PLoS ONE: Analyse af Molecular Networks i androgenafhængige og uafhængig prostatakræft Revealed Fragile og Robust Subsystems

Abstrakt

Androgen ablation terapi er i øjeblikket den primære behandling for metastatisk prostatacancer. Desværre, i næsten alle tilfælde, androgen ablation ikke permanent arrestere kræft progression. Androgener som testosteron inddrages, prostatacancerceller mister androgen følsomhed og begynde at proliferere uden hormon vækstfaktorer. I denne undersøgelse konstruerede vi og analyseret en matematisk model af integrationen mellem hormon vækstfaktorsignalering, androgen receptor aktivering, og ekspressionen af ​​cyclin D og prostataspecifikt antigen i human LNCaP prostataadenokarcinomceller. Formålet med undersøgelsen var at undersøge, hvilke signalsystemer var vigtige i tab af androgen afhængighed. Modellen blev formuleret som et sæt af ordinære differentialligninger, som beskrevet 212 arter og 384 interaktioner, herunder både mRNA og protein niveauer til vigtige arter. En ensemble tilgang blev valgt til at begrænse modelparametre og at vurdere virkningen af ​​parametrisk usikkerhed på modelberegninger. Model parametre blev identificeret ved hjælp af 14 steady-state og dynamiske LNCaP datasæt taget fra litteratur kilder. Ændringer i hastigheden af ​​prostatasyrephosphatase ekspression var tilstrækkelig til at indfange forskellige niveauer af androgen afhængighed. Analyse af modellen givet indsigt i betydningen af ​​netværkskomponenter som funktion af androgen afhængighed. Betydningen af ​​androgen receptor tilgængelighed og de MAPK /Akt signaling akser var uafhængig af androgen status. Interessant androgen receptor tilgængelighed var vigtigt selv i androgen-uafhængige LNCaP-celler. Oversættelse blev gradvist mere vigtigt i androgen-uafhængige LNCaP celler. Yderligere analyse foreslog en positiv synergi mellem MAPK og Akt signalering akser og oversættelse af vigtige proliferative markører som cyklin D i androgen-uafhængige celler. Tilsammen understøtter resultaterne målretning af både Akt og MAPK pathways. Desuden analyse foreslået, at direkte målretning af translationel maskiner, specielt eIF4E, kunne være effektiv i androgen-uafhængig prostatakræft

Henvisning:. Tasseff R, Nayak S, Salim S, Kaushik P, Rizvi N, Varner JD (2010) Analyse af Molecular Networks i androgenafhængige og uafhængig prostatakræft Revealed Skrøbelige og Robuste delsystemer. PLoS ONE 5 (1): e8864. doi: 10,1371 /journal.pone.0008864

Redaktør: Kumar Selvarajoo, Keio Universitet, Japan

Modtaget: September 8, 2009; Accepteret: December 22, 2009; Udgivet: 28 Januar 2010

Copyright: © 2010 Tasseff et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne anerkende den generøse økonomiske støtte for Kontoret for Naval Research (# N000140610293) til JDV, støtte fra SN, og den elskværdige økonomisk støtte fra RT af en National Science Foundation IGERT Nonlinear Systems Fellowship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er den mest almindelige cancer hos mænd, og den anden førende årsag til cancer-relaterede dødsfald i USA [1]. Det har været kendt siden 1940’erne, at androgener, såsom testosteron, der kræves for vækst prostatacancer [2]. Følgelig androgen ablation i kombination med strålebehandling eller traditionel kemoterapi fortsat den primære ikke-kirurgisk behandling for androgen-afhængig prostatacancer. Androgen ablation oprindeligt fører til nedsat tumorvækst og reduceret sekretion af biomarkører såsom prostataspecifikt antigen (PSA) [3] – [5]. i næsten alle tilfælde androgen ablation imidlertid ikke, at permanent standse kræft progression. Som testosteron trækkes tilbage, dårligt fungerende prostata celler mister deres følsomhed over for androgen og begynder at proliferere uden hormon vækstfaktor signaler. Disse testosteron ufølsomme celler kan så føre til androgen-uafhængige Prostate Cancer (AIPC) [6]. Den AIPC fænotype er tæt forbundet med metastase og nedsat overlevelse. Desværre har de nuværende behandlinger for metastatisk AIPC demonstreret kun beskedne overlevelse fordele [7]. En effektiv therepy for metastatisk AIPC repræsenterer således et udækket medicinsk behov og et ideelt mål for systembiologi.

