Der er foretaget
Abstrakt
En stor indsats for at udvikle nye og effektive lægemidler mod kræft i bugspytkirtlen at forbedre behandlingsresultater. Tumor-nekrose faktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) er sådan en terapeutisk cytokin med selektivt drab virkning mod maligne celler. Nogle menneskelige pancreascancer er uløseligt resistente over for TRAIL-medieret apoptose eller terapi. I denne undersøgelse har vi vist, at histondeacetylaseinhibitoren LBH589 kan synergi med TRAIL at forøge apoptose selv i TRAIL-resistente celler. LBH589 faldt c-FLIP niveauer i hver testede cellelinje og survivin niveauer i nogle af de testede cellelinier. Tvungen udtryk for ektopisk c-FLIP, men ikke survivin, afskaffede den kooperative induktion af apoptose ved kombinationen af LBH589 og TRAIL, hvilket indikerer, at c-FLIP nedregulering spiller en kritisk rolle i LBH589 sensibilisering af bugspytkirtelkræftceller til Trail. Desuden LBH589 faldt c-FLIP stabilitet og tilstedeværelsen af proteasominhibitor MG132 forhindrede c-FLIP fra reduktion af LBH589. Tilsvarende vi har registreret forhøjede niveauer af ubiqutinated c-FLIP i LBH589-behandlede celler. Disse data viser således, LBH589 fremmer ubiqutin /proteasom-medieret nedbrydning af c-flip, hvilket fører til nedregulering af c-flip. Kollektivt, LBH589 inducerer c-FLIP nedbrydning og følgelig sensibiliserer bugspytkirtelkræftceller til TRAIL-induceret apoptose, fremhæver en roman terapeutiske regime mod kræft i bugspytkirtlen
Henvisning:. Kauh J, Fan S, Xia M, Yue P, Yang L, Khuri FR, et al. (2010) c-FLIP Nedbrydning formidler Sensibilisering af bugspytkirtelkræftceller til Trail-induceret apoptose ved histondeacetylaseinhibitoren LBH589. PLoS ONE 5 (4): e10376. doi: 10,1371 /journal.pone.0010376
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hongkong
Modtaget: Marts 12, 2010; Accepteret: April 7, 2010; Udgivet: 28 April, 2010
Copyright: © 2010 Kauh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Georgia Cancer Coalition Distinguished Kræft Scholar award (til SY. S.) og afdelingerne forskningsfond (til JK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
kræft i bugspytkirtlen er en af de mest vanskelige kræftformer at behandle, selv om det kun udgør 3% af alle kræfttilfælde. Trods flere kliniske forsøg med nye kemoterapeutiske midler, i løbet af de seneste 25 år den 5-års overlevelse på 5%, og den mediane overlevelse på 6 måneder har stort set været uændret. Den mediane overlevelse er omkring 6 måneder [1], [2]. En årsag til den ringe overlevelse af kræft i bugspytkirtlen er ufølsomhed over for de fleste konventionelle behandlinger, herunder kemoterapi og strålebehandling [3]. Således er et presserende behov for nye og effektive terapeutiske midler eller kure til behandling af kræft i bugspytkirtlen.
Apoptose er en væsentlig del af mekanismer, der opretholder normal vævshomeostase [4]. Deregulering af apoptose maskiner og unddragelse af apoptose er en generel mekanisme i kræft. De fleste kemoterapier virker ved induktion af apoptose. Derfor unddragelse af apoptose er hovedsagelig ansvarlige for de utilstrækkelige nuværende behandlinger [2], [5]. Det er velkendt, at celler kan dø af apoptose primært gennem den extrinsiske dødsreceptor-induceret pathway og /eller den iboende mitokondrier-medieret vej [6]. Aktiveringen af den ydre død receptormedieret apoptotiske vej involverer ligering af en dødsligand (f.eks tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand; TRAIL) med dens tilsvarende celleoverflade død receptor (er) eller aggregering (f.eks trimerisering) af dødsfald receptorer, hvilket fører til dannelsen af død-fremkaldende signaler kompleks (DISC) efterfulgt af den aktiverende spaltning af caspase-8 i skiven. Fordi Bid tjener som en caspase-8 substrat, aktivering af ydre dødsreceptor apoptosecyklus tændes der også for iboende apoptotiske vej [7].
