Abstrakt
Enhancer af Zeste 2 (EZH2) protein er blevet rapporteret til at stimulere cellevækst i visse kræftformer, og derfor anses for at repræsentere en interessant ny mål for terapeutisk intervention. Her undersøgte vi en mulig rolle EZH2 for væksten styring af tyktarmskræft celler. RNA-interferens (RNAi) medieret intracellulær EZH2 udtømning førte til cellecyklus arrest i coloncarcinomaceller ved G1 /S overgang. Dette blev associeret med en reduktion af celletal ved transient transfektion af syntetisk
EZH2
-targeting siRNA’er og med inhibering af deres kolonidannelse kapacitet på stabil ekspression af vektor-bårne siRNA’er. Vi testede endvidere om EZH2 kan undertrykke den væksthæmmende
p27
gen, som rapporteret for kræft i bugspytkirtlen. Men udtryk analyser af tyktarmskræft cellelinjer og tyktarmskræft biopsier viste ikke en konsistent sammenhæng mellem EZH2 og P27 niveauer. Desuden EZH2 udtømning ikke igen fremkalde
p27
udtryk i colon cancerceller, hvilket indikerer, at
p27
undertrykkelse EZH2 kan være celle- eller vævsspecifik. Hele genom transkriptom analyser identificerede cellulære gener ramt af EZH2 udtynding i tyktarmskræft cellelinjer. De omfattede flere cancer-associerede gener forbundet med cellulær proliferation eller invasion, såsom
Dag1
,
MageD1
,
SDC1
,
Timp2
, og
Tob1
. Afslutningsvis vores resultater viser, at EZH2 nedbrydningen blokerer væksten af colon cancerceller. Disse resultater kan give fordele til behandling af tyktarmskræft
Henvisning:. Fussbroich B, Wagener N, Macher-Goeppinger S, Benner A, Fälth M, Sültmann H, et al. (2011) EZH2 Nedbrydning Blocks Spredningen af Colon kræftceller. PLoS ONE 6 (7): e21651. doi: 10,1371 /journal.pone.0021651
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
Modtaget: Februar 2, 2011; Accepteret: 4 juni 2011; Publiceret: 13 jul 2011
Copyright: © 2011 Fussbroich et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Enhancer af Zeste Homolog 2 (EZH2) protein er et centralt element i Polycomb Repression Complex2 (PRC2) og modificerer transkription på epigenetiske niveau ved at påvirke histon og DNA methylering [1]. EZH2 overudtrykkes i flere maligne lidelser, inklusive store humane cancere, såsom prostatacancer, brystcancer, pancreascancer, renalcellecarcinom, eller livmoderhalskræft [2] – [6].
Der er eksperimentelt bevis, at
EZH2
kan bidrage direkte til carcinogenese ved at fungere som en
bona fide
onkogen. Specifikt for visse cancerformer enheder, er det blevet rapporteret, at EZH2 stimulerer celleproliferation, blokerer apoptose, fremmer celle invasion og metastase, aktiverer tumorangiogenese, og inducerer tumorer i musemodeller [2] – [11]. Disse resultater antyder, at EZH2 inhibering kan repræsentere et attraktivt roman strategi for epigenetisk cancerterapi [1], [12].
For nylig er der imidlertid også data tyder på, at EZH2 kunne fungere som en tumorsuppressor protein i visse væv [13]. Homozygot inaktiverende
EZH2
mutationer blev påvist i en del af myeloide maligniteter [14], [15], øge muligheden at EZH2 enten kan udøve pro- eller anti-onkogene aktiviteter, i en celletype-afhængig måde [ ,,,0],16]. En anden niveau af kompleksitet er tilføjet af påvisning af heterozygote
EZH2
mutationer i en del af lymfomer af germinal-center oprindelse [13]. I dette tilfælde fremkommer det mutante protein for at øge niveauet af H3K27 methylering, en kritisk nedstrømsmål af EZH2, ved at virke sammen med vildtype-proteinet udtrykt fra den ikke-muterede allel [17].
