PLoS ONE: konstatering af en passende diagnostiske algoritme Brug EGFR Mutation-specifikke antistoffer til Detect EGFR status i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) mutation status er den mest værdifulde indikator i screeningen af ​​ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter for tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) terapi. Præcise, hurtige og økonomiske metoder til påvisning EGFR-mutationer er blevet vigtig. Brugen af ​​to mutation-specifikke antistoffer rettet mod delE746-A750 mutation i exon 19 og L858R mutation i exon 21 gør denne opgave er muligt, men manglen på consensually acceptable kriterier for positive resultater begrænser anvendelsen af ​​dette antistof baseret mutation afsløring.

Metoder

Vi indsamlede 399 prøver fra NSCLC patienter (145 resektion prøver, 220 biopsi prøver og 34 cytologiprøver) hvis EGFR mutation status var blevet opdaget af TaqMan PCR-analyse. Immunhistokemiske (IHC) analyser bruger EGFR mutation-specifikke antistoffer blev ansat for alle prøver. Efter farvning og scoring, følsomhed, specificitet, positiv prædiktiv værdi (PPV) og negative prædiktive værdi (NPV) blev beregnet i overensstemmelse med forskellige niveauer af positive kvaliteter i sammenligning med resultaterne af PCR-baseret assay.

Resultater

I IHC-baserede analyser, blev 144 sager scoret 0, 104 sager blev scoret 1+, blev 103 sager scoret 2+, og 48 sager blev scoret 3+. Med de molekylære-baserede resultater blev indstillet som “gold standard”, forekomsten af ​​mutation var 6,94% (10/144), 23,08% (24/104), 67,96% (70/103) og 100% (48/48 ), henholdsvis for prøver med scoringer 0, 1+, 2+ og 3+. Når score 3+ blev betragtet som positive, specificitet og PPV var 100%; hvis kun score 0 blev betragtet negativt, blev 93,06% NPV opnået.

Konklusion

Patienter med score 3+ har en perfekt PPV (100%), og kan acceptere TKI behandling direkte uden nogen molekylær -baserede assays. Patienter med score 0 havde høj NPV (93,06%), der kunne nå 97,22%, når påvisning af totale EGFR blev anvendt. Men prøver med score 1+ eller 2+ er upålidelige og har brug for yderligere kontrol af EGFR mutation status ved molekylære assays

Henvisning:. Jiang G, Fan C, Zhang X, Dong Q, Wang L, Liu Y, et al. (2013) konstatering af en passende diagnostiske algoritme Brug EGFR Mutation-specifikke antistoffer til Detect EGFR status i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (3): e59183. doi: 10,1371 /journal.pone.0059183

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget: 18. december 2012; Accepteret: 12. februar 2013; Udgivet: 11 Mar 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud 81071905 og 81272606 til EHW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Siden begyndelsen af ​​anvendelsen af ​​epidermal vækstfaktorreceptor tyrosinkinaseinhibitorer (EGFR-TKI’er) gefitinib og erlotinib til behandling af fremskreden ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) [1], undersøgelser har vist, at NSCLC patienter med EGFR-aktiverende mutationer kan drage fordel af TKI behandling [2], [3]. Status for EGFR-mutationer er blevet den bedste forudsigelse af respons på TKI’er [4] – [9]. Direkte sekventering er “gold standard” metode til påvisning af EGFR-mutationer. Men dens følsomhed er forholdsvis lav; hvis procentdelen af ​​tumorceller er 25%, sandsynligheden for en falsk-negativt resultat er øget betydeligt. Grund af mangel på et tilstrækkeligt antal tumorceller rådighed til ekstraktion af høj kvalitet DNA, sandsynligheden for at opnå en falsk-negativ forøges mens teste en lille biopsi eller cytologi prøve. Imidlertid er omkring 70% af lungekræft diagnosticeret på fremskredne stadier, hvorved små biopsier og cytologiske prøver er den eneste kilde til materiale til diagnosticering og mutation test. Nylige fremskridt i molekylære metoder har muliggjort en udvikling af mere følsomme metoder til påvisning af mutationer. Sådanne fremgangsmåder indbefatter realtid kvantitativ polymerasekædereaktion (QRT-PCR) under anvendelse af specifikke prober (TaqMan PCR assay), amplificeret ildfast mutation (ARMS) og høj opløsning smeltepunkt analyse (HRMA) [10] – [14]. De er imidlertid dyre og uvægerligt kræver gode eksperimentelle betingelser og sofistikerede instrumenter. Derfor er de sjældent anvendes i ikke-universitetshospitaler.