dødsligand TRAIL har for nylig vist sig som potentiel cancer terapeutisk middel, fordi det fortrinsvis inducerer apoptose i transformerede eller maligne celler [8]. Øjeblikket rekombinant human TRAIL er under afprøvning i fase I kliniske undersøgelser. Desuden agonistiske antistoffer mod DR4 og DR5, som direkte aktiverer extrinsiske apoptotiske vej, er også blevet testet i fase I eller II undersøgelser [9]. Således dødsreceptor, især TRAIL død receptormedieret apoptose har været under intens forskning som en cancer terapeutisk mål [10], [11]. Mange prækliniske studier har vist terapeutisk potentiale målrette TRAIL /dødsfald receptor-medieret apoptose i pancreascancer [12] – [20]. Men et vigtigt spørgsmål i denne forbindelse er den iboende modstand af visse cancerceller, herunder bugspytkirtelkræftceller til TRAIL /død receptor-induceret apoptose [17], [18].
Cellular FLICE-hæmmende protein (c- FLIP), som hæmmer caspase-8-aktivering ved at forhindre rekruttering af caspase-8 til DISC, er den primære inhibitor af TRAIL /død receptor-induceret apoptose [21], [22]. Niveauerne af c-FLIP, herunder både FLIP
L og FLIP
S er underlagt regulering af ubiquitin /proteasom-medieret nedbrydning [23] – [25]. Forhøjet c-FLIP-ekspression beskytter celler fra døden receptor-medieret apoptose, hvorimod nedregulering af c-FLIP af kemikalier eller små interfererende RNA sensibiliserer celler til død receptor-medieret apoptose [26]. Overekspression af c-FLIP er blevet foreslået at være nøglen mekanisme underliggende TRAIL modstand i bugspytkirtelkræft [13], [17].
LBH589 (panobinostat) er en pan-histon deacetylase (HDAC) -hæmmer med lovende anticancer aktivitet [27]. Monoterapi aktivitet mod kræft i bugspytkirtlen er blevet påvist i prækliniske forsøgsmodeller [28]. I denne undersøgelse har vi afsløret en hidtil ukendt aktivitet af LBH589, som sensibiliserer bugspytkirtelkræftceller til TRAIL-induceret apoptose. Desuden har vi vist, at LBH589 letter ubiqutin /proteasom-medieret c-FLIP nedbrydning, hvilket fører til forbedring af TRAIL-induceret apoptose i bugspytkirtelkræft.
Materialer og metoder
Reagenser
LBH589 blev leveret af Novartis (Basel, Schweiz). Det opløselige rekombinante humane TRAIL blev indkøbt fra PeproTech, Inc. (Rocky Hill, NJ). Den proteasominhibitor MG132 og proteinsynteseinhibitoren cyclohexemide (CHX) blev erhvervet fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Kanin polyklonalt anti-DR5-antistof blev indkøbt fra Prosci Inc (Poway, CA). Muse monoklonalt anti-DR4-antistof (B-N28) blev indkøbt fra Diaclone (Stamford, CT). Muse monoklonalt anti-caspase-3-antistof blev købt hos IMGENEX (San Diego, CA). Kanin polyklonalt anti-XIAP, anti-caspase-8, anti-Mcl-1, og anti-PARP-antistoffer og monoklonale muse-anti-survivin antistof blev indkøbt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Muse-anti Bcl-2-antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Kanin-anti-GAPDH polyklonalt antistof og muse-anti-Bax monoklonalt antistof blev købt hos Trevigen (Gaithersburg, MD). Muse monoklonalt anti-β-actin-antistof blev indkøbt fra Sigma Chemical Co.