Tyktarmskræft er den fjerde mest almindelige kræftform hos mennesker. Hvert år vil mere end 1.200.000 personer udvikle sygdommen og over 600.000 vil dø af det [18]. På trods af den høje biomedicinsk betydning af denne tumor, undersøgelser af EZH2 status og funktion i kolon kræftceller er sparsomme og til dels selvmodsigende. For eksempel, mens EZH2 konsekvent blev rapporteret at være overudtrykt i tyktarmskræft, EZH2 ekspressionsniveauerne korrelerede positivt [19], en negativ [20], [21], eller slet ikke [22], med overlevelse af patienter med tyktarmskræft. Desuden til vores viden, kun en funktionel undersøgelse undersøgte rolle EZH2 for væksten af tyktarmskræft celler, men kunne ikke se en effekt på
EZH2
gendæmpning [22]. Dette fund er i stærk kontrast til den vækstfremmende rolle EZH2 rapporteret for adskillige andre kræft enheder [2] – [6]. I det foreliggende arbejde, vi behandlet dette spørgsmål ved at analysere EZH2 ekspression i kolon kræftceller
in vitro
in vivo
, og ved at undersøge bidrag EZH2 til væksten i kolorektal cancer cellelinjer .
Resultater
Angivelse af EZH2 i tyktarmskræft celler
in vitro
og RNA-interferens-medieret
EZH2
undertrykkelse
for at undersøge ekspressionen af EZH2 i tyktarmskræft celler
in vitro
analyserede vi et panel af tolv tumorafledte tyktarmskræft cellelinier ved immunblotting og QRT-PCR. Alle testede cellelinier udtrykte let påviselige mængder af EZH2 protein (figur 1A) og
EZH2
mRNA (figur 1B). Til efterfølgende RNA-interferens (RNAi) analyser, genereret vi tre syntetiske siRNA’er rettet mod forskellige regioner i
EZH2
udskrift. Alle tre siRNA’er effektivt blokeret EZH2 ekspression (figur 1C). Da potentielle off-target effekter af de enkelte siRNA’er kan reduceres ved siRNA samle [23], [24], vi også testet en pulje bestående af alle tre
EZH2
-targeting siRNA’er. Denne siRNA pool også effektivt blokeret EZH2 ekspression (figur 1C) og blev anvendt til yderligere funktionelle analyser.
En Immunoblotanalyse af EZH2 proteinekspression. Tubulin, lastning kontrol. B QRT-PCR-analyser af
EZH2
mRNA-ekspression. Data er præsenteret som fold forskelle i genekspression, normaliseret til en husholdning gen indeks. Standardafvigelser fra to reverse transskription replikater er angivet. C Modulering af EZH2 protein ekspression ved RNAi. EZH2 ekspression blev bestemt ved immunoblotanalyse 48 timer efter transfektion med
EZH2
-targeting siRNA’er eller kontrol siRNAs, som angivet. siEZH2pool: poolet
EZH2
-targeting siRNA’er. Tubulin, lastning kontrol.
EZH2
undertrykkelse resultater i G1 anholdelse og væksthæmning af kolon kræftceller
Næste, vi testede effekten af RNAi-medieret
EZH2
undertrykkelse på væksten af HCT116, LoVo, og DLD1 kolorektal kræftceller. siRNA-behandling resulterede i en kraftig reduktion af EZH2 niveauer i alle testede coloncarcinom cellelinier og, som tidligere rapporteret for andre celler [7], i et ledsagende fald af cyclin D1-ekspression (figur 2A).
A immunoblot analyser af HCT116, DLD1, og LoVo-celler udviser effektiv nedregulering af EZH2 ekspression ved RNAi. Cyclin D1-niveauer er vist. Tubulin, lastning kontrol. B-celle-cyklus analyser ved FACS. Cellerne blev behandlet med to kontrol siRNAs eller med
EZH2
-targeting siRNA’er. Procentdele af celler i G1, S eller G2 /M-faser af cellecyklus er vist. C Udarbejdelse af cellecyklus analyser fra tre uafhængige forsøg. Standardafvigelser er vist. Stjernerne lige p ≤ 0,05, dobbelt asterisk lige p≤0.01, N.S. ikke signifikant.
Cell cyklus analyser ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) blev udført parallelt. De viste en statistisk signifikant stigning i G1 befolkninger og en samtidig reduktion i S-fase befolkninger, på
EZH2
undertrykkelse. Typiske FACS kurver er vist i figur 2B, er en samling af resultaterne af tre uafhængige forsøg er afbildet i figur 2C. Disse resultater viser, at
EZH2
undertrykkelse inducerer cellecyklusstop ved G1 /S grænse, og derfor kan handle antiproliferativ i tyktarmen kræftceller.
