PLoS ONE: overekspression af LSD1 Fremmer spredning, migration og invasion i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

Lysin specifik demetylase 1 (LSD1) er blevet identificeret og biokemisk kendetegnet ved epigenetik, men de patologiske roller sin dysfunktion i lungekræft mangler at blive belyst. Formålet med denne undersøgelse var at evaluere den prognostiske betydning af LSD1 ekspression i patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og at fastlægge dens nøjagtige rolle i lungekræft proliferation, migration og invasion.

Metoder

proteinniveauer af LSD1 i kirurgisk resektion prøver fra NSCLC-patienter blev påvist ved immunhistokemi eller Western blotting. MRNA-niveauer af LSD1 blev påvist ved QRT-PCR. Korrelationen af ​​LSD1 udtryk med kliniske karakteristika og prognose blev bestemt ved statistisk analyse. Celleproliferation sats blev vurderet ved MTS-assay og immunofluorescens. Cell migration og invasion blev opdaget af scratch test, matrigel assay og transwell invasion assay.

Resultater

LSD1 udtryk var højere i lungekræft væv mere end i normalt lungevæv. Vores resultater viste, at overekspression af LSD1 protein var forbundet med kortere samlet overlevelse af NSCLC-patienter. LSD1 blev lokaliseret hovedsageligt til kræft cellekernen. Afbrydelse af LSD1 hjælp siRNA eller en kemisk inhibitor, pargylin, undertrykt proliferation, migration og invasion af A549, H460 og 293T celler. I mellemtiden, overekspression af LSD1 øget cellevækst. Endelig LSD1 viste sig at regulere epitel-til-mesenkymale overgang i lunge kræftceller.

Konklusioner

Over-ekspressionen af ​​LSD1 var forbundet med dårlig prognose i NSCLC, og fremmet tumorcelleproliferation, migration og invasion. Disse resultater antyder, LSD1 er et tumor-fremmende faktor med lovende terapeutisk potentiale for NSCLC

Henvisning:. Lv T, Yuan D, Miao X, Lv Y, Zhan P, Shen X, et al. (2012) overekspression af LSD1 Fremmer spredning, migration og invasion i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (4): e35065. doi: 10,1371 /journal.pone.0035065

Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Modtaget: November 22, 2011; Accepteret: 11. marts 2012; Udgivet: April 6, 2012 |

Copyright: © 2012 Lv et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de førende årsager til kræft dødsfald på verdensplan. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den mest almindelige form for lungekræft [1]. Den 5-årige overlevelsesrate for lungekræft er stadig dårlig. For at udvikle mere effektive behandlingsformer, er det vigtigt at opnå en bedre forståelse af den molekylære biologi af lungekræft.

Genetiske ændringer er kendetegnende for human cancer. I de senere år har kræft genomforskning felt gjort betydelige fremskridt med at identificere genetiske læsioner i cancer. Endvidere er betydningen af ​​epigenetiske ændringer, der opstår under udviklingen lungekræft også blevet anerkendt [2]. Epigenetiske ændringer er forbundet med både DNA-methylering og histon modifikationer [3]. Histon modifikationer, såsom acetylering, phosphorylering og methylering, er omskifterne, der ændrer chromatinstruktur for at tillade posttranskriptionel aktivering eller repression af downstream-proteiner [4]. Forståelsen af ​​disse epigenetiske ændringer vil identificere nye cancer-relaterede gener, der kan udgøre attraktive mål for kræftbehandlingen og give nye indsigter i biologi lungekræft. Således en integrativ tilgang i lungekræft forskning, der kombinerer epidemiologiske, genetiske og epigenetiske information, har vist sig som et vigtigt begreb for kræftbehandling [5].