AIPC er kendetegnet ved androgen handling i fravær af androgen stimulation. Kernen i androgen handling er regulering af androgen receptor (AR) af hormoner såsom testosteron. AR er en cytosolisk steroidhormon receptor tilhører superfamilien af ​​ligand transkriptionsfaktorer. Andre medlemmer af denne familie indbefatter vitamin A /D, østrogen, progesteron og thyroideahormonreceptorer [8], [9]. Hos raske prostata epitelceller, androgener aktivere AR og drive en AR-afhængig genekspression program. Seksuelle androgener, såsom testosteron typisk cirkulerer i blodet, bundet til proteiner såsom kønshormonbindende globulin (SHBG) protein. Frit testosteron træder prostataceller, hvor 5-reduktase enzymet konverterer det til aktiveret dihydrotestosteron (DHT) [10]. Både cytosoliske testosteron og DHT kan binde AR, men DHT har en højere affinitet for AR. Binding af DHT til AR fremmer cytosoliske AR aktivering og translokationen af ​​aktiverede AR til kernen. Nuclear AR driver ekspressionen af ​​målgener, herunder PSA ved binding til AR-responsive promotorelementer [11], [12]. På grund af dens ligand afhængighed, ville man forvente AR aktivering og AR-drevet genekspression til at være fraværende uden hormon stimulation. Imidlertid AIPC ofte har højere PSA ekspression og forøget celle-proliferation sammenlignet med dens androgen-afhængige modstykke selv uden stimulation [13], [14].

AIPC øgede proliferation og PSA sekretion i fravær af androgen foreslår en svigt i reguleringen af ​​androgen receptor aktivering. Feldman og Feldman revideret flere mulige AR regulatoriske veje måske er ansvarlige for androgen handling i fravær af hormonstimulation [15]. En hypotese, benævnt overfølsomhed pathway, tyder på, at AR kan være mere følsomme over for androgen i AIPC. Dette ville muliggøre AR aktivering og AR-drevet genekspression ved meget lavere niveauer af ekstracellulære testosteron signaler. En anden hypotese, benævnt promiskuøse pathway, tyder på, at AR kan aktiveres af ikke-androgen antagonister. En tredje hypotese, udforskes her, tyder på, at AR kan aktiveres af andre veje, for eksempel mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) cascade. Adskillige undersøgelser støtter dette krydstale hypotese, undertiden benævnt den fredløse pathway. Culig

et al.

Viste i DU-145 humane prostatatumorceller som vækstfaktorer fx IGF-I, KGF, og EGF kunne drive AR aktivering uden androgen [16]. Nazareth og Weigel viste i human prostata PC-3 celler, AR også kan aktiveres af proteinkinase A aktivator, forskolin i fravær af androgen [17]. Andre undersøgelser har antydet en forbindelse mellem Her2 induceret aktivering af den primære MAPK kaskade og AR-aktivering [18]. For eksempel blev Her2 overekspression positivt korreleret med formindsket følsomhed over for androgen ablation, øget AR afhængige PSA-ekspression, forøgede AR aktivering, forøget tumormasse og afkortet tumor latenstid [14], [18] – [20]. Således ville man forvente regulatorer af Her2-aktivering, for eksempel de forskellige former af 100 kDa glycoprotein prostatasyrephosphatase (PAcP), kunne være vigtige faktorer i androgen afhængighed og tumorklassificering [21] – [26]. Intracellulær PAcP (cPAcP), hvis udtryk er AR lydhør, nedregulerer Her2 ved dephosphorylering. På den anden havde, udskilles PAcP (sPAcP) fremmer beskeden Her2 aktivering af en ukendt mekanisme [26].