For yderligere at løse dette problem, celletal analyser af tyktarmskræft cellelinier blev udført. RNAi-medieret hæmning af
EZH2
udtryk ført til en betydelig reduktion af celletal, som var klart synlig 48-72 timer efter transfektion af syntetiske siRNA’er (figur 3A), hvilket indikerer, at
EZH2
lyddæmpning resulterer i væksthæmning af kolon kræftceller.
En celle tæller efter transient transfektion med syntetisk kontrol siRNA (sicontr-1) eller
EZH2
-targeting siRNA’er (siEZH2 pool). Grafer repræsenterer relative celletal, på de angivne tidspunkter efter siRNA transfektion. Cell-numre på transfektion (tidspunkt 0) blev sat til 1,0. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer, er standardafvigelser indikeret. Stjernerne lige p ≤ 0,05, N.S. ikke signifikant. B kolonidannelse assays. HCT116, LoVo, DLD1, og RKO celler blev stabilt transficeret med plasmider der udtrykker to forskellige shRNAs mod
EZH2
(pCEP-shEZH2-1, pCEP-shEZH2-2) eller to kontrolgrupper shRNAs (pCEP-shluc eller pCEP- shcontr-1). Forsøgene blev uafhængigt gentages mindst tre gange, med ensartede resultater.
For at validere antiproliferative effekt af
EZH2
hæmning i colon cancerceller af en uafhængig metode, vi udførte kolonidannelse analyser. To forskellige
EZH2
-targeting siRNA’er stabilt udtrykt fra valgbare ekspressionsvektorer i HCT116, LoVo, DLD1, og RKO celler, for 13 til 15 dage. Begge
EZH2
-targeting siRNA’er ført til en klar reduktion af kolonidannelse kapacitet for alle testede tyktarmskræft cellelinjer versus kontrol siRNA-behandlede celler (figur 3B). Morfologiske aspekter, FACS profiler, og terminal deoxynukleotidyltransferase dUTP nick ende mærkning (TUNEL) analyser gav ikke evidens for øget apoptose af tyktarmskræft celler på RNAi-medieret
EZH2
undertrykkelse (data ikke vist).
tilsammen indikerer disse resultater, at EZH2 udtømning inducerer cellecyklusstop i G1 fasen og hæmmer væksten af tyktarmskræft celler.
Tissue Micro Array analyse af EZH2 udtryk i kolon adenomer og kræft
Tidligere undersøgelser har vist, at EZH2 signifikant overudtrykt i tyktarmskræft sammenlignet med normal colon væv [19] – [22]. Men data sammenligning EZH2 udtryk i benigne kolon adenomer versus tyktarmskræft er, at vi ved, endnu ikke. Vi udførte derfor immunhistokemisk analyser anvender et væv microarray omfatter 24 adenomer, 25 G1 carcinomer, 24 G2 carcinomer, og 24 G3 carcinomer. I forhold til kolon adenomer blev EZH2 udtryk steget betydeligt i coloncarcinomer (fig. 4A og 4B). Analyser af tyktarmskræft repræsenterer forskellige grader af histologiske dedifferentiering (stigende fra G1-G3) viste en tendens til en yderligere forøgelse af EZH2 ekspression for mindre differentierede cancere, som dog ikke var statistisk signifikant (figur 4B).
En immunhistokemisk analyser af kolon adenomer og tyktarmskræft biopsier repræsenterer stigende grader af histologiske dedifferentiering (G1-G3). Sorte pile: carcinoma; hvide pile: bindevæv. Målestokke 50 uM. B Box plot af EZH2 proteinekspression. Ekspressionsniveauer af EZH2 blev forøget betydeligt i karcinomer sammenlignet med adenomer (p 0,001). Forskelle til EZH2 udtryk mellem G1, G2, og G3 karcinomer var ikke signifikant (p = 0,185).