status methylering af histon methyltransferaser og histon demethylases spiller en central rolle i reguleringen af ​​genekspression [6]. Histon demethylase lysin specifik demethylase 1 (LSD1), den første histon demethylase, der blev opdaget som et nukleart homolog af amin oxidaser, fjernes methyl- grupper fra mono- og dimethyleret Lysin (Lys) 4 af histon H3 (H3K4me1 /2) og Lys9 af histon H3 (H3K9me1 /2) [7]. LSD1 er afgørende for pattedyr udvikling og involveret i mange biologiske processer, såsom celletype differentiering og genaktivering og undertrykkelse [8]. En nylig undersøgelse viste, at LSD1 kunne fremme celle faseovergang (mangel på LSD1 førte til delvis cellecyklusstop i G

2 /M) og celleproliferation, tyder på, at dets overekspression kunne fremme tumorigenese [9]. Ekspressionen af ​​LSD1 er blevet forbundet med tumortilbagevenden under behandlingen i forskellige cancertyper, yderligere implicerer LSD-1 som en tumor promotor [10] – [12]. Tissue cDNA microarray analyse viste også LSD1 transaktivering i lunge og kolorektale karcinomer [11]. Knocking ned af LSD1 med små interfererende (SI) RNA resulterede i undertrykkelse af spredning af forskellige blære og lungekræft cellelinier [11]. Selv om disse undersøgelser viste, at LSD1 kan være forbundet med patogenesen af ​​lungekræft, ekspressionen og betydningen af ​​LSD1 i NSCLC er uklar.

I denne undersøgelse har vi forsøgt at undersøge ekspressionen og funktionen af ​​LSD1 i NSCLC, dets forhold til klinisk-patologiske træk, og dens prognostisk værdi for overlevelsen af ​​patienter med NSCLC. Endelig skal vi også til formål at bestemme den nøjagtige rolle LSD1 i lungekræft proliferation, migration og invasion.

Materialer og Metoder

Patienter og Prøver

Kirurgiske prøver fra 80 NSCLC patienter opnået på Nanjing Chest Hospital og Jinling Hospital fra januar 2001 til december 2003, blev efterfølgende indsamlet til undersøgelsen. Disse bestod af 38 planocellulære carcinomer og 42 adenocarcinomer, sammen med patient-matchede tilstødende ikke-tumor vævsprøver. Ingen af ​​patienterne havde modtaget strålebehandling eller kemoterapi før kirurgi. Alle patienter var blevet fulgt i fem år efter operation, og komplette kliniske data blev elektronisk registreret. Alle tumorvæv blev klassificeret i henhold til retningslinjerne for World Health Organization klassificering. Iscenesættelsen af ​​tumorerne fulgte 7

th Union International Classification på Cancer kriterierne i 2009. Denne undersøgelse blev godkendt af Etisk Komité Jinling Hospital på Nanjing. Alle prøver blev anonymiseret, og ingen af ​​de forskere, der udfører forsøgene havde adgang til de klinisk-patologiske data.

immunhistokemisk (IHC) Farvning

Alle prøver blev fikseret i 10% formalin, indlejret i paraffin, snittet efter hinanden ved 5 um og farvet ved hematoxylin og eosin. Sektionerne blev deparaffineret og rehydreret efter rutine protokol. Snittene blev inkuberet natten over med de specifikke primære LSD1 antistoffer (1:100 fortynding Cell Signaling, Danvers, MA, USA). Objektglassene blev inkuberet i 30 min med gede-anti-kanin-immunglobuliner (E0432; cellesignalering) efter at være blevet vasket med Tris-pufret NaCI-opløsning. Objektglassene blev derefter inkuberet i 30 minutter med strippet AB kompleks /AP (K0391, Dako, Peking, Kina). Kontrastfarvning udførtes med hematoxylin. Procentdelen af ​​positive celler blev bestemt ved tælling 500 celler i fem tilfældige områder per sektion. Nukleare Immunofarvning resultater for LSD1 blev evalueret under anvendelse af en semikvantitativ Remmele pointsystem [13], som beregnes farvningsintensiteten og procentdelen af ​​positive celler. IHC-farvning blev scoret efter følgende kriterier: – ingen af ​​de celler farvet; +, 1-40% af cellerne farvet; ++; 40-70% af cellerne farvet; +++, 70-100% af cellerne farvet. IHC score på LSD1 udtryk var [0 (negativ) ≤ score 2 +] og [2+ ≤ score ≤3 +], som repræsenterede lav og høj ekspression hhv.