Resultater

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, hvilke signalering komponenter var vigtige i AI versus AD LNCaP-celler. Mod dette mål, konstruerede vi og analyseret en mekanistisk matematisk model af androgenet reaktion af tre forskellige LNCaP prostataadenokarcinomceller sub-linjer. Vi undersøgte outlaw aktivering af AR MAPK-afhængige i AD (C-33), mid-range (C-51) og AI (C-81) LNCaP celler [13], [27]. Vores netværk model inkluderet: nuklear hormon og transmembrane vækstfaktor receptor-aktivering; transkriptionsaktivitet via MAPK delsystemet [28] – [30] sammen med outlaw aktivering af AR via MAPK [15], [18]; PI3K /AKT /TOR medieret Translationsinitieringspunktet [31], [32]; transkriptionel og translationel regulering af PSA, cyklin D og PAcP udtryk [14], [20]; og regulering af Her2 aktivitet ved PAcP [26] (fig. 1). Netværket beskrevne 212 arter og 384 interaktioner (tabel S1). Transskription og translation blev modelleret ved hjælp elementære reaktioner baseret på litteratur (supplerende materiale). Konstitutiv og regulerede ekspression af PSA, cyclin D og de to former af PAcP blev behandlet i modellen.

alt

niveau af alle andre modeller proteiner var konstant. Vi modelleret de molekylære interaktioner ved hjælp af masse action kinetiske processer inden for en almindelig differentialligning (ODE) rammer. ODE’er er en almindelig metode til modellering af biologiske pathways og er blevet anvendt til at modellere en række signaltransduktionsprocesser [29], [33] – [41]. Masseaktion kinetik er også blevet anvendt i udstrakt grad, for eksempel, til at modellere receptortyrosinkinase-signalering [41], blodkoagulering [39], smerte net [40] eller Toll like receptor signalering [42], [43]. De har også været et centralt element i den succes, forstyrrelse-respons tilgange, der har vist, at simple lineære regler ofte regulerer respons opførsel af biologiske netværk [44]. Den ODE model var deterministisk og erobrede kun befolkningen i gennemsnit adfærd. Mens vi antog rumlige homogenitet, vi differentieret mellem cytosol og membran lokaliserede processer. Vi anvendte massevirkningskinetik at beskrive graden af ​​hver molekylær interaktion. Således er de 384 kinetiske model parametre var hovedsageligt forening, dissociation eller katalytiske hastighedskonstanter. Med en enkelt undtagelse, blev modelparametre estimeret og valideret ved hjælp LNCaP træningsdata taget fra litteraturen kilder (Tabel S2). Men vi var ude af stand til at estimere unikke modelparametre. I stedet har vi estimeret en familie eller

ensemble

parametre, der var i overensstemmelse med de træningsdata. Ensemblet tillod os at estimere modellen usikkerheden de mange dårligt karakteriserede parametre. Vi analyserede model ensemble til bedre at forstå, hvilke arkitektoniske træk var vigtige i androgen afhængig versus uafhængighed celler.

Modellen arkitektur blev formuleret ved at aggregere molekylære moduler i et enkelt netværk (se indsats for detaljer på højt niveau). Modellen beskriver vækstfaktor og hormon-induceret ekspression af cyclin D, PSA og de to former af PAcP. Den komplette liste af molekylære interaktioner, der udgør den model (sammen med kinetiske parameterværdier) er angivet i tabel S1.