EZH2 og p27-ekspression ikke korrelerer i tyktarmskræft
cyklin-afhængige kinase inhibitor p27 (også kaldet Kip1) er et vækstinhiberende protein, der blokerer cellecyklusprogression ved G1 /S overgang [25]. I tyktarmskræft, P27 niveauer er ofte lavt [26], [27]. Interessant, det var for nylig rapporteret, at EZH2 udtømning førte til p27 re-udtryk i bugspytkirtelkræftceller, hvilket indikerer, at EZH2 kan bidrage til tumorcelleproliferation ved at undertrykke
p27
[4]. På baggrund af vores resultater, at EZH2 fremmer celledeling og stimulerer G1 /S cellecyklusprogression af kolon kræftceller, vi behandlet spørgsmålet om, hvorvidt
p27
undertrykkes af EZH2 i tyktarmskræft så godt.
Immunohistokemisk analyser afslørede, at tyktarmskræft udviser signifikant formindsket nuklear p27 og en tendens til reduceret cytoplasmatisk P27 proteinniveauer (figur 5A), når man sammenligner med kolon adenomer. Inden for cancer gruppen, stigende grader af kræft celle dedifferentiation (G1-G3) viste en statistisk ikke-signifikant tendens til et yderligere fald i p27-ekspression (figur 5A). Generelt er disse resultater er modsat til resultaterne opnået for EZH2 ekspression (figur 4B), øge muligheden at EZH2 niveauer negativt kan korrelere med P27 niveauer. Men EZH2 og P27 niveauer ikke signifikant korrelerer i individuelle cancere (n = 68) på en per patient basis, dvs. i tumorer afledt fra den samme patient (figur 5B). Denne mangel på sammenhæng anvendt til at analysere EZH2 beløb i forhold til såvel nukleare eller cytoplasmatiske niveauer p27 udtryk (Spearman rang korrelationskoefficienter r = 0,187, p = 0,572 og r = -0,0623, p = 0,613, henholdsvis).
A Box plots af nukleare og cytoplasmatisk p27 protein ekspression i colon adenomer og karcinomer (G1-G3). Ekspressionsniveauer af nukleare p27 var signifikant lavere hos carcinomer end i adenomer (p = 0,026), viste cytoplasmatiske P27 niveauer en lignende tendens, som dog ikke var statistisk signifikant (p = 0,173). Forskelle til p27 udtryk mellem G1, G2, og G3 karcinomer var ikke signifikant. B immunhistokemisk farvning af parrede prøver af tyktarmskræft viste ikke en signifikant sammenhæng mellem EZH2 og p27 ekspressionsniveauerne. Eksempler på 4 forskellige cancere (I-IV) farvet for EZH2 (øverste paneler) og P27 (lavere paneler) henholdsvis. Scale barer, 50 um.
I tråd med disse
in vivo
fund, de basale niveauer af EZH2 proteinekspression ikke konsekvent korrelere med p27 protein eller mRNA-niveauer i tyktarmskræft celle linjer
in vitro
(figur 6A og 6B). Vi undersøgte også, om p27 ekspressionsniveauerne påvirkes af EZH2 udtynding i HCT116, LoVo, og DLD1 tyktarmskræft celler. Hvis EZH2 blokerer p27 udtryk, lyddæmpning af
EZH2 bør
være knyttet til en re-stigning på p27 udtryk, som er blevet observeret i bugspytkirtelkræftceller [4]. I modsætning hertil er effektiv inhibering af EZH2 ekspression var ikke forbundet med en betydelig stigning i p27-ekspression, hverken på proteinniveauet (figur 6C) eller under mRNA (figur 6D) niveau, i colon cancerceller. Cellular fraktioneringstrin undersøgelser afslørede, at p27 næsten udelukkende lokaliseret i cytoplasmaet, i HCT116, LoVo, og DLD1 celler. Denne subcellulære fordeling blev heller ikke påviseligt ændret af EZH2 udtømning (figur S1).