Western Blotting

De lungekræft tumorvæv og tilstødende ikke-tumorvæv var homogeniseret . Totale proteiner (30 ug) fra kliniske prøver eller cellekulturer blev adskilt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese efterfulgt af elektrooverføring til en nitrocellulosemembran ved anvendelse af en overførsel celle (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Western blotting blev udført ved sekventiel inkubering i 5% fedtfri mælk blokerende buffer ved stuetemperatur i 60 minutter, efterfulgt af primært antistof mod enten LSD1 (1:500; Cell Signaling), AcH3K9, Twist1, E-cadherin, N- cadherin eller β-actin ved 4 ° C natten over, og endelig peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin sekundært antistof (1:5000) ved stuetemperatur i 90 min. Immunoreaktive bånd blev påvist ved reaktion med ECL påvisning systemet reagenser (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) og eksponering for røntgenfilm, der blev udviklet og fotograferet.

mRNA Udvinding og Quantitative Reverse Transcription ( QRT) -PCR

Væv blev homogeniseret og totale cellulære mRNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). CDNA’et blev transkriberet under anvendelse af M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens protokol. QRT-PCR blev udført under anvendelse af FastStart Universal SYBR Green Master Mix kit (Roche, San Francisco, CA, USA). Relative mRNA niveauer af LSD1 blev normaliseret til niveauer af housekeeping-genet GAPDH og beregnes af 2-ΔΔCt metode. Følgende primere blev anvendt: GAPDH, fremad: 5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3 ‘og revers: 5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTG-3′; LSD1, frem: 5’-GAAACTGGAATAGCAGAGAC-3 ‘og omvendt: 5′-GGTGGACAAAGCACAGTATCA-3’.

Cell Culture, Transfektion og behandling

A549, H460 og 293T celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og dyrket i RPMI medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 100 ug /ml penicillin /streptomycin. Plasmidet Flag-LSD1 (3 ug); venligst stillet til rådighed af Dr. Yang Shi, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA), over-ekspressionsplasmid LSD1 (3 ug) og LSD1 siRNA (3 ug) blev transficeret ind A549 og H460-cellelinier i plader med 6 brønde (1 ug /ml) under anvendelse af Lipofectamine reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Pargylin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), en MAO-inhibitor, blev anvendt til kemisk blokere LSD1-medieret demethylering [14]. Cellerne blev behandlet med pargylin i 48 timer, og derefter blev underkastet MTS assay. Data er præsenteret som fold-ændringer i de relative lys enheder /millienheder pargylin, og repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg.

Cell Proliferation, vækst, MTS Analyser

For cellevækst assay, 50.000 celler /brønd blev podet i tre eksemplarer på en plade med 24 brønde med komplet vækstmedium. Celler blev talt i løbet af seks dage under anvendelse af et hæmocytometer. På MTS-assayet (Promega), 500 celler /brønd blev podet i tre eksemplarer på en plade med 96 brønde for hver cellelinie. Ved 12, 24 og 48 timer blev 20 pi MTS-reagens til hver brønd, inkuberet i 1 time ved 37 ° C, og resultaterne blev analyseret af en pladelæser ved 490 nm. Prøven data blev normaliseret til baggrunden læsninger af medier alene.

Tre-dimensionel Cell Culture, Collagen Invasion Assay, og Scratch Assay

Tre-dimensionel basalmembran kulturer blev etableret som tidligere beskrevet [15 ]. Kort fortalt, 5000 celler /brønd blev dyrket i 2% matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) med epidermal vækstfaktor (EGF) på en 50% matrigel basislaget. Collagenet invasion assay blev udført som tidligere beskrevet [16]. Kort fortalt, 5000 celler /brønd blev podet i 2% matrigel på et lag af 1:01 collagen (BD Bioscience) til matrigel mix. Kultur Væksten blev registreret på dag 5. Ved bunden assay blev celler dyrket i komplet vækstmedium indtil 90-100% sammenflydning blev nået. En 3 mm sår blev indført hen over diameteren af ​​hver plade. Celle migration blev observeret ved mikroskopi efter 24 og 48 timer senere.