cellelinier og Cellekultur
Humane pankreatiske cancercellelinjer anvendt i dette studie blev indkøbt fra American Type Culture Collection ( Manassas, VA). For etablering bugspytkirtelkræft cellelinjer, der stabilt udtrykker ektopisk c-FLIP eller survivin blev Panc-1 celler inficeret med lentivirus huser lentivirale ekspressionsvektorer af FLIP
L og survivin henholdsvis som tidligere beskrevet [29], [30]. Vi inficerede også celler med lentivirus transporterer Lac Z ekspressionsvektor som en kontrol [29]. Individuelle cellekloner resistente over for blasticidin blev ekspanderet og underkastet screening af ekspressionen af det målrettede protein ved Western blotting. Disse cellelinier blev dyrket i DMSM medium indeholdende 5% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO
2 og 95% luft.
Cell Survival Assay
celler blev podet i 96-brønds celledyrkningsplader og behandlet den næste dag med midlerne angivet. De levedygtige celleantal bestemtes under anvendelse af sulforhodamin B (SRB) assay som tidligere beskrevet [31]. Kombinationsindeks for lægemiddelinteraktion (fx synergi) blev beregnet under anvendelse af CompuSyn software (ComboSyn, Inc .; Paramus, NJ). Den statistiske signifikans af forskelle mellem to behandlinger blev analyseret med dobbeltsidet uparret studerendes
t
tests ved brug af Graphpad InStat 3 software (GraphPad Software, San Diego, CA). Resultaterne blev anset for at være statistisk signifikant på
P
. 0,05
Påvisning af apoptose
Apoptose blev vurderet ved annexin V farvning hjælp annexin V-PE apoptose afsløring kit købt fra BD Biosciences (San Jose, CA) ifølge producentens instruktioner. Vi har registreret også caspaseaktivering ved Western blotting (som beskrevet nedenfor) som en yderligere indikator for apoptose.
Western blot-analyse
helcelle-proteinlysater blev fremstillet og analyseret ved Western blotting som tidligere beskrevet [32], [33].
Immunopræcipitation til påvisning af Ubiqutinated c-FLIP
Panc-1 /FLIP
L-5 celler, som stabilt udtrykker FLIP
L, blev transficeret med HA-ubiquitin plasmid under anvendelse af FuGENE 6-transfektionsreagens (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) ved at følge fabrikantens instruktion. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med LBH589 eller MG132 plus LBH589 i 4 timer og derefter blev lyseret for immunopræcipitering af Flag-flip
L hjælp Flag M2 monoklonalt antistof (Sigma Chemicals) som tidligere beskrevet [34] efterfulgt af påvisning af ubiquitineret FLIP
L med Western blotting hjælp anti-HA-antistof (Abgent, San Diego, Californien)
Resultater
LBH589 sensibiliserer bugspytkirtelkræftceller til Trail-induceret apoptose
.
Vi først bestemmes følsomheden af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer anvendt i denne undersøgelse til TRAIL. Som vist i fig. 1A, viste fire bugspytkirtelkræft cellelinjer differentierede følsomheder: MiaPaCa-2 og Bxpc3 udstillet dosisafhængig reduktion i celle overlevelse på TRAIL behandling og dermed var følsomme over for TRAIL, hvorimod Panc-1 og Capan-2 var resistente over for TRAIL, fordi de viste minimal respons på Trail i form af reduktion i celle overlevelse. Når det kombineres med LBH589 blev forbedrede celledræbende virkninger observeres ikke kun i TRAIL-følsomme celler (f.eks BCPC-3), men også i TRAIL-resistente cellelinier (f.eks Panc-1 og Capan-2), fordi kombinationen af LBH589 og TRAIL var meget mere end alene i faldende overlevelse bugspytkirtelkræftceller (fig. 1B), enten agent. Kombinationsemballagerne indekser for LBH589 (f.eks 12,5 nM) og TRAIL (3,125-26 ng /ml) kombination i de testede cellelinier var 0,5 (. Figur 1C), hvilket indikerer, at LBH589 og TRAIL kombination udøver synergistiske virkninger på faldende celleoverlevelse af bugspytkirtelkræftceller. Desuden har vi detekteres direkte apoptose ved måling annexin V-positive celler og caspase spaltning i celler udsat for LBH589 alene, TRAIL alene og deres kombination. Efter aftale med celle overlevelsesdata, kombinationen af LBH589 og TRAIL var meget mere potent end hvert enkelt middel alene til at inducere kløvning af caspase-9, caspase-8, caspase-3 og PARP (Fig. 2A) og stigende annexin V-positive celler (dvs. apoptotiske celler) (fig. 2B). Specifikt LBH589 og TRAIL alene forårsagede ca. 18% og 21% apoptose, henholdsvis; Kombinationen af LBH589 og TRAIL inducerede ca. 62% apoptose, hvilket naturligvis større end additiv virkning. Tilsammen indikerer disse resultater, at LBH589 sensibiliserer bugspytkirtelkræftceller til TRAIL-induceret apoptose.