En EZH2 og p27 protein ekspression i colon cancer cellelinjer, vurderet ved immunoblot analyser. Tubulin, lastning kontrol. B
p27
mRNA-ekspression, målt ved QRT-PCR-analyser. Data er præsenteret som skillelinjen forskelle i genekspression, normaliseret til en husholdning gen indeks. Standardafvigelser fra to reverse transskription replikater er angivet. C immunoblotanalyser efter EZH2 tømt af RNAi. EZH2 og P27 niveauer er angivet. Tubulin, lastning kontrol. D QRT-PCR-analyser efter EZH2 tømt af RNAi.
p27
EZH2
mRNA-niveauer er angivet i forhold til sicontr-1-behandlede celler (arbitrært sat til 1,0). Standardafvigelser af tre uafhængige forsøg er angivet.
transkriptom Analyser af Colon Cancer Cells upon EZH2 udtømning
For at identificere mulige målgener ramt af EZH2 udtynding i colon cancerceller, transkriptom analyser blev udført. Til dette formål blev LoVo og DLD1 celler behandlet enten med siRNA pool lyddæmpning
EZH2
udtryk eller med kontrol siRNA. Ændringer i ekspressionsniveauerne af cellulære gener blev vurderet ved anvendelse af en genom-dækkende microarray på ca. 25.000 gener. Vi observerede signifikante ændringer af 2.235 gener i DLD1 (1.095 opreguleres, 1140 nedreguleret) (tabel S1) og af 379 gener i LoVo (280 opreguleres, 99 nedreguleret) (tabel S2). Overlappet bestod af 139 gener, der blev ramt af EZH2 udtømning i både tyktarmskræft cellelinier (100 opreguleres, 39 nedreguleret). En Heatmap visualisere disse 139 differentielt regulerede gener er tilvejebragt i figur 7A, hvilket indikerer høj overensstemmelse mellem de biologiske replikater. En detaljeret liste over disse gener er angivet i tabel S3.
En Venn-diagram og varmekort af 139 gener, der blev væsentligt påvirket på udskrift niveau ved EZH2 udtømning i både LoVo og DLD1 celler. Heatmaps blev dannet ved anvendelse hierarkisk klyngedannelse. Celler blev enten behandlet med siEZH2pool eller sicontr-2. Fire biologiske replikater blev analyseret for hver prøve. Betydeligt opreguleres gener er angivet i gul, hvilket er betydeligt nedreguleret gener i blåt. B QRT-PCR-analyser for at vurdere ekspressionen af fem gener, der var berørt af EZH2 udtynding i transkriptomet analyse (se ovenfor). Angivet er resultaterne fra tre uafhængige eksperimenter udført i DLD1 celler. mRNA-niveauer er vist i forhold til sicontr-2-behandlede celler (arbitrært sat til 1,0). Standardafvigelser er vist. Stjernerne lige p ≤ 0,05, dobbelt asterisk lige p≤0.01.
Funktionel annotation af de 139 gener ved Ingenuity Pathway Analyse viste, at 37 genprodukter har været forbundet med kræft (tabel 1). Med hensyn til de molekylære og cellulære funktioner, blev EZH2 udtømning sig at påvirke flere gener involveret i kontrollen af cellulære udvikling, kontrol vækst, cellulære bevægelse, og signalering (tabel 1).
For at validere array-data, analyserede vi ekspressionen af 5 cancerassocierede gener, som blev induceret af EZH2 udtynding i transkriptomet analyser, ved QRT-PCR: (i)
Dag1
(Dystroglycan 1) koder for et adhæsionsmolekyle, der ofte underexpressed i tyktarmskræft [28], (ii)
MageD1
(melanom-associeret antigen familie protein-D1) koder for en inhibitor af proliferation og tumorcelleinvasion [29], (iii)
SDC1
(Syndecan 1), der koder for et celleoverflade proteoglycan som inhiberer celleinvasion [30], (iv)
Timp2
(TIMP metallopeptidase inhibitor 2), der koder for en inhibitor af matrixmetalloproteinaser hvis nedregulering korrelerer med den invasive potentiale LoVo tyktarmskræft celler [31], og (v)
Tob1
(Transducer i ErbB2), der koder for en antiproliferativ protein med tumor undertrykkende potentiale [32]. Som observeret for microarray, blev alle 5 gener også signifikant induceret af EZH2 udtømning i QRT-PCR-analyse (figur 7B), yderligere bestyrke transkriptomet data.
Discussion
I den foreliggende undersøgelse viser vi, at EZH2 udtynding i colon cancerceller (i) reducerer cellecyklusprogression ved G1 /S grænsen, (ii) falder celletal i kortsigtede vækstassays, og (iii) blokerer cellevækst i de lange kolonidannelse assays . Disse resultater er i overensstemmelse med en vækstfremmende rolle for EZH2 i tyktarmskræft og er i modsætning til en nylig rapport indikerer, at væksten af tyktarmskræft celler ikke påvirkes af siRNA-medieret EZH2 udtømning [22].