immunhistokemisk (IHC) analyser kan også anvendes til at screene for EGFR mutationer. Yu et al. udviklede EGFR mutationsspecifikke kanin monoklonale antistoffer mod EGFR med E746-A750 deletion i exon 19 eller L858R punktmutation som viste god konsistens i forhold til molekylære assays [15] – [26]. Imidlertid blev den praktiske anvendelse af denne metode alvorligt begrænset på grund af den mærkbare forskel i kriterierne for positive resultater mellem de forskellige forskergrupper. Nogle forskere scorede data i henhold til farvning intensitet, og delte prøver i fire kvaliteter: 0, 1+, 2+ og 3+. Men nogle forfattere fortaler, en score over 1+ skal betragtes positivt, og andre argumenterede selv, at en score over 2+ skal scoret positiv. De særlige forhold i disse to tilgange var forholdsvis tæt (96-100%), men deres følsomhed varierede meget (47-92%) [15] – [19]. Nogle forskere opnåede også en score for udtryk ved at gange farvning intensitet ved procentdelen af ​​farvning område (0-300 eller 400), og henholdsvis talte for en score på 10 eller 20 at blive kategoriseret som positive, men en mærkbar forskel i følsomhed (42,2-100%) og særlige (77-100%) blev observeret [20] – [22]. For nylig, Kawahara et al. foreslog, at immunfarvning bør klassificeres som positive (score på 2+), negativ (score på 0) eller tvetydige (score på 1+), hvilket indikerer tvivlsom, negativ eller svagt udtryk, henholdsvis, hvilket kan få en følsomhed på 81,4%, specificitet på 97,5%, positiv prædiktiv værdi (PPV) på 94,6%, og negativ prædiktiv værdi (NPV) af 90,6% [23]. Konsensus af et universelt accepteret kriterium for “positive” mangler, som alvorligt hindrer den kliniske anvendelse af EGFR mutation-specifikt antistof til påvisning EGFR mutationer.

I den foreliggende undersøgelse, analyserede vi de ICH resultaterne af 399 prøver af NSCLC-patienter, som blev bedømt ved en fire-trins metode under hensyntagen til intensitet og området for farvning. Vi derefter sammenlignet resultaterne med en molekylær-baserede assay at undersøge muligheden for screening for EGFR mutationer i NSCLC prøver ved IHC analyser.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle humane væv og celler blev opnået i overensstemmelse med menneskelige emne Research protokoller godkendt af China Medical University Review Board. Tumor væv og celler blev opnået med skriftligt informeret samtykke fra voksne patienter med NSCLC.

Model udvælgelse og den molekylære baserede assay

Vi indsamlede 399 prøver (145 resektion prøver, 220 biopsi prøver, og 34 cytologiprøver) fra NSCLC patienter, som havde ansøgt om den molekylære baserede assay af EGFR mutationer i Patologisk Institut of China Medical University (Shenyang, Kina) fra august 2008 til august 2012. aldersgruppe af patienter de lungekræftpatienter var 26 -89 år (median, 62 år); Der var 214 mænd og 185 kvinder. De histologiske typer var 341 adenocarcinomer, 47 planocellulært karcinom, og 11 andre typer (tabel 1). EGFR mutation status for hver prøve blev registreret af TaqMan PCR assay. Resektion og biopsi væv blev fikseret i 10% formalin og indlejret i paraffin. Supernatanterne af pleural effusion-prøver blev fjernet ved centrifugering, og de resterende cellulære bestanddele blev derefter fikseret i 10% formalin og indlejret i paraffin. De paraffinblokke blev skåret i en tykkelse på 8 um til undersøgelse af PCR-baserede EGFR genmutationer. Mutationer af EGFR-genet blev undersøgt i exon 19 og 21 under anvendelse af TaqMan PCR assay. Genomisk DNA fra paraffinindlejrede væv eller cytologiske prøver blev ekstraheret og oprenset under anvendelse af et QIAamp DNA Micro (Qiagen, Valencia, CA, USA). De primere til mutation detektion og TaqMan prober rettet mod E746-A750 og L747-P753insS deletionsmutationer i exon 19 og L858R og L861Q punktmutationer i exon 21 blev købt fra GP Medical Technologies (Beijing, Kina). TaqMan PCR assay blev udført ved anvendelse af en 7900HT Real-time PCR-system (Applied Biosystems, Foster, CA, USA).