A
, De angivne cellelinier blev podet i 96-brønds celledyrkningsplader og behandlet næste dag med de givne koncentrationer af TRAIL i 24 timer. Celleantal blev estimeret ved anvendelse af SRB-assayet. Dataene er midlerne til fire replikate bestemmelser; barer, ± SDS. *,
P
0,01 sammenligne med ubehandlede celler.
B
, De angivne cellelinier podet i 96-brønds celledyrkningsplader blev behandlet med de givne koncentrationer af TRAIL alene, LBH589 alene eller den respektive kombination af LBH og TRAIL i 24 timer. Celleantal blev estimeret ved anvendelse af SRB-assayet. Dataene er midlerne til fire replikate bestemmelser; barer, ± SDS. I Bxpc-3 og Panc-1-celler, hver kombination er signifikant mere effektiv end enten alene TRAIL eller LBH589 alene i faldende celle overlevelse (
P
0,05 eller 0,001). I Capan-2-celler, LBH589 på 50 nM i kombination med 12,5 ng /ml eller 25 ng /ml er signifikant mere effektivt end LBH589 eller TRAIL alene i faldende celle overlevelse (
P
0,001). Så er LBH589 ved 25 nM eller 50 nM kombineret med TRAIL (
P
0,05).
C
, Kombinationer indekser (CIS) blev beregnet på grundlag af de data, der præsenteres i fig. 1B ved hjælp CompuSyn software.
En
, De angivne cellelinier blev behandlet med DMSO kontrol, 50 nM LBH589 25 ng /ml TRAIL alene eller LBH589 plus TRAIL. Efter 16 timer blev cellerne udsat for fremstilling af hel-celle proteinlysater til detektering caspase-spaltning under anvendelse af Western blotting. Casp, caspase; CF, spaltet fragment.
B
, Panc-1 celler blev behandlet med 25 ng /ml TRAIL alene, 50 nM LBH589 alene eller deres kombination i 24 timer. Cellerne blev derefter underkastet måling af apoptose ved hjælp af annexin V-farvning. De procent positive celler i det øverste højre og nederste højre kvadranter repræsenterer den totale apoptotiske cellepopulation.
LBH589 Formindsker Niveauerne af c-FLIP og Survivin i bugspytkirtelkræftceller
For at forstå de mekanismer, hvormed LBH589 sensitizes bugspytkirtelkræft cellelinjer til TRAIL-induceret apoptose, vi først analyseret modulerende virkninger af LBH589 på c-FLIP, DR5, DR4 og TRAIL, der er direkte involveret i reguleringen af TRAIL /død receptor-medieret apoptose , i tre bugspytkirtelkræft cellelinjer. Panc-1 og Capan-2-celler havde højere basale niveauer af c-FLIP (især FLIP
L) end Bxpc-3-celler. Behandling af disse cellelinjer med LBH589 faldt niveauerne af c-FLIP i alle tre cellelinier i en koncentrationsafhængig måde (fig. 3A). Reduktionen c-FLIP forekom ved 3 timer og blev endnu mere udtalt ved 12 timer post og derefter sende LBH589 behandling (fig. 3B). LBH589 ændrede ikke niveauerne af TRAIL i nogen af de testede cellelinier (fig. 3A) og kun minimalt forøget DR5 ekspression i en af de tre testede cellelinier (dvs. Bxpc-3) (fig. 3A og 3B). Disse resultater antyder klart, at c-FLIP donwregulation er en vigtig begivenhed induceret af LBH589.