Estimering af Ensemble af prostata modelparametre

Signal transduktion modeller ofte udviser kompleks adfærd [45] – [48]. Det er ofte ikke muligt at identificere modelparametre, selv med omfattende træningsdata [49]. På trods identifikationsstandarder [50] og integration af model identifikation med eksperimentelt design [51], parameter estimering forbliver udfordrende. I denne undersøgelse, en

ensemble

plausible modelparametre blev estimeret ud fra AI og AD LNCaP sub-kloner. Ensemble tilgange har med succes behandlet usikkerhed i systembiologi og andre områder som vejrudsigter [40], [52] – [55]. Deres centrale værdi er evnen til at begrænse modelforudsigelserne trods usikkerhed. F.eks Sethna og medarbejdere viste i en model af vækstfaktor signalere, at forudsigelser var mulig under anvendelse ensembler trods ufuldstændige parameteroplysninger (undertiden kun størrelsesorden skøn) [46]. De viste endvidere, at model ensembler var prædiktive ved hjælp af mange forskellige matematiske modeller [56].

De 420 ukendte modelparametre (384 kinetiske konstanter og 36 ikke-nul oprindelige betingelser) blev estimeret ved hjælp af 14 tidsserier og steady statslige uddannelse sæt taget fra litteratur kilder (tabel S2). Proceduren Parameteren identifikation brugte en maksimal sandsynlighed random-walk strategi med en korrelation begrænsning for at identificere en forskelligartet familie af sandsynlige parametersæt (Fig. 2C). Vi genererede 3210 mulig parametersæt og udvalgte 107 af disse til at indgå i den endelige ensemble. Udvælgelsen blev foretaget for at minimere sammenhængen mellem mulige sæt (materialer og metoder). Størstedelen af ​​parametre havde en variationskoefficient (CV) på mere end 100%. Selv modellen kvalitativt opsummerede træningsdata, mange af parametrene var dårligt hæmmet (fig. 2B). Men parametre involveret med vigtige funktioner såsom cyklin-D og PSA udtryk var relativt godt hæmmet (CV50%). Den lave afvigelse af disse parametre kunne tilskrives den overflod af PSA /cyclin D træningsdata. Alternativt kan det foreslå, at disse mekanismer havde en stor indflydelse på model adfærd. Et enkelt netværksstruktur beskrevet både androgenafhængige (AD) og Androgen Independent (AI) træningsdata med kun to eksperimentelt begrundede parameterændringer. Parametrene, der kontrollerer ekspressionen hastigheden af ​​cellulær PAcP (cPAcP) og udskilt PAcP (sPAcP) blev reduceret med en faktor på 0,01 og 0,5, henholdsvis for de C-81 og C-51 cellelinier sammenlignet med C-33 (fig. 2A). De PAcP udtryk skalering faktorer blev valgt til at svare til målte steady state PAcP udtryk nøgletal for de forskellige cellelinjer [57]. De kinetiske parametre og ikke-nul indledende betingelser for C-33 er angivet i tabel S1 og tabel S3 henholdsvis

A:. Steady state PSA-niveau som en funktion af cPAcP og sPAcP ekspression. Cirklerne repræsenterer de værdier, der anvendes til at modellere C-51 og C-81 LNCaP kloner. Alle værdier er i forhold til C-33. B: variationskoefficient (CV; standardafvigelse for en parameter i forhold til dets middelværdi) for parameteren ensemble anvendt i denne undersøgelse. En lille CV foreslog en parameter blev stramt hæmmet af træningsdata bruges til model identifikation. Parametrene med de tre mindste CV’er er angivet. C: Parameter identifikation strategi. Flere Monte Carlo baner blev brugt til at tilfældigt udforske parameter plads. Simuleringen fejl og sammenhængen mellem parametersæt blev brugt til at generere familien af ​​parametersæt, der anvendes i simuleringen studiet.

The Ensemble af AI /AD LNCaP Modeller sammenfattet Androgen Action og aktiviteten af ​​Outlaw pathway

AR kan aktiveres ved både hormon afhængige og uafhængige pathways. I denne undersøgelse betragtede vi både traditionelle hormon afhængige og MAPK medieret AR aktivering. Vi valgte uddannelse datasæt til at begrænse de enkelte sekvenser i AR aktivering og den efterfølgende AR-drevet genekspression program. Dataene i Lee

et al.