IHC analyser

paraffinblokke blev skåret til en tykkelse af 4 um til immunfarvning. Konventionel de-voksning og hydrering behandling blev gennemført ved hjælp af xylen og en gradueret serie af ethanol, hhv. Prøver blev kogt i et vandbad ved 100 ° C i 20 minutter i 1 mmol /l ethylendiamin tetra-eddikesyre (EDTA) ved pH 9,0 og Target Retrieval Solution (Dako, Glostrup, Danmark) at genvinde antigener. Intrinsic peroxidaseaktivitet blev blokeret ved behandling med peroxidase blokerende reagens (Dako) i 15 minutter ved stuetemperatur. De ikke-specifikke bindende steder blev blokeret ved inkubation med normal immunt gedeserum i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter vask i Tris-bufret saltvand (TBS; Dako) i 15 minutter, tre primære antistoffer (dvs. EGFR monoklonalt antistof (D38B1), delE746-A750 mutationen-specifikt monoklonalt antistof (6B6) og L858R mutation-specifikt monoklonalt antistof (43B2) ; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) blev fortyndet separat ved 1:400 og tilsat til prøver. Prøver blev inkuberet ved 4 ° C natten over, vasket i TBS i 15 min og inkuberet med mærket polymer-peberrodsperoxidase sekundært antistof (ChemMate Envision kit; DAKO) i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vask i TBS i 15 min, blev objektglassene visualiseret ved hjælp 3,3′-diaminobenzidin.

IHC scoring

IHC farvning score var baseret på farvning intensitet og procentdelen af ​​farvning område i membranen og /eller cytoplasma tumorcelle. Fire kvaliteter var ansat: 0, 1+, 2+, 3+. Zero betegnet ingen farvning; 1+ betegnet lysegul farvning uden tydelige partikler eller gul farvning med indlysende partikler i 10% af tumorcellerne; 2+ betegnet gul farvning med indlysende partikler i 10% tumorceller eller brun farvning med indlysende partikler i 10% af tumorcellerne; og 3+ betegnet brun farvning med indlysende partikler i 10% tumorceller. Farvning vurdering blev foretaget, hvis 5 tumorceller var til stede i en nål biopsi eller cytologi eksemplar. Alle immunhistokemiske analyser blev evalueret af tre erfarne efterforskere (YL, JHY og YZ), der var uvidende om patienternes kliniske tilstande eller patologisk diagnose.

statistiske analyser

følsomhed, specificitet, PPV og NPV af IHC assay blev beregnet ved anvendelse af molekylære assay som reference. Aftalen mellem de 2 teknikker blev beregnet ved hjælp Cohen κ. Alle data blev analyseret ved hjælp af SPSS 13.0 til Windows.

Resultater

Molekylær-baserede EGFR mutationsstatus af 399 NSCLC prøver

blev fundet i alt 399 NSCLC prøver ved hjælp af TaqMan PCR-assay. En EGFR mutation blev påvist i 162 tilfælde (40,6%, 162/399). Dette omfattede en E19 (E746-A750) deletionsmutation i 86 sager (21,55%, 86/399), E21 (L858R) punktmutationer i 70 tilfælde (17,54%, 70/399), både E746-A750 og L858R mutationer i 4 tilfælde, E19 (L747-P753insS) deletionsmutationer i 4 tilfælde (1,03%, 4/399), E21 (L861Q) punktmutationer i 6 tilfælde (1,5%, 6/399), og ingen mutation i 237 tilfælde (59,4%, 237/399). Satsen for mutationer i resektion prøver var 40,69% (59/145), i biopsi prøver blev 36,82% (81/220), og i cytologiprøver var 35,29% (12/34).