De angivne cellelinier blev behandlet med forskellige koncentrationer af LBH589 som angivet i 12 timer (
A
) eller med 50 nM LBH589 for de angivne tidspunkter (
B
). Efter behandlingerne blev cellelinjer udsat for udarbejdelse af hel-celle proteinlysater og efterfølgende Western blot analyse til påvisning af de angivne proteiner.
Derudover har vi også undersøgt de modulerende virkninger af LBH589 på andre proteiner, herunder survivin, XIAP, Bcl-2, Mcl-1, og Bax, som regulerer mitokondrierne-medieret apoptose. LBH589 faldt survivin niveauer i Panc-1 og Capan-2-celler, men ikke Bxpc-3-celler (fig. 3A). Tidsforløbsanalyse af survivin niveauer i Panc-1-celler viste, at den markante reduktion survivin forekom ved 12 timer efter LBH589 behandling (fig. 3B). LBH589 ændrede ikke niveauerne af Bax og XIAP i disse cellelinjer; Men det øgede niveauer af Mcl-2 i disse cellelinier samt Bcl-2-niveauer i Bxpc-3-celler (fig. 2A). Tilsammen udgør disse resultater tyder også, at reduktion survivin også kan være en vigtig begivenhed induceret af LBH589.
Tvungen Angivelse af Ektopisk c-FLIP, men ikke Survivin, Beskytter Celler fra induktion af apoptose ved kombinationen af LBH569 og TRAIL
Både c-FLIP og survivin er involveret i reguleringen af TRAIL celle følsomhed [35]. For at bestemme involvering af c-FLIP og survivin nedregulering i sensibilisering af bugspytkirtelkræftceller til TRAIL-induceret apoptose ved LBH589 etablerede vi Panc-1 cellelinjer, der stabilt udtrykte ektopisk FLP
L eller survivin gennem et lentivial ekspressionssystem og derefter undersøgt deres svar til kombinationen af LBH589 og TRAIL. Ekspressionen af ektopisk survivin eller c-FLIP blev antaget ved Western blotting som vist i fig. 4A. Lac Z er et irrelevant protein og her blev anvendt som kontrol. Som påvist ovenfor, at kombinationen af LBH589 og TRAIL effektivt nedsat celle overlevelse i Lac Z- eller survivin udtrykker cellelinjer, men undlod at gøre det i begge cellelinier, der udtrykker ektopisk FLIP
L (fig. 4B), der angiver tvungen ekspression af ektopisk FLIPL, snarere end survivin, bibringer celle resistens overfor augmented induktion af apoptose ved LBH589 og TRAIL kombination. Ved at detektere apoptose, fandt vi, at kombinationen af LBH589 stærkt inducerede kløvning af caspase-8, caspase-9, caspase-3 og PARP i panC-1 cellelinier, som udtrykker Lac Z eller survivin, men kun minimalt i flip
L udtrykkende Panc-1-celler (fig. 5A). Efter aftale, kombinationen af LBH589 og TRAIL forårsagede ca. 79% og 69% af apoptose i Panc-1 /lac Z-1 og Panc-1 /survivin-4-celler, henholdsvis, men kun omkring 25% af apoptose i Panc-1 /FLIPL-5-celler (fig. 5B), yderligere bekræfter, at FLIP
L overekspression giver celle resistens overfor kombinationen af LBH589 og TRAIL. Kollektivt, disse resultater viser, at c-FLIP nedregulering spiller en central rolle i LBH-589-medieret sensibilisering af bugspytkirtelkræftceller til TRAIL-induceret apoptose.
En
, Udtrykket for ektopisk survivin eller c-FLIP i de forskellige trasnfectants som indikeret blev detekteret ved Western blotting med survivin eller c-FLIP antistof.