En mulig forklaring på denne forskel kan være relateret til de anvendte assays til måling af cellevækst. Den tidligere undersøgelse påberåbte MTT-assayet, der måler et metabolisk aktivitet (reduktion af MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid til formazan) [22]. Dette assay kan påvirkes af mange forhold, fx metaboliske ændringer, og kan føre til undervurdering af væksthæmmende virkninger [33] – [35]. i modsætning hertil i nærværende undersøgelse, antiproliferative virkninger efter
EZH2
lyddæmpning blev konsekvent observeret i tre . uafhængige analyser Vores resultater tyder således at EZH2 stimulerer spredning af tyktarmskræft celler, som er blevet rapporteret i flere andre kræft enheder [2] -. [9], [11] Salg
de nøjagtige molekylære mekanismer hvordan EZH2 stimulerer celledeling er stadig stort set ukendt. som et afgørende element i den PRC2 transskriptionsrepressor kompleks, kan EZH2 føre til undertrykkelse af antiproliferative gener. en interessant undersøgelse for nylig viste, at EZH2 fører til undertrykkelsen af den væksthæmmende
p27
cellecyklus regulator gen i bugspytkirtelkræftceller [4]. Da P27 virker ved G1 /S overgang – som vi fandt at blive påvirket af
EZH2
tavshed i kolon kræftceller – og da P27 niveauer er ofte lavt i tyktarmskræft [26], [27], vi testede en mulig sammenhæng mellem EZH2 og p27 niveauer
in vivo
in vitro
.
Men sammenlignende analyser af EZH2 og p27-ekspression ikke udviser en statistisk relevant positiv eller negativ kobling i tyktarmskræft
in vivo
, på en per patient grundlag. Desuden har EZH2 udtømning ikke resultere i en re-udtryk for P27 i tyktarmskræft cellelinjer
in vitro
, på tidspunkter hvor det resulterede i stærkt forøget p27-ekspression i bugspytkirtelkræft cellelinjer [4]. Disse resultater viser, at – i modsætning til situationen i bugspytkirtelkræftceller – P27 niveauer er ikke kritisk reguleret af EZH2 i kolon kræftceller. Således kan spektret af EZH2 målgener variere i et vævs- eller celle-specifik måde.
For at få indblik i spektret af gener, der er berørt af EZH2 udtynding i tyktarmen kræftceller, vi udførte hele genomet transkriptom analyser i DLD1 og LoVo celler. Blandt de 139 gener, som i væsentlig grad er påvirket i begge cellelinier over en fjerdedel vides at være cancerassocieret. Spektret af berørte gener er i overensstemmelse med den hypotese, at EZH2 er en vigtig faktor for udvikling, spredning kontrol, signalering, og bevægelse /invasion [1], [36]. Yderligere arbejde er påkrævet for at analysere de nøjagtige mekanismer, som EZH2 kan ændre udtryk for disse gener, og at studere i detaljer deres mulige bidrag til væksten deregulering af kolon kræftceller. Vi bekræftede array data ved ekspressionsanalyse af 5 gener ved QRT-PCR:
Dag1
,
MageD1
,
SDC1
,
Timp2
, og
Tob1
. I overensstemmelse med transkriptomet analyse,
EZH2
lyddæmpning forøget ekspression af alle 5 gener i QRT-PCR-analyser så godt. Disse resultater tyder på, at EZH2 kan undertrykke disse gener enten direkte eller indirekte, i tyktarmen kræftceller. Alle 5 gener er rapporteret at udvise antiproliferativ og /eller antiinvasive potentiale [28] – [32] og deres nedregulering ville således være i overensstemmelse med en mulig onkogen effekt af EZH2 i tyktarmskræft
På grund af vækstfremmende. rolle EZH2 i forskellige kræftformer, er inhibering af EZH2 øjeblikket diskuteret som en attraktiv roman strategi til cancerterapi [1], [12]. Faktisk
EZH2
hæmning af siRNA’er, eller udtynding af PRC2 komponenter med narkotika 3-deazaneplanocin A (DZNep), udøvede antioncogenic effekter, ved at blokere celleproliferation og /eller inducere apoptose [2] – [7], [11], [37], [38], ved at modvirke invasion og metastase [9], [10], og ved at hæmme tumorangiogenese [8].