Komparative analyser af IHC-baserede og molekylær-baserede EGFR mutationsstatus Salg

farvningsmønstrene af EGFR mutation-specifikt antistof er vist i figur 1. ud af 399 NSCLC prøver, blev 144 tilfælde scoret 0 (hvor 10 sager nærede EGFR-mutationer og hastigheden af ​​mutationer i denne kategori var 6,94%, 10/144); 104 sager blev scoret 1+ (der var 24 tilfælde af EGFR-mutationer og hastigheden af ​​mutation var 23,08%, 24/104); 103 sager blev scoret 2+ (EGFR mutationer var til stede i 70 sager og hastigheden af ​​mutationer var 67,96%, 70/103); 48 sager blev scoret 3+ (48 sager nærede EGFR-mutationer, og satsen for mutation var 100%, 48/48). Detaljerede resultater er vist i tabel 2. Prøverne scoret 3+ har en perfekt PPV (100%), og dem scorede 0 har en god NPV (93.06%).

repræsentant immunfarvning af både histologi og cytologiske prøver i NSCLC patienter (A, D, G og J, resektion prøver, 200 ×, B, E, H og K, biopsipræparater, 200 ×, C, F, I og L, cytologiprøver, 400 ×). Fire kvaliteter var ansat: 0, 1+, 2+ og 3+. 3+ betegnet brun farvning med indlysende partikler i 10% tumorceller (A, B og C); 2+ betegnet gul farvning med indlysende partikler i 10% tumorceller eller brun farvning med indlysende partikler i 10% af tumorceller (D, E og F); 1+ betegnet lysegul farvning uden tydelige partikler eller gul farvning med indlysende partikler i 10% af tumorcellerne (G, H og I); Zero betegnet ingen farvning (J, K og L).

Aftalen mellem IHC-baserede og molekylære assays i overensstemmelse med forskellige niveauer af positive kvaliteter blev beregnet ved hjælp Cohen κ. Når grupperne med score på 0 eller 1+ blev betragtet som negative, og dem med score på 2+ eller 3+ blev betragtet som positivt, at aftalen mellem de 2 forskellige metoder til påvisning var højest (κ = 0,644). Dog vil der være 24 falsk-negative tilfælde (23,08%, 24/104) i gruppen af ​​score 1+ og 33 falsk-positive tilfælde (32,04%, 33/103) i den af ​​score 2 +, hvilket resulterer i en følsomhed af 77,63%, specificitet 86,64%, PPV af 78,14%, og NPV på 86,4% for påvisning ved immunhistokemi. Ingen af ​​disse værdier var ideel (vist i tabel 3).

Med molekylær test som en standard, delE746-A750-mutation-specifikt antistof (6B6) kunne registrere 69 af de 86 sager med en E746 -A750 deletionsmutation (40 med score 2+ og 29 med score 3+), hvorimod det var negativ i de resterende 17 sager (4 med score 0 og 14 med score 1+) (κ = 0,584, følsomhed: 80,23%, specificitet: 85,3%, PPV: 60%, NPV: 94.01%); den L858R mutationen-specifikt antistof (43B2) kunne identificere 53 af 70 sager med en L858R punktmutation (31 med score 2+ og 22 med 3+), mens den var negativ i de resterende 17 sager (7 med score 0 og 10 med score 1+) (κ = 0,639, følsomhed: 75,71%, specificitet: 91,79%, PPV: 66,25%, NPV:. 94,67%)

desuden har vi opdaget også total EGFR i alle 399 sager, anvendelse af monoklonalt antistof mod EGFR. Resultaterne viste 27 sager blev scoret 0, 38 sager blev scoret 1+, 193 sager blev scoret 2+, og 141 sager blev scoret 3+. EGFR monoklonalt antistof (D38B1) adskiller sig fra de to mutationsspecifikke antistoffer. DelE746-A750 mutationen-specifikt antistof (6B6) specifikt kan genkende EGFR proteiner med en E746-A750 deletionsmutation i exon 19 og L858R mutation-specifikt antistof (43B2) er i stand til specifikt at identificere EGFR protein med en L858R punktmutation i exon 21; i modsætning hertil EGFR monoklonalt antistof (D38B1), som ikke er en mutation-specifikt antistof, viser det samlede EGFR-proteinet uanset mutationen status. Selvom total EGFR blev stærkt udtrykt i de fleste tilfælde, var der stadig 38 tilfælde med score 1+ og 27 tilfælde med score 0, hvor 12 sager blev testet positive for EGFR genmutationer ved molekylær metode. Dette kan forklares ved, at niveauerne af total EGFR i tumorceller er så lave, at farvningen af ​​de to mutationsspecifikke antistoffer kan være negativ i nogle tilfælde, selv om de har EGFR genmutationer, der opdages (som vist i figur S1). Derfor detektere niveauet af total EGFR hjælp af EGFR monoklonale antistof (D38B1) kunne forhindre fremkomsten af ​​lignende falsk negative resultater ovenfor, mens følsomheden af ​​delE746-A750 og L858R mutation antistoffer kunne øges til 82,56% og 90% henholdsvis.