A, B) LSD1 ekspression blev opreguleret i lunge skællede kræftvæv. Pilene angiver LSD1-positive cancerceller, der stod i cellekernerne. Forstørrelse: A, × 20; B, × 60. (C, D) LSD1 ekspression blev opreguleret i lungeadenocarcinom kræftvæv. Forstørrelse: C, × 20; D, × 60. (E, F) afslørede IHC at LSD1 ekspression var svag i normale lungevæv. Forstørrelse: E, × 20; F, × 60. IHC scoringer af LSD1 udtryk var: lav, [0 (negativ) ≤ score 2+]; høj, [2+ ≤ score ≤3 +].

P

. 0,05 angivet statistisk signifikante forskelle mellem grupperne

(A) Proteinet niveau LSD1 i lungekræft væv var betydeligt højere end i normalt væv (

P

0,01), som påvist ved Western blot. β-tubulin blev anvendt som en loading kontrol. (B) Prøve 122, 206 og 207 er vist som repræsentanter for de tre grupper: N, normal lungevæv: C, NSCLC væv; P, paracarcinoma væv. (C) mRNA-niveauet af LSD1 blev påvist ved QRT-PCR, og mRNA ekspression af LSD1 var signifikant højere i tumorvæv end i normalt væv (

P

0,05).

Blå linjer skildrer høje niveauer af LSD1 udtryk, og røde linjer skildrer lave niveauer af LSD1 udtryk i NSCLC prøver. (A) NSCLC patienter med lavere LSD1 protein niveauer havde bedre prognose. (Ikke-justerede

P

-værdi = 0,0003; lave sager udtryk, n = 52 og høje udtryk tilfælde, n = 28). (B) Patienter med lavere mRNA niveauer af LSD1 havde også længere overlevelse (

P

0,05).

Statistisk analyse

Studerendes

t

-test og ANOVA blev anvendt til at undersøge sammenhængen mellem LSD1 udtryk og kliniske faktorer (alder, køn, rygning, tumor stadie, histologi, tumorstørrelse, nodal status, og samlet overlevelse). Pearsons korrelationsanalyse blev anvendt til at vurdere graden af ​​lineær korrelation mellem to variable. Kaplan-Meier overlevelse analyse blev udført for at bestemme den prognostiske værdi af LSD1, og log-rank testen blev anvendt til at sammenligne ligheden mellem de to overlevelseskurver. En

P

-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant og

P

0,01 blev anset stærkt signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-programmet v17.0 til Windows (SPSS, Chicago, IL, USA).

Resultater

LSD1 Expression blev opreguleret i NSCLC tumorvæv

Vi undersøgte først ekspressionsniveauer af LSD1 i 80 NSCLC tumorvæv og 20 normale lungevæv ved IHC farvning. Høj LSD1 ekspression blev detekteret i kerner af maligne celler, mens der blev observeret svag farvning hele ikke neoplastiske væv (fig. 1). Konkret blev ekspressionen af ​​LSD1 observeret i 90,0% af lungecarcinomer (72/80) og 10,0% af godartede lunge prøver (2/20). Høje niveauer af LSD1 udtryk (score: ++ – +++). Blev påvist i 37 (46,3%) tumorvæv fra NSCLC patienter

Vi næste undersøgte LSD1 udtryk i 40 tilfældigt udvalgte NSCLC tumorvæv, paracarcinoma lunge væv, og normale lungevæv ved Western blotting. Resultaterne viste en statistisk signifikant stigning af LSD1 ekspression i tumorer, sammenlignet med de normale lungevæv ved hjælp β-tubulin som reference (to-halet parret

t

-test, n = 40,

P

0,01) (fig 2A).. Proteinet niveau af LSD1 i prøver 122, 206, og 207 er vist i figur 2B.