B
, De givne transfektanter blev podet i 96-brønds plader og behandlet med de angivne koncentrationer af LBH589 alene, 25 ng /ml TRAIL alene eller individuel kombination af LBH589 med TRAIL. Efter 24 timer blev cellerne udsat for SRB-assayet til måling af celleoverlevelse. Dataene er midlerne til fire replikate bestemmelser; stænger; ± SDS. *,
P
0,0001 og #,
P
0,001 sammenlignet med LBH589 behandling alene
De angivne transfektanter blev behandlet uden og med 50 nM. LBH589 plus 25 ng /ml TRAIL (L /T) i 16 timer (
A
) eller 24 timer (
B
). Cellerne blev derefter høstet til fremstilling af hel-celle proteinlysater til detektering caspase og PARP-spaltning under anvendelse af Western blotting (
A
) eller til måling af apoptose ved hjælp af annexin V-farvning (
B
). De procent positive celler i det øverste højre og nederste højre kvadranter repræsenterer den totale apoptotiske cellepopulation.
LBH589 Donwregulates c-FLIP gennem Fremme Ubiqitin /proteasom-medieret Nedbrydning
I betragtning af den kritiske rolle af c-FLIP nedregulering i mediering forstærkning af TRAIL-induceret apoptose ved LBH589 som påvist ovenfor, vi yderligere behandlet, hvordan LBH589 faldt c-FLIP niveauer. Fordi c-FLIP proteiner vides at blive reguleret af ubiquitin /proteasom-medieret nedbrydning [23], [25], derefter bestemt vi, om den observerede nedregulering af c-FLIP ved LBH589 ville være formidlet via denne proces. Således har vi først undersøgt, om LBH589 fremmer c-FLIP nedbrydning. Til dette formål har vi behandlet Panc-1cells med enten DMSO eller LBH589 i 4 timer og derefter vasket væk lægemidlet efterfølgende påfyldning af cellerne med frisk medium indeholdende proteinsynteseinhibitoren CHX. Ved de angivne tidspunkter efter CHX blev cellerne høstet til Western blotting for at analysere c-FLIP nedbrydningshastighed. Som vist i fig. 6A, reduktion eller nedbrydningshastigheden for FLIP
L i LBH589-behandlede celler var tilsyneladende hurtigere end i DMSO-behandlede kontrolceller, hvilket indikerer, at LBH589 faktisk letter c-FLIP nedbrydning. Næste behandlede vi cellerne med LBH589 i fravær og nærvær af proteasominhibitor MG132 og sammenlignes derefter c-FLIP modulation under disse betingelser. Som vist i fig. 6B, LBH589 faldt c-FLIP niveauer i fravær af MG132, men ikke i nærvær af MG132, hvilket antyder, at LBH589-induceret c-FLIP nedbrydning proteasom-afhængig. Ved immunopræcipitation /Western blotting, detekteres vi også de højeste niveauer af ubiqutinated FLIP
L i celler behandlet med LBH589 plus MG132 sammenlignet med celler udsat for LBH589 alene eller MG132 alene (fig. 6C), hvilket indikerer, at HNK øger c-FLIP ubiquitinering . Samlet set konkluderer vi, at LBH589 inducerer ubiquitin /proteasom-medieret c-FLIP nedbrydning, hvilket fører til nedregulering af c-FLIP i humane bugspytkirtelkræftceller.
En
, Panc-1 celler var behandlet med DMSO eller 50 nM LBH589 i 4 timer. Cellerne blev derefter vasket med PBS 3 gange og igen tilført frisk medium indeholdende 10 ug /ml CHX. Ved de angivne tidspunkter efter CHX blev cellerne høstet til fremstilling af hel-celle-proteinlysater og efterfølgende Western blot-analyse. Proteinniveauer blev kvantificeret med NIH Image J software (Bethesda, MA) og blev normaliseret til GAPGH. Resultaterne blev plottet som de relative c-FLIP niveauer sammenlignet med dem på tidspunktet 0 af CHX behandling (nedre panel).
B
, Panc-1 celler blev forbehandlet med 20 pM MG132 i 30 minutter før tilsætning af 50 nM LBH589. Efter co-behandling i 4 timer blev cellerne høstet til fremstilling af hel-celle-proteinlysater og efterfølgende Western blot-analyse.
