1 blev udført som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. En repræsentativ-blot er vist og kvantificeringen repræsenterer middelværdien ± SEM fra 3 uafhængige skåle. Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. C) Cell cyklus analyse af regelmæssig og

DKK1

transficerede SW480-celler. Resultat blev opnået ved flowcytometri. Y-aksen repræsenterer% af gatede celler og x-aksen viser forskellige cellecyklus faser, herunder G1, S og G2 /M. D) WST-1 proliferation assay i vektor- og

DKK1

transficerede SW480-celler. WST-1 signaler blev omdannet til faktiske celleantal under anvendelse af en standard genereret af serielle fortyndinger af et kendt antal celler. Data blev normaliseret til kontrol for genistein behandling og vektor til DKK1 transfektion henholdsvis. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans sammenlignet med den respektive kontrolgruppe (genistein at kontrollere, DKK1 til vektor

s

0,05). For knockdown af DKK1 blev siRNA-duplexer mod human DKK1 gen transficeret i SW480-celler. Kodede sekvenser blev anvendt som kontrol siRNA. E) mRNA ekspressionen af ​​

DKK1

cyclin D1

i kontrol siRNA (N /S si) og

DKK1

siRNA (DKK1 si) -behandlede SW480 celler ved kontrol og genistein behandlinger. MRNA-ekspression blev analyseret ved RT-PCR. Data blev normaliseret til den interne kontrol L7a. F) WST-1 proliferation assay i kontrol siRNA og

DKK1

siRNA SW480 celler. WST-1 signaler blev omdannet til faktiske celleantal under anvendelse af en standard genereret af serielle fortyndinger af et kendt antal celler. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans i forhold til Kontrol 0 mmol /l genistein (

s

0,05). Beslaget indikerer statistisk forskel mellem de N /S si og DKK1 si grupper behandlet med genistein (p = 0,002).

Knockdown af DKK1 i SW480 Celler Delvist vendt Ændringer af Cellulær Profil forårsaget af Genistein Behandling

for at undersøge om ændringen af ​​cellulære egenskaber af SW480 forårsaget af genistein er afhængig af

DKK1

genekspression, siRNA målrettet DKK1 transficeredes i SW480 celler efterfulgt af genistein behandling. Real-time RT-PCR viste, at siRNA reduceres effektivt DKK1 udtryk i SW480 i både kontrol- og genistein behandlinger (p. 0,05, figur 5E). Desuden reduktion af

cyclin D1

mRNA-ekspression af genistein behandling som observeret i ikke-specifikke siRNA-behandlede celler (N /S SI) blev afskaffet ved knockdown af DKK1 (DKK1 si, fig. 5E). I mellemtiden, selvom observeres væksthæmmende virkning fra genistein i både N /S siRNA og

DKK1

siRNA grupper, knockdown af DKK1 signifikant øget proliferation af SW480-celler sammenlignet med den af ​​kontrol siRNA i genistein behandling (p lt ;.. 0,05, DKK1 siRNA vs N /S siRNA i genistein behandlinger, fig 5F)

Genistein induceret histonacetylering i DKK1 Gene i SW480 og HCT15 Celler

chip blev udført for at analysere kromatin struktur på promotor (-96 /-28), kodning (+ 635 /+ 742), og 5 ‘opstrøms regioner kontrol (-2781 /-2713) af

DKK1

gen (fig. 6A) . 5’opstrøms kontrolregion blev anvendt som en negativ kontrol for at vise den relative inaktive region under transkription. DLD-1-celler blev anvendt som en negativ kontrol for at vise kromatin status, når

DKK1

genekspression tavshed og ikke reagerer på genistein behandling. Normalt kanin IgG blev anvendt som en intern kontrol antistof og ethvert DNA-binding svarer til bindingen i kontrolgruppen IgG blev betragtet som uspecifik. Øget RNA-polymerase II (PolII) bindende på

DKK1

promotorregion indikerede forøget transkription af

DKK1

genet i SW480-celler som respons på genistein (p 0,05, figur 6B.). I modsætning hertil var der minimal PolII bindende inden for

DKK1

gen i DLD-1-celler, hvilket bekræfter den tavse transkription af genet i DLD-1-celler (fig. 6B).