For yderligere at validere ovenstående proteinet resulterer undersøgte vi også mRNA-niveauerne af LSD1 i disse 40 udvalgte NSCLC tumorvæv og normal lungevæv efter QRT-PCR under anvendelse af GAPDH som reference. Vi fandt, at mRNA-niveauet af LSD1 i cancervæv (CT = 19,9 ± 1,01) var signifikant højere end i normale lungevæv (CT = 22,1 ± 0,9) (to-halet parret

t

-test, n = 40,

P

0,05) (fig 2C)

LSD1 Expression blev associeret med Total overlevelse

for at evaluere den kliniske betydning af LSD1 overekspression i.. lungekræft, vi analyseret, om ekspressionsniveauer af LSD1 var forbundet med den samlede overlevelse i NSCLC. Som vist tabel 1, var høje proteinniveauer af LSD1 signifikant associeret med overlevelse (χ

2 = 12,87,

P

= 0,0003), men ikke korreleret med nogen af ​​de clinicopathologic karakteristika (herunder alder, rygevaner , køn, tumor diameter, histologiske type, visceral pleural invasion, patologisk stadium, eller type operation, alt,

P

0,05). I løbet af fem-års follow-up periode, 52 ud af 80 (65%) NSCLC patienter døde som følge af sygdomsprogression. Kaplan-Meier-kurver viste, at patienter med øget LSD1 ekspression (28 tilfælde) havde en signifikant kortere samlet overlevelse end dem med nedsat LSD1 ekspression (52 tilfælde) (

P

= 0,0003) (fig. 3A).

udtrykket af LSD1 i A549 og H460 lunge kræftceller var højere end i 293T-celler. Proteinniveauet i H460 cellelinien var højere end i A549-cellelinjen. β-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.

Den række af kurver repræsenterer celleproliferation ved 0 timer til 48 timer efter eksponering for forskellige koncentrationer af pargylin behandling og transfektion med de forskellige plasmider. (A) LSD1 inhibitor, pargylin (fra top til bund: 1 mM, 2 mM, 3 mM og 4 mM), og LSD1 siRNA inhiberede proliferation af A549-cellelinjen. Den A549 celleproliferation blev signifikant reduceret i de forskellige grupper, sammenlignet med kontroller (*

P

0,05). (B) pargylin inhiberede H460 cellelinien overlevelse. Desuden blev en stærkere inhiberende virkning observeret i H460 cellelinien, men der var ingen signifikante forskelle mellem de to cellelinier. Den H460 celledeling blev signifikant reduceret i de forskellige koncentration grupper, sammenlignet med kontroller (*

P

0,05). (C) pargylin inhiberede overlevelse 293T cellelinie. (D) Spredningen kurven efter transfektion af Flag-LSD1 plasmidet ind i A549 celle og transfektion af LSD1 siRNA plasmid ind i H460 cellen. I A549-celler, spredning var signifikant højere efter transfektion af Flag-LSD1 plasmid, sammenlignet med pCMV5-transficerede kontrol (*

P

0,05). I H460 celler, spredning var signifikant lavere efter transfektion af LSD1 siRNA plasmid, sammenlignet med celler transficeret med siRNA kontrol plasmid (*

P

0,05).

billeder er vist ved × 20 forstørrelse. Grøn, rød og blå fluorescens repræsenterer LSD1, BrdU og Topro-3. Spredningen steget markant i A549 celler efter transfektion af Flag-LSD1 plasmid. Imidlertid proliferation faldet i de H460-celler efter transfektion af LSD1 siRNA plasmidet. Pargylin behandling reducerede proliferation i begge cellelinier. Topro-3 farvning viser nukleare lokalisering, og BrdU farvning viser de prolifererende celler.

migration hastighed gradvist faldet fra 6 timer til 48 timer efter transfektion af LSD1 siRNA plasmidet i H460 celler, som blev signifikant forskellig fra hastigheden på 24 timer og 48 h (*

P

0,05). Migrationen steg gradvist efter transfektion af Flag-LSD1 plasmidet ind i A549 celler, som var signifikant forskellig fra hastigheden på 24 timer og 48 h (*

P

0,05). Alle transfektion grupper var signifikant forskellig fra kontrolgrupperne (*

P

0,05).