Komparativ analyse af IHC-baserede resultater af resektion, biopsi og cytologiprøver

farvningsmønstrene af resektion prøver vha EGFR mutation-specifikke antistoffer blev vist i figur 2. Ifølge vores scorer kriterier, af de 145 resektion prøver, 52 blev scoret 0, hvor 2 tilfælde nærede EGFR-mutationer og mutationen lå kun 3,85% (2/52); 40 tilfælde blev bedømt 1+, hvor der var 10 tilfælde af EGFR-mutationer og mutationen sats var 25% (10/40); 35 sager blev scoret 2+, hvor EGFR-mutationer var til stede i 29 tilfælde, og mutationen sats var 82,56% (29/35); 18 sager blev scoret 3+, hvor 18 sager nærede EGFR-mutationer, og mutationen sats var 100% (18/18). De detaljerede resultater blev vist i tabel 2.

Den samlede EGFR protein i resektion prøver kunne farves med EGFR (D38B1) antistof (A, D og G, 200 ×). Prøver uden EGFR-mutationer blev ikke farvet med to mutation-specifikke antistoffer (B og C, 200 ×). Prøver med E746-A750 deletionsmutation blev farvet med E746-A750 sletning (6B6) specifikt antistof (E, 200 ×), og prøver med L858R mutation blev farvet med L858R mutant (43B2) specifikt antistof (I, 200 ×).

farvende funktioner i biopsiprøver under anvendelse EGFR mutation-specifikke antistoffer blev vist i figur 3. Ifølge vores scorende kriterier, af de 220 resektion prøver, blev 77 tilfælde scoret 0, hvori 6 nærede EGFR mutationer og den mutation sats var 7,79% (6/77); 55 sager blev scoret 1+, hvor 10 tilfælde nærede EGFR-mutationer og mutationen sats var 18,18% (10/55); 60 sager blev scoret 2+, hvor 37 nærede EGFR-mutationer, og mutationen sats var 61,67% (37/60); 28 sager blev scoret 3+, hvor 28 tilfælde nærede EGFR-mutationer, og mutationen sats var 100% (28/28). De detaljerede resultater blev vist i tabel 2.

Den samlede EGFR protein i biopsiprøver kunne farves med EGFR (D38B1) antistof (A, D og G, 40 × og det øverste venstre hjørne 200 ×). Prøver uden EGFR-mutationer blev ikke farvet med to mutation-specifikke antistoffer (B og C, 40 × og det øverste venstre hjørne 200 ×). Prøver med E746-A750 deletionsmutation blev farvet med E746-A750 sletning (6B6) specifikt antistof (E, 40 × og det øverste venstre hjørne 200 ×), og prøver med L858R mutation blev farvet med L858R mutant (43B2) specifikt antistof (I, 40 × og det øverste venstre hjørne 200 ×).

farvning funktioner i cytologi prøver vha EGFR mutation-specifikke antistoffer blev vist i figur 4. Ifølge vores scorende kriterier, af de 34 cytologiprøver, 15 sager blev scoret 0, hvor 2 tilfælde nærede EGFR-mutationer og mutationen sats var 13,33% (2/15); 9 sager blev scoret 1+, hvor 4 tilfælde havde EGFR-mutationer og mutationen sats var 44,44% (4/9); 8 tilfælde blev bedømt 2+, hvori 4 indeholdt EGFR-mutationer, og mutationen sats var 50% (4/8); 2 sager blev scoret 3+, hvor 2 tilfælde nærede EGFR-mutationer, og mutationen sats var 100% (2/2). De detaljerede resultater er vist i tabel 2.