konstateringen i vores undersøgelse, at EZH2 bidrager til spredning af tyktarmskræft celler udvider spektret af tumor enheder, der kan terapeutisk gavn af EZH2 hæmning til tyktarmskræft. Overvejer EZH2 som et potentielt terapeutisk mål skal imidlertid tage hensyn til, at EZH2 også udtrykkes i normale væv, herunder proliferative cellelag kolon krypter [22]. Vigtigere er det, EZH2 har vist sig at udøve afgørende regulerende funktioner i flere væv, såsom styring af differentieringen af vævsspecifik progenitor og stamceller [39] – [42]. Desuden har den seneste observation, at EZH2 kan virke som en tumorsuppressor i visse hæmatologiske lidelser [14], [15], [16] tyder på, at EZH2 inhibering selv kunne fremme tumorigenese, i nogle væv. Således forstyrrer EZH2 funktion som en terapeutisk strategi bærer risikoen for at fremkalde uønskede bivirkninger og vil sandsynligvis kræve meget specifik levering af EZH2 inhibitorer til deres target-cellerne.
Materialer og metoder
Celler og transfektioner
HCT116, DLD1, LoVo, WiDr, SW620, HCT15, RKO, T84, Caco-2, og Colo205 coloncarcinom cellelinjer var en slags gave fra Dr. M. von Knebel Doeberitz (University of Heidelberg ), SW480 fra Dr. S. Wiemann (tysk Cancer Research center, Heidelberg), og HT29 fra cellen og vævskultur core facilitet i den tyske Cancer Research center, Heidelberg. Celler blev holdt i enten DMEM (pH 7,2), RPMI, eller McCoys medium, suppleret med 10% FCS, 50 enheder /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycinsulfat. Salg
Plasmider blev transficeret ved calciumphosphat-copræcipitation [43] ind i HCT116 celler eller ved Fugene HD (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) i DLD1, LoVo, og RKO-celler. Syntetiske siRNA’er blev transficeret med Dharmafect (Dharmacon, Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO, USA) ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev celler udpladet i 6 cm skåle ved 15% til 25% sammenflydning. Dharmafect 4 og siRNA’er (slutkoncentration på 100 nM) blev begge fortyndet i Opti-MEM I reduceret serummedium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og blandet i et volumen på 400 pi transfektion opløsning.
Plasmider og syntetiske siRNA’er Salg
siRNA’er blev enten kemisk syntetiseret (Dharmacon) eller udtrykt som shRNAs fra pCEPsh som tidligere beskrevet [44]. Følgende
EZH2
-targeting siRNA’er blev anvendt: siEZH2-1 5′-GAAUGGAAACAGCGAAGGA-3 ‘(forhåndsudformede siRNA fra Dharmacon), siEZH2-2 5′-GACUCUGAAUGCAGUUGCU-3′ [7], og siEZH2-3 5’-GCUGAAGCCUCAAUGUUUA-3 ‘(forhåndsudformede siRNA fra Dharmacon). Den siEZH2pool bestod af alle tre siRNAs blandet ved ækvimolære koncentrationer. Følgende kontrol siRNA’er blev anvendt: sicontr-1 5’-CAGUCGCGUUUGCGACUGG-3 ‘[45], sicontr-2 5′-UAGCGACUAAACACAUCAA-3′ (forhåndsudformede siRNA fra Dharmacon, der indeholder mindst fire mismatch til alle kendte humane gener), og siluc 5’-CAUCACGUACGCGGAAUAC-3 ‘(målretning
Photinus pyralis
luciferase [46]).
RNA-ekstraktion, kvantitativ real-time revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR), og protein analyser
RNA blev isoleret som beskrevet tidligere [47] og resuspenderet i RNase-frit vand. RNA-koncentrationer blev målt med NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE USA), ved 260 nm. Revers transkription af 1 ug RNA blev udført ved anvendelse af oligo-dT primer og ProtoScript M-MuLV Taq RT-PCR Kit (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Tyskland) ifølge fabrikantens protokol. Ekspressionsniveauer blev bestemt ved real-time PCR med en 7300 Real-Time PCR System detektor (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) ved anvendelse af SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems), suppleret med 500 nM af hver fremad og omvendt primer.