C
, Panc-1 /flip
L-5-celler, som stabilt udtrykker ektopisk flag-FLIP
L blev transficeret med HA-ubiquitin plasmid under anvendelse FuGENE 6-transfektionsreagens i 24 timer. Cellerne blev derefter forbehandlet med 20 pM MG132 i 30 minutter og derefter co-behandlet med 50 nM LBH589 i 4 timer. Helcelle-proteinlysater blev derefter fremstillet til immunopræcipitation (IP) under anvendelse af anti-Flag-antistof efterfulgt af Western blotting (WB) under anvendelse af anti-HA-antistof til påvisning af ubiquitineret FLIP
L (Ub-FLIP
L) og anti -flag antistof til påvisning af ektopisk FLIP
L.
diskussion
Humane bugspytkirtelkræft tumorer eller cellelinier udviser heterogene reaktioner på TRAIL. Nogle af disse tumorer eller cellelinier er uløseligt ufølsomme for TRAIL-induceret apoptose [17], [18]. I denne undersøgelse har vi præsenteret en hidtil ukendt konstatering, at histondeacetylaseinhibitoren LBH589 effektivt forøger TRAIL-induceret apoptose i humane bugspytkirtelkræftceller herunder dem resistente over for TRAIL-induceret apoptose. I betragtning af at LBH589 viser anticancer aktivitet i prækliniske bugspytkirtlen kræftmodeller [28], samt at tumoren-selektive TRAIL er en potentiel kræft terapeutisk protein og bliver testet i fase I kliniske studier, vores resultater berettiger yderligere evaluering af kombinationen af LBH589 og TRAIL som et potentielt terapeutiske regimener mod bugspytkirtelkræft i dyremodeller og i kliniske forsøg.
Både survivin og XIAP er foreslået for at regulere TRAIL-medieret apoptose [12], [36], [37]. Nogle HDAC-hæmmere, såsom natriumbutyrat og LAQ824 blev rapporteret at forøge TRAIL-induceret apoptose involverer donwregualtion af survivin og XIAP [38], [39]. En nylig undersøgelse har foreslået, at LBH589 forbedrer TRAIL-induceret apoptose ved nedregulering af XIAP i mesotheliom celler [40]. I vores undersøgelse fandt vi, at LBH589 faldt survivin niveauer to (dvs. Panc-1 og Capan-2) af tre testede bugspytkirtelkræft cellelinier, men ikke åbenbart ændre niveauerne af XIAP (fig. 3). Desuden tvungen ekspression af ektopisk survivin ikke giver resistens over for LBH589 /TRAIL-induceret apoptose (fig. 4 og 5). Således survivin og XIAP er usandsynligt, at være involveret i regulering af LBH589-medieret sensibilisering af TRAIL-induceret apoptose i bugspytkirtelkræftceller.
Bcl-2 familiemedlemmer såsom Bcl-2 og Mcl-1 har også været foreslået i regulering af TRAIL-induceret apoptose [14], [35]. Andre HDAC-inhibitorer kan forbedre TRAIL-induceret apoptose i forskellige cancerceller involverer modulering af Bcl-2-familiemedlemmer såsom nedregulering af Bcl-2 og Bcl-X
L og opregulering af Bax og Bim [39], [41] – [ ,,,0],44]. I vores undersøgelse, havde LBH589 ikke ændre Bax niveauer. Uventet LBH589 forøgede niveauerne af Bcl-2 og Mcl-1 (fig. 3). Således modulering af disse proteiner er sandsynligvis ikke forbindes med LBH589-medieret forstærkning af TRAIL-induceret apoptose i disse cellelinier; snarere stige i Bd-2 og Mcl-1 kan modvirke LBH589 effekt i sensibiliserende bugspytkirtelkræftceller til Trail-induceret apoptose. Således kan yderligere optagelse af et Bcl-2 eller Mcl-1 hæmmer til dette regime resultere i endnu mere effektiv anticancer effekt end kombinationen af LBH589 og TRAIL og bør undersøges nærmere.