A) En skematisk tegning af

DKK1

gen. Sorte pilespidser repræsenterer primere anvendt til PCR til at teste tre regioner i chippen assay: promotor, kodning og 5 ‘opstrøms kontrol. Fyldte kasser repræsenterer exons af

DKK1

gen, mens den åbne kasse repræsenterer den

DKK1

promotor. Sorte linjer repræsenterer introns. B) chip analyse af den relative protein overflod inden for forskellige områder af

DKK1

gen i SW480 og DLD-1 celler. Immunopræcipiteret DNA blev analyseret ved real time PCR. Specifikke antistoffer anvendes til immunopræcipitation er mærket på x-aksen. En ikke-specifik kanin IgG blev anvendt som negativ kontrol. Data blev plottet som forholdet til værdien fra 25% af indført DNA. Tre uafhængige forsøg blev analyseret og præsenteret som gennemsnit ± SEM. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans sammenlignet med kontrolgruppen ved hjælp af samme antistof i cellen linje (p 0,05).

For at bestemme, om den øgede transskription niveau

DKK1

gen som respons på genistein blev moduleret af ændringer i chromatinstruktur, antistoffer mod acetylerede, methylerede eller phosphorylerede histoner blev anvendt i chippen assay. Histon modifikationer i de tre repræsentative regioner af

DKK1

genet blev først undersøgt i SW480 celler efter genistein behandling, anvendelse af DLD-1-celler som negativ kontrol. Stigninger i acetyleret histon H3 på promotoren og kodende regioner af

DKK1

blev observeret i SW480 celler efter genistein behandling (p. 0,05, figur 6B, H3Ac) med nogen signifikant acetylering af histoner i DLD-1 celler før eller efter genistein behandling (fig. 6B). Den overflod af de andre testede acetyleret histon den acetyleret histon H4, blev ikke påvirket af genistein behandling i enten cellelinjer (H4Ac). Selv om der var en meget højere grad af dimethyl histon H3 lysin 4 i SW480-celler sammenlignet med DLD-1-celler, havde genistein behandling påvirker ikke status for methylering af denne histon H3 remanens (fig. 6B, H3K4Me2). Phosphorylering af histon H3 på serin 10 blev også undersøgt, og resultatet viste, at der var en beskeden nedgang i forskellige regioner i

DKK1

genet ved genistein behandling i alle testede cellelinier (p. 0,05, Fig 6B, H3S10p). Sammenfattende aktiv transskription af

DKK1

gen var forbundet med den øgede histon H3 acetylering ved dens gen-region, som sandsynligvis resulteret i ansættelsen af ​​PolII til sin promotor.

DKK1 mRNA ekspression blev induceret af histondeacetylase (HDAC) -hæmmer i SW480 Celler

TSA er en histon deacetylase (HDAC) -hæmmer, som interagerer med de fleste af HDAC familiemedlemmer og inducerer acetylering af histoner. For at bekræfte virkningerne af genistein-induceret histonacetylering på

DKK1

transkription behandlede vi SW480-celler med en serie af TSA koncentrationer og sammenlignet resultaterne til genistein behandling. MRNA ekspression af

DKK1

var signifikant forhøjet ved TSA behandling på en dosis-afhængig måde svarende til resultatet observeret fra genistein behandling (p. 0,05, figur 7).

DKK1

mRNA-niveau blev analyseret i SW480 celler behandlet med 50, 100 eller 200 nmol /l af TSA (TSA50, TSA100, og TSA200 henholdsvis) i 1 d. Genistein behandling blev udført som tidligere beskrevet. mRNA-ekspression niveau blev analyseret under anvendelse af RT-PCR. Tre uafhængige celleprøver blev analyseret og præsenteret som gennemsnit ± SEM. Værdier med forskellige bogstaver er forskellige (

s

0,05).