Den samlede EGFR protein i cytologiske prøver kunne farves med EGFR (D38B1) antistof (A, D og G, 400 ×). Prøver uden EGFR-mutationer blev ikke farvet med to mutation-specifikke antistoffer (B og C, 400 ×). Prøve med E746-A750 deletionsmutation blev farvet med E746-A750 sletning (6B6) specifikt antistof (E, 400 ×) og prøver med L858R mutation blev farvet med L858R mutant (43B2) specifikt antistof (I, 400 ×).

Når score 3+ blev anset for at være positiv, specificitet og PPV i IHC-baserede assay var 100% for alle tre typer af enheder. Når nu 0 blev anset for at være negativ, resektion prøver resulterede i den højeste NPV (96,15%), efterfulgt af biopsi prøver (92,21%), og cytologiprøver havde den laveste NPV (88,24%). Hvornår score 0 og 1+ blev anset for at være negativ og score 2+ og 3+ betragtes som positiv, specificitet resektion prøver havde den højeste NPV (93,02%), efterfulgt af biopsi prøver (83,45%), og cytologiprøver havde den laveste NPV (81,82%) (tabel 3).

Der var 12 patienter med både resektion og cytologiprøver i vores prøver, og 6 af dem nærede EGFR mutationer (3 tilfælde af E746-A750 deletionsmutation og 3 tilfælde af L858R punktmutation) ved molekylær-baseret assay. Ved IHC-baseret assay på resektion prøver, 4 af de 6 prøver med EGFR mutationer blev identificeret som havende score på 3+, og de andre 2 blev identificeret som havende en score på 2+. I modsætning hertil på cytologiprøver, kun 1 tilfælde havde en score på 3+ og 1 tilfælde havde en score på 2+, og de andre 4 tilfælde var alle score 1+. I de 6 prøver uden en EGFR mutation, kun 1 tilfælde havde en score på 1+ ved IHC-baseret assay på resektion prøver, og de andre fem prøver havde en score på 0. I modsætning hertil resultater på de tilsvarende cytologiprøver inkluderet en score på 2+ i en sag, score 1+ i en sag, og score 0 i de øvrige 4 tilfælde (tabel 4).

kan påvises diskussion

EGFR-mutationer i NSCLC ved IHC metoder under anvendelse EGFR mutant-specifikke antistoffer. Men på grund af de betydelige forskelle mellem kriterierne for positivitet defineret af forskellige forskergrupper, læserne eller bilinspektionsteknikere kan forveksles med eller endda vildledt af i forbindelse med en praktisk anvendelse af denne metode. Derfor kræves der en mere omfattende forskning for at nå til enighed. Resultaterne af den foreliggende undersøgelse og andre rapporter [15] – [19], [23] viser, at scoring kriterier baseret på farvningsintensiteten af ​​membranen og /eller cytoplasma af tumorceller og procentdelen af ​​farvningen område (som blev delt i fire kvaliteter: 0, 1+, 2+ og 3+) kan være den bedste af alle tilgængelige pointsystemer. Aftalen mellem IHC-baserede og molekylær-baserede analyser blev beregnet ved hjælp af Cohen κ i overensstemmelse med forskellige niveauer af immunhistokemisk sortering. Selvom aftalen mellem de 2 testmetoder var højest (κ = 0,644), når score 2+ og 3+ blev betragtet som positive, var der stadig 33 falsk-positive tilfælde (32,04%, 33/103) i score 2 + tilfælde og 24 falsk-negative tilfælde (23,08%, 24/104) i score 1+ tilfælde, hvilket resulterer i en følsomhed på 77,63%, specificitet 86,64%, PPV af 78,14%, og NPV af 86,4%, hvoraf ingen var ideel. Derfor med en molekylær test som en standard, selv om en prøve er klassificeret som positive af IHC metode, den molekylære assay kan det desuden være nødvendigt at kontrollere EGFR mutation status, og således screening af EGFR-mutationer ved IHC synes ikke at være anvendelse. Selv om antallet af falsk-positive tilfælde har været meget få i andre undersøgelser [15] – [19], yderligere molekylær påvisning ikke helt opgivet. I denne undersøgelse, bemærkede vi, at prøver med en score på 3 + havde en perfekt PPV (100%), og score 0 prøver havde en god NPV (93,06%). Hvis en score på 3+ anses for at være et positivt kriterium, kunne patienter med positive prøver ved IHC-baserede assay direkte modtage TKI-terapi uden behov for den kontrol, som en molekylær test. Anvendeligheden af ​​TKI-terapi kunne vurderes hurtigt ved immunhistokemi under anvendelse EGFR mutation-specifikke antistoffer i næsten 50% af alle patienter (dem scoret som 0 eller 3+). Chancen for mutationer i prøverne med en score på 1+ var omkring 23,08%, og en sandsynlighed på ingen mutation i dem var 76,92%, pr vores analyse. Satsen for mutation i prøverne med en score på 2+ var 67,96%, hvilket kraftigt antyder muligheden for en EGFR mutation i denne gruppe. Derefter hvis de anvendes korrekt, screening EGFR mutation status ved immunhistokemi kan have en diagnostisk værdi til terapeutisk beslutningstagning, især i en medicinsk center, der ikke har en kapacitet på molekylær test.