Efter aftale med dette, har vi også fastslået, at højere mRNA ekspressionen af ​​LSD1 blev forbundet med faldt samlet overlevelse i NSCLC patienter (

P

0,05). (.. figur 3B)

LSD1 Fremmes spredning i Lung Cancer Cell Lines

udtryk for LSD1 blev lavere i A549-celle end i H460 cellelinien, som vist i figur 4. Derfor blev Flag-LSD1 plasmidet transfekteret ind i A549-celler og LSD1 siRNA plasmidet blev transficeret ind i H460 celler. De 293T normale epitelceller blev anvendt som en negativ kontrol.

Vi har registreret OD værdien af ​​A549, til H460 og 293T celler ved MTS generere celle vækstkurver. I alle tre cellelinjer, den cellulære proliferation faldt sammen med pargylin behandling i en koncentrationsafhængig måde. Det var navnlig lavere i 4 mM-behandlede gruppe end i de 1 mm- eller 2 mm-behandlede grupper. Derudover var også lavere i 1 mM-behandlede gruppe end i 3 mM-behandlede gruppe; der var imidlertid ingen forskel mellem 1 mm- og 2 mm-behandlede grupper eller 3 mm- og 4 mm-behandlede grupper (

P

0,05)., som vist i figur 5A-C

transversed celle beløb var signifikant højere for A549-celler transficeret med Flag-LSD1 plasmid; dog transfektion af LSD1 siRNA plasmidet i H460 celler førte til nedsat mængder af invasive celler. Antallet af invasive celler fra begge transfektion grupper var signifikant forskellig fra kontrolgruppen (*

P

0,05).

udtryk for total H3K9 ændrede sig ikke bemærkelsesværdigt. Da LSD1 aktivitet var opreguleret, Twist1 og N-cadherin ekspression øges, og AcH3K9 og E-cadherin ekspression faldet. Da LSD1 aktivitet blev nedreguleret, Twist1 og N-cadherin ekspression faldt og AcH3K9 og E-cadherin-ekspression øges. Flag-LSD1 plasmid blev transficeret i A549-cellelinien, og LSD1 siRNA plasmidet blev transficeret i H460 cellelinien. β-actin blev anvendt som lastning kontrol

spredning signifikant øget i A549-gruppen efter transfektion af Flag-LSD1 plasmid (

P

0,05).; men det faldt betydeligt i H460 gruppe efter transfektion af LSD1 siRNA plasmidet (

P

0,05). PCMV plasmid blev anvendt som kontrol i A549 transfektion gruppen, og LSD1 siRNA kontrol plasmidet blev anvendt i H460 celletransfektion gruppe (fig. 5D).

Vi yderligere identificeret rolle LSD1 i A549 og H460 celleproliferation med immunfluorescensfarvning. Ændringen i antallet af prolifererende celler blev observeret ved BrdU-farvning. Resultaterne viste, at celleproliferation blev signifikant øget efter transfektion af over-udtrykkende LSD1 plasmidet i A549-cellelinien. I mellemtiden celleproliferation faldt i H460 celler transficeret med LSD1 siRNA plasmidet. Den faldt i begge cellelinier efter pargylin behandling, som vist ved immunfluorescensfarvning (fig. 6), som også bekræftet, at LSD1 er involveret i tumorcelleproliferation.

LSD1 fremmet Migration af lungecancerceller

Cellemigrering undersøgt af cellen scratch assay. Sammenlignet med kontrolgruppen, blev antallet og hastigheden af ​​migrerede celler gradvist reduceret efter transfektion med LSD1 siRNA plasmid i H460 cellelinier. De migrerende celler nåede en top ved 48 timer, som vist i figur 7A. I modsætning hertil blev antallet af migrerede celler signifikant forøget i A549-cellelinien efter transfektion med Flag-LSD1 plasmid, sammenlignet med kontrolgruppen (

P

0,05). Den relative hastighed migration er vist i figur 7B.

rolle LSD1 i lungekræft Invasion

cellernes evne til at krydse matrigel indikerede invasiv af A549 og H460 cellelinjer. H460 celler transficeret med LSD1 siRNA-plasmid var mindre invasiv end kontrolgruppen (

P

0,05). A549-celler transficeret med Flag-LSD1 plasmidet var mere indgribende end kontrol- celler og celler behandlet med pargylin (både,

P

0,05). Mængden af ​​invaderende celler krydser gennem matrigel basalmembranen er vist i figur 8.