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse har til formål at identificere de potentielle mekanismer for antitumor virkninger af genistein. Vi observerede, at både mRNA og protein niveauer af DKK1 blev opreguleret af genistein behandling. Vores resultater viste, at genistein behandling induceret cellecyklusstop og hæmmede celledeling i SW480 kolon kræftceller. Dette blev senere bekræftet i flere andre coloncancer-cellelinjer. Både overekspression og knockdown af

DKK1

bekræftede inddragelse af DKK1 til inhibering af cellecyklusprogression og celleproliferation. Vores resultat viste, at øget DKK1 udtryk kan være en af ​​grundene, der forårsagede cellecyklusstandsningen og hæmning af celledeling ved genistein behandling. Desuden sammenligning mellem de

DKK1

udtrykkende celler, herunder HCT15, HT29 og SW480, og

DKK1

-repressed celler, herunder RKO, SW48 og DLD-1 viste, at gen-transkription af

DKK1

er omvendt relateret til dets promotor methylering status. Genistein påvirker ikke DNA methylering af

DKK1

promotor. På den anden side, og endnu vigtigere, har vi gjort den iagttagelse, at genistein inducerer histonacetylering i

DKK1

gen, og dette er korreleret med aktiveringen af ​​sin gentranskription.

anticancer roller genistein, herunder fremme af apoptose, inhibering af cellecyklusprogression, celleproliferation og invasion, blokering af angiogenese og metastase i forskellige typer af cancere er veldokumenteret [7], [36], [37], [38]. De molekylære mekanismer bag disse anticancer funktioner af genistein omfatter modulationer af cellecyklusinhibitorer, regulering af apoptose-relaterede gener, samt hæmning af IGF-IR og PI3K /AKT signalering [11], [39], [40], [41]. Arbejde fra vores gruppe har vist, at genistein inhiberede anden kritisk vej hos tyktarmskræft udvikling, WNT /β-catenin pathway, ved at interferere med promotoren methylering af specifikke gener. Specifikt genistein induceret

WNT5a

ekspression ved faldende methylering inden genets promoter region [27]. Genistein inhiberede også WNT /β-catenin pathway ved at aktivere en anden WNT antagonist,

sFRP2

, ved demethylering CpG-øer i genet [26]. Den aktuelle undersøgelse udvidet viden til også at omfatte DKK1 som en anden faktor i WNT signalering, der medierer svaret fra genistein behandling. Som en repressor for kræft cellevækst, DKK1 er en vigtigste antagonist, der forstyrrer den WNT sti og nedregulerer ekspressionen af ​​de nedstrøms target gener, herunder cyclin D1 [28], [42], [43].

udtryk for DKK1 blev stille ved promotor hypermethylering i fremskredent stadium af tyktarmskræft (Dukes ‘C og D) [34]. I DLD-1 cellelinje fra Dukes ‘C, en mere fremskredent stadium af tyktarmskræft, demethylering af DKK1 genet ved 5-aza-2’-deoxycytidin, en DNMT inhibitor, re-aktiveret DKK1 udtryk [34], [44] . Da genistein er blevet vist at aktivere gener gennem CpG demethylering [19], vi først afprøvet muligheden for DKK1 promotor demethylering af genistein. Vores resultat bekræftet, at methylering niveau ved promotoren CpG øen er omvendt proportional med det gen ekspression af DKK1. I de cellelinier med hypermethyleret promotor regionen, herunder DLD-1, RKO, og SW48, der var minimal, hvis ikke tavshed DKK1 genekspression. Desuden har genistein behandling ikke ændre hypermethyleringen af ​​regionen i disse celler, eller introducerede nogen genekspression. På den anden side, DKK1 var umethyleret i den tidlige fase af tyktarmskræft (Dukes ‘B) og dermed forbundne cellelinjer, herunder SW480 [34] og HCT15. Både MSP og bisulfit sekventering bekræftede, at DNA-methylering var meget lidt, om nogen, i cellelinierne. Endvidere er hypometylering ikke ændret af genistein behandling. Derfor blev DNA demethylering udelukket som en mekanisme til induktion af DKK1 genekspression ved genistein i disse cellelinjer.

Det er blevet rapporteret, at genistein modulerer også andre epigenetiske markører på kromatin niveau [16], [45 ], [46].