EZH2
(NM_004456) ekspression blev bestemt under anvendelse af forward primeren 5′-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3 ‘og revers primer 5′-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3’ [48]. Til påvisning af
p27
Kip1
(NM_004064) udtryk 5′-GCCAGACGGGGTTAGCGGAG-3 ‘blev brugt som frem og 5′-GAGGCCAGGCTTCTTGGGCG-3’ som reverse primer.
MageD1
(NM_001005333) udtryk blev bestemt med primere 5′-GGCTGTCCTCTGGGAGGCACT-3 ‘og 5′-GGGTTGCTGTTGGGCACTCGT-3’,
Timp2
(NM_003255) udtryk med primere 5′-TCTACACGGCCCCCTCCTCG-3 ‘og 5′-TGGGGCAGCGCGTGATCTTG-3’,
SDC1 Hotel (NM_001006946) udtryk med primere 5′-CGGCCCTGCCGCAAATTGTG-3 ‘og 5′-CCTCCAGGCCGGTGGGTTCT-3’,
Tob1 Hotel (NM_005749) udtryk med primerne 5′-TGCAGCCTATGGAGGCCTCAA-3 ‘og 5′-CCCCTTGGGCCCGTGCATTTT-3’, og
Dag1
(NM_001165928) ekspression med primerne 5′-GTCGTCGGGCGCTCATTTCGA-3 ‘og 5′-CCAGCCGTGTAGCGCTCACTG-3’. GAPDH og HPRT1 primersekvenserne og cykelforhold er tidligere blevet beskrevet [49]. Størrelserne af PCR-produkterne blev indledningsvis verificeret ved agarosegelelektroforese og efterfølgende kontrolleres ved smeltepunkt analyse efter hver reaktion. Relativ kvantificering blev udført ved hjælp af den sammenlignende Ct (2
-ΔΔCt) metoden [50]. Data er præsenteret som den fold forskel i genekspression normaliseret til en husholdning gen indeks (det geometriske gennemsnit af
GAPDH
og
HPRT1
udtryk niveauer), og i forhold til en kalibrator prøve. Husholdning gener blev udvalgt blandt flere testede husholdningsgener for normalisering af genekspression, eftersom de udviste lige amplifikationseffektiviteter som vores gener af interesse. Statistisk signifikans af forskelle i målte variabler mellem kontrol og behandlede grupper blev bestemt ved et to-sidet parret t-test under anvendelse af Sigma Plot software (Systat Software Inc., San Jose, CA). Forskelle blev betragtet som signifikante ved p ≤ 0,05.
Total proteinekstrakter blev fremstillet 48 til 96 timer efter transfektion, som tidligere [51] beskrevne. For cytosoliske og kerneekstrakt forberedelse blev celler resuspenderet i lysepuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet® P-40, pH 7,4) og inkuberet på is. Intakte kerner blev pelleteret ved centrifugering, og den cytosoliske ekstrakt i supernatanten blev overført. Kerner blev vasket to gange med lysisbuffer indeholdende 0,05% Nonidet® P-40 og de nukleare proteiner blev ekstraheret som beskrevet for den samlede proteinekstrakter. Til Western blot-analyser, 20-30 ug protein ekstrakt blev separeret ved 12,5% SDS-PAGE, overført til en Immobilon-P membran (Millipore, Bedford, MA, USA) og analyseret ved forøget kemiluminescens (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK ). Følgende antistoffer blev anvendt: anti-EZH2 antistof (AC22, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p27-antistof (# 610.242, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), anti-cyclin D1-antistof (DSC6 , Cell Signaling), og anti-alfa-tubulin antistof (KP06, Calbiochem, Darmstadt, Tyskland).
celletælling og cellecyklus analyser
For celletal analyser, totale celletal blev bestemt 48-72 timer efter transfektion. Totale celler per milliliter blev målt under anvendelse af en grevinde Cell Counter (Invitrogen).
I cellecyklus analyser, cellerne blev trypsiniseret 48 timer efter transfektion vaskes i iskold phosphatpufret saltvand (PBS), og fast i 80% kold ethanol natten over ved -20 ° C.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.