LSD1 Reguleret Epithelial-til-mesenkymale Transition (EMT) i lungekræft Celler

For at undersøge om LSD1 regulerer EMT overgang i lungecancerceller undersøgte vi ekspressionen af ​​nøglen EMT transskriptionsrepressor TWIST1 og EMT markører E-cadherin og N-cadherin i LSD1-over-udtrykkende A549-celler (transficeret med Flag-LSD1 LSD1 over-udtrykkende plasmid) og LSD1 slået ned H460 celler (transficeret med LSD1 siRNA plasmidet eller behandlet med 4 mM pargylin). Virkningerne på H3K9, AcH3K9, Twist1, E-cadherin og N-cadherinekspression induceret af ændring af LSD1 aktivitet blev undersøgt. Mens udtryk for total H3K9 var upåvirket, overekspression LSD1 førte til fald i H3K9 acetylering og E-cadherin udtryk og stigninger i Twist1 og N-cadherin udtryk. I mellemtiden blev H3K9 acetyleringsniveauer og E-cadherin ekspression forøget i LSD1 vælte celler, hvilket antyder, at LSD1 ekspression kan korreleres med AcH3K9, Twist1, E-cadherin og N-cadherin ekspression, som vist i figur 9.

Discussion

i de seneste år har epigenetik blevet et varmt emne i kræftforskning. Den resterende del af methylering og demethylering i epigenetisk modifikation påvirker genekspression og cellulær aktivitet. Undersøgelser har vist, at afvigende histon lysin methylering i cancer er ikke blot forbundet med undertrykkelse af kromatin relateret til specifikke gener, men også med undertrykkelsen af ​​store kromosomale regioner. Epigenetiske ændringer i LSD1 er blevet vist at spille en central rolle i carcinogenese [17]. LSD1 kan forhindre ophobning af dimethyl grupper af p53, undertrykke p53 transkriptionel opregulering, forebygge apoptose, og bidrage til menneskelig carcinogenese via en kromatin modifikation mekanisme.

Til dato kun få undersøgelser har impliceret LSD1 i NSCLC. Hayami

et al.

Viste, at LSD1-specifikke siRNA’er betydeligt slået ned LSD1 udtryk og resulterede i undertrykt spredning af forskellige lunge cancerceller [11]. Imidlertid blev sammenhængen mellem LSD1 og overlevelse NSCLC patienter ikke veldefineret, og den rolle, LSD1 i proliferation, migration og invasion i NSCLC var uklar. Vores undersøgelse undersøgte sammenslutninger af LSD1 udtryk og kliniske funktioner i NSCLC patienter diagnosticeret som fase I /II. For at vise, at de epigenetiske ændringer blev forbundet med genetiske ændringer i lungekræft, vi først undersøgt ekspressionen af ​​LSD1 i NSCLC kliniske prøver.

Tidligere undersøgelser viste, at LSD1 protein og mRNA-niveauer kunne fungere som biomarkører for patienter med mere aggressive tumorer i brystcancer, prostatacancer, og neuroblastom [18] – [20]. I vores undersøgelse har vi opdaget LSD1 ved IHC-analyse, Western blotting, og QRT-PCR. Et stærkt punkt i denne forskning er det fund, at ekspressionen af ​​LSD1 var signifikant korreleret med samlede overlevelse af NSCLC patienter. Vores nuværende forskning undersøgte rolle LSD1 i NSCLC. Yderligere undersøgelser af LSD1 i andre tumortyper kan afsløre, at patienter med højere niveauer af LSD1 (uanset mRNA eller protein og /eller uanset primær tumortype) har dårligere overlevelse end patienter med lavere niveauer af LSD1.