Som anbefalet Wu et al. [22], ekspressionen af ​​total EGFR blev også testet i alle 399 tilfælde i vores undersøgelse. I modsætning til de to mutationsspecifikke antistoffer, EGFR monoklonalt antistof (D38B1) identificerer det totale EGFR-proteinet uanset mutationen status. Fordi niveauerne af total EGFR i visse tilfælde er meget lave, kan de mutante proteiner ikke kunne påvises ved anvendelse af to mutationsspecifikke antistoffer, selv om de tilfælde harbour muterede EGFR-genet (som vist i fig S1). Ikke desto mindre, under anvendelse af EGFR monoklonale antistof (D38B1) i kombination med mutationsspecifikke antistoffer sandsynligvis reduceret falsk-negative resultater pr vores analyse. Med denne tilgang, kan følsomheden af ​​delE746-A750 og L858R mutation-specifikke antistoffer øges til 82,56% og 90% hhv. Følsomheden af ​​L858R mutation-specifikt antistof (43B2) synes højere end delE746-A750-mutation-specifikt antistof (6B6), hvilket er i overensstemmelse med hvad der er blevet rapporteret af Ambrosini-Spaltro A et al [16].

Desuden har vi gennemført en sammenlignende analyse af IHC-baserede resultater på resektion, biopsi og cytologiprøver. Når en score på 2+ blev anset for at være positiv, satsen for falsk-positive værdier for resektion prøver var kun 17,14% (6/35), at antallet af falsk-positive værdier for biopsier og cytologiprøver var 38,33% (23 /60) og 50% (4/8), hhv. Dette fund antydede, at på grund af den mindre mængde af væv og tumorceller end resektion prøver, kan heterogeniteten af ​​tumorceller i biopsi eller cytologiprøver blevet mere fremtrædende, og dermed forårsage en øget variabilitet i testresultaterne. Ud over det begrænsede antal tumorceller i pleural væske (cytologi prøve), sammensætningen af ​​cellulære komponenter var mere kompliceret, som ofte indeholder mange røde blodlegemer, inflammatoriske celler og mesotelceller, og dermed fortynder tumorcellerne. Selvom cytologiprøver kan anvendes til både molekylære-baserede og IHC-baserede assays, sidstnævnte assay tendens til at være mere falsk-negative værdier sammenlignet med vævsprøver (især sammenlignet med resektion prøver). Dette kan forklare en markant nedsat følsomhed af mutant påvisning i cytologiprøver (tabel 3). Derudover har vi undersøgt 12 tilfælde med både resektion og cytologiprøver indsamlet. Af disse 6 nærede EGFR mutationer ved molekylær-baseret assay, og den anden 6 ikke. Når score 3+ blev anvendt som en tærskel, kunne IHC assay identificere 4 ud af de 6 prøver med EGFR mutationer i resektion prøver, men kun registrere 1 tilfælde cytologiprøver. Hvis score ≥2 + blev anvendt, kunne analysen identificere alle de 6 tilfælde med EGFR mutationer i resektion prøver, men opdage kun 2 ud af de 6 tilfælde i cytologiprøver. Disse resultater tyder på, at med hensyn til IHC baseret detektion af EGFR-mutationer, resektion prøver var meget bedre end biopsiprøver, og biopsiprøver var signifikant bedre end cytologiprøver.