DR5 induktion og c-FLIP nedregulering er vigtige mekanismer bag lægemiddel-medieret forstærkning eller overfølsomhed af TRAIL-induceret apoptose [45]. I vores undersøgelse fandt vi, at LBH589 enten ikke eller kun svagt forøget DR5 udtryk i bugspytkirtelkræft cellelinjer (fig. 3), hvilket tyder på, at DR5 modulation har en begrænset rolle i LBH589-medieret sensibilisering af TRAIL-induceret apoptose i disse celler. c-FLIP niveauer er blevet foreslået at være forbundet med følsomheden af bugspytkirtelkræftceller at TRAIL-induceret apoptose; specifikt blev højere niveauer af c-FLIP påvist i TRAIL-resistente bugspytkirtelkræft cellelinjer sammenlignet med de TRAIL sensitive celler [17]. Inhibering af c-FLIP med en lille interfererende RNA eller et lille molekyle sensibiliserer bugspytkirtelkræftceller til TRAIL-induceret apoptose [13], [17]. Desuden har andre HDAC-inhibitorer, såsom LAQ824, MS-275, FR901228, valproinsyre og droxinostat blevet vist at nedregulere c-FLIP niveauer og forbedre dødsreceptor apoptose [46] – [52]. I vores undersøgelse fandt vi også, at TRAIL-resistente cellelinier Panc-1 og Capan-2 havde højere basale niveauer af c-FLIP end TRAIL-sensitive cellelinje (Bxpc-3) (fig. 3A). Ligesom andre HDAC-hæmmere, LBH589 faldt c-FLIP cellelinjer i disse tre testede cellelinier; Dette c-FLIP nedregulering er en hurtig begivenhed, fordi reduktion c-FLIP blev påvist, selv ved 3 h efter LBH589 behandling (fig. 3). Vigtigt er, tvungen ekspression af ektopisk c-FLIP (dvs. FLIP
L) afskaffes LBH589 evne til at forbedre TRAIL-induceret apoptose (fig. 4 og 5). Tilsammen indikerer disse resultater, at nedregulering af c-FLIP er kritisk for LBH589-medieret overfølsomhed af bugspytkirtelkræftceller at TRAIL-induceret apoptose.
c-FLIP vides at være reguleret af ubiquitin /proteasom-medieret nedbrydning [ ,,,0],23], [24]. Tidligere undersøgelser har vist, at c-FLIP nedregulering fremkaldt af visse HDAC-inhibitorer forekommer ved mRNA-niveau [39], [51]. Hvordan HDAC-hæmmere nedregulerer c-FLIP-niveauer er ikke fuldt belyst. I vores undersøgelse fandt vi, at LBH589 lettet c-FLIP nedbrydning som demonstreret i CHX chase assay. Tilstedeværelsen af proteasominhibitor MG132 forhindrede c-FLIP fra reduktion induceret af LBH589. Desuden LBH589 forøgede niveauerne af ubiquitineret c-FLIP (fig. 6). Således indikerer disse resultater, at LBH589 letter ubqitin /proteasom-medieret c-FLIP nedbrydning, hvilket resulterer i c-FLIP nedregulering. Så vidt vi ved, er konstateringen af c-FLIP nedbrydning eller nedregulering af LBH589 er ny og garanterer yderligere undersøgelse af, hvordan hæmning af histon deacetylase fører til c-FLIP nedbrydning.
De maksimale koncentrationer af LBH589 plasma i humane cancerpatienter spænder fra 200 nM til 1300 nM, afhængigt af testede doser [53]. Koncentrationerne af LBH589 anvendes i vores undersøgelse, der nedregulerer c-FLIP og forbedre TRAIL-induceret apoptose er mellem 12,5 nM og 100 nM og dermed inden klinisk opnåelige interval. Derfor er den fremtidige kliniske test af kombinationen berettiget.
Tak
F.R. Khuri og S-Y. Sun er Georgia Cancer Coalition Distinguished Kræft Lærde.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.