Vi yderligere vist, at LSD1 var vigtigt for kræft celledeling og invasion. LSD1-induceret aktivering af proliferation, migration og invasion i tumorceller blev inhiberet af pargylin. Nedregulering af LSD1 ekspression ved siRNA i tumorcellelinier ført til øget cellevækst, migrering og invasion. Disse data antyder, at LSD1 kan påvirke omdannelsen af ​​tumorceller og kan også fremme EMT i lungen epitel. Yderligere forskning skal gennemføres med henblik på at afgøre, om overekspression af LSD1 er en tidlig eller sen begivenhed i lunge tumorigenese og hvad den mekanisme af overekspression er. Vi har præsenteret data antyder, at LSD1 opreguleres i lungekræft tumorpromotion pathway, og at den virker til at øge cellevæksten, migration og invasion, og genskabe en transformeret epitel fænotype. Farmakologisk undertrykkelse af LSD1 kan repræsentere en lovende tilgang til NSCLC behandling.

Yderligere kræves funktionel analyse for at bestemme de lovgivningsmæssige netværk af LSD1. Transkriptionel analyse afslørede, at LSD1 /NuRD komplekser regulerer flere cellulære signalveje [21], herunder TGFp1 signalvejen, der er kritisk involveret i celleproliferation, overlevelse og epithelial-til-mesenchymal overgang. Vi viste, at LSD1 fremmet invasionen og metastatisk potentiale lungekræft celler

in vitro

. Vi fandt også, at LSD1 er opreguleret i lungecarcinomer og at dens udtryk negativt korreleret med den af ​​AcH3K9, Twist1 og N-cadherin, og positivt korreleret med den af ​​E-cadherin. Vores data giver en molekylær basis for samspillet mellem histondeacetylering i kromatin remodeling, hvilket indikerer, at LSD1 kan påvirke EMT og acetylering af H3K9.

afvigende overekspression af LSD1 i lungekræft kan gøre det en god kandidat som et terapeutisk molekylært mål [11]. Denne form for information indikerer også, at vi skal fortsætte udviklingen af ​​nye anticancer terapi baseret på epigenetisk status. Som det har konsekvenser for opdagelsen af ​​epigenetiske markører, et vigtigt spørgsmål at løse, er, hvordan at definere potentielle mål for epigenetisk terapi. Første generations lægemidler rettet mod de relativt promiskuøse DNA methylering og histonacetylering modifikatorer har haft succes i behandlingen af ​​hæmatologiske cancere [22]. Hvis LSD1 inhibering fører til betydelig de-repression af nogle gener, kan LSD1 være et vigtigt alternativ mål for terapi. Epigenetisk styring af genregulering er en rivende udvikling felt med betydeligt potentiale, og onkologi er sandsynligvis den terapeutiske anvendelse i som er lavet den hurtigste fremskridt. Til dato er syntetiske inhibitorer af klassiske histondeacetylaser været udbredt anvendt som biologiske værktøjer til epigenetiske studier, og nogle har avanceret til kliniske undersøgelser. Desuden er for nylig blevet rapporteret udvikling af histon methyltransferase og demethylase inhibitorer [21], [23]. I lungekræft, overekspression af LSD1 bør bidrage til gen undertrykkelse at hæmme cellevækst og ondartet progression, men hvor der er en egentlige formål med LSD1 fortsat ukendt. Vi planlægger at undersøge dette i fremtidige studier.

Som konklusion, fandt vi, at LSD1 var overudtrykt i NSCLC patienter gennem tidligt at sene stadier af carcinogenese. LSD1 er til stede i kernen og fremmer proliferation, muligvis ved regulering af en bred vifte af kromatin funktioner. I mellemtiden, overekspression af LSD1 fremmet tumorcelleproliferation, migration og invasion. Yderligere validering med funktionelle analyser af dette protein i forbindelse med human carcinogenese kan medvirke til udvikling af nye terapeutiske strategier for lungekræft.