I teorien EGFR proteiner på cellemembranen eller i cytoplasma spille forskellige roller i tumorceller og har forskellig interaktion med TKI’er. Derimod kan behandlingen virkninger TKI’er i patienter, som viser en anden subcellulær fordeling af EGFR i tumorceller er ikke blevet godt undersøgt endnu. Som tidligere rapporteret, observerede vi, at EGFR kunne finde på tumorcellemembranen, i cytoplasmaet eller begge på membranen og i cytoplasmaet ved immunohistokemisk analyse. For at bestemme de funktionelle træk ved forskellige subcellulære fordelinger i EGFR proteiner, vi forsøgte at analysere en potentiel sammenhæng mellem EGFR mutation status og subcellulære fordeling af proteinerne, men fandt ud af nogen sammenhæng mellem dem. I stedet farvningsintensitet viser en stærk korrelation med EGFR mutation status. Derfor blev farvningen af ​​”membranen og /eller cytoplasma” ligeligt og i fællesskab overvejet i vores pointsystem.

Den høje aktivitet af EGFR-protein i lungekræft skyldes de aktivering mutationer, men gen-amplificeringer kan også spille en væsentlig rolle. I denne undersøgelse blev 334/399 (83,7%) tilfælde af NSCLC påvist at have forhøjet ekspression af EGFR-protein (≥2 +) ved anvendelse af monoklonalt antistof, satsen meget højere end standard detektion ved genetisk niveau (40,6%). Det er fortsat at blive undersøgt nærmere, hvis denne forhøjede udtryk for EGFR i nogle tilfælde uden påviselige mutationer medieres af ampification sin gen eller andre alternative mekanismer. Hvorvidt TKI’er kan empirisk anvendes på disse patienter skal kontrolleres af yderligere eksperimentelle undersøgelser og kliniske forsøg.

Sammenfattende, ifølge vores analyser af EGFR mutation status ved IHC, patienter med en score på 3 + havde en perfekt PPV (100%), og kan acceptere TKI behandling direkte uden behov for en bekræftende molekylær-baseret assay. Patienter med en score på 0 havde en høj NPV (93,06%). Men prøver med score 1+ eller 2+ er upålidelige og har brug for yderligere kontrol af EGFR mutation status ved molekylær-baserede assay. Derfor, ved at bruge vores diagnostiske algoritme, i næsten halvdelen af ​​alle patienter (patienter med score 0 eller 3+), kunne en anvendeligheden af ​​TKI-terapi bestemmes ved immunhistokemi og mere komplekse, dyre molekylær test undgås. Prøver med score 0 i IHC-baserede assay med de to EGFR mutation-specifikke antistoffer bør yderligere testes for ekspression af total EGFR hjælp EGFR monoklonalt antistof (D38B1), med henblik på yderligere at reducere falsk negativ rate (figur 5). Tag sammen, sammenlignet med at bruge IHC-baserede assay alene, denne integrerede tilgang, der kombinerer IHC- og molekylære assays demonstrerer en højere følsomhed (97,37%), specificitet (100%) og κ-værdi (0,979), og er dermed mere praktisk for patienterne screenes for en eventuel TKI-terapi. Vores diagnostiske algoritme kan potentielt optimere behandlingsmuligheder, reducere omkostningerne og spare tid.

“IHC” henviser til immunhistokemisk analyse.

Støtte oplysninger

figur S1.

Den falske negative mutationen resulterer af IHC grund af det lave niveau af total EGFR. For det samlede EGFR i tumorceller var så lav (A og D, 200 ×) at mutante proteiner kunne ikke påvises med mutationsspecifikke antistoffer i visse tilfælde (B, C, E og F, 200 ×), selv om mutationerne var identificeret ved molekylær-baserede assay i de tilfælde

doi:. 10,1371 /journal.pone.0059183.s001

(TIF)

Tak

undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med den regler for de institutionelle anmeldelse bestyrelser på Kina Medical University.