, Blev brugt til at begrænse forholdet mellem PSA udtryk og AR aktivering i AI og AD-celler [14]. Aktiveret AR blev modelleret som både en transkriptionel aktivator af PSA-ekspression [58] og en transkriptionel represser af PAcP ekspression [20]. Modellen opsummerede de kvalitative træk ved PSA-ekspression på proteinniveauet til C-81 og C-33 (fig. 3B). Derudover basale og øget niveau af PSA mRNA efter Her2 overekspression i C-33 blev også godt beskrevet (fig. 4). PSA mRNA-data blev taget fra en separat LNCaP undersøgelse [18]. De C-33 simuleringer opsummerede den observerede lavere PSA ekspression (4 gange) sammenlignet med C-81 i fravær af androgen (fig. 3B, indledende punkt). Efter DHT-stimulering (10 nM ved t = 1 time) PSA-ekspression øget for begge kloner. Men stigningen var større for C-33 (fig. 3B). Studiet af Meng

et al.

Blev anvendt til at begrænse forholdet mellem AR aktivering og PAcP ekspression [20]. Tilsætningen af ​​DHT til C-33-celler faldt PAcP ekspression og forøget Her2-phosphorylering (Fig 3A.)

A:. Her2 phosphoryleringstilstand (cirkler) og cPAcP ekspression (firkanter) til C-33-celler efter tilsætning af DHT. Forsøgsdata gengivet fra Meng

m.fl..

[20]. B: PSA ekspression efter tilsætning af DHT til C-81 (firkanter) og C-33 (cirkler) LNCaP kloner. Eksperimentelle data gengivet fra Lee

et al.

[14]. Det skraverede område i hvert plot betegner én standardafvigelse centreret omkring ensemblet middelværdi (linje).

overekspression af HER2 blev modelleret som en stigning i ekspressionen på Her2 50%. Barer betegne den gennemsnitlige PSA mRNA niveau i parameter ensemble mens fejlsøjler betegne en ensemble standardafvigelse. Den eksperimentelle PSA mRNA data blev tilpasset (plottes igen) fra [18].

Modellen er gengivet den positive feedback mellem Her2 induceret MAPK aktivering og androgen handling. Flere undersøgelser har vist, at MAPK kan aktivere AR i fravær af hormonstimulation. Aktiveret AR transkriptionelt nedregulerer cPAcP udtryk, som igen øger Her2 aktivering. Både Her2 dimerisering sammen med den traditionelle EGFR-vækstfaktor pathway kan aktivere MAPK, hvilket fører til en positiv feedback-sløjfe. Men typisk vækstfaktor-induceret MAPK aktivering er forbigående hvorimod de-regulerede Her2 induceret MAPK aktivering er vedvarende. MAPK-modulet i modellen beskrevet både aktivering pathways. Vækstfaktor afhængige MAPK-aktivering blev begrænset af dynamiske målinger af phosphorylerede ERK (ERKpp) niveauer efter stimulering af EGFR med 8 nM EGF (fig. 5D). EGF induceret ERKpp data blev taget fra HeLa-celler [30]. Vi forventer dog, forbigående EGF-induceret MAPK aktivering i LNCaP celler vil være kvalitativt til HeLa givet den bevarede natur mitogen signalering. Vi begrænset Her2 induceret MAPK-aktivering ved hjælp af cyclin D-protein udtryk data i C-33 og C-81 celler uden androgen følgende PAcP ekspression (fig. 5C). Cyclin D-ekspression blev koblet til Erk gennem ETS og AP1 transkriptionsfaktorer, som begge aktiverer cyclin D-ekspression [59]. Her2 induceret MAPK aktivering førte til en vedvarende ETSp signal i forhold til ETS aktivering efter EGFR-induceret MAPK aktivering (fig. 5D, indsat). Nominelt, C-33-celler har lavere cyclin D-ekspression sammenlignet med C-81 (fig. 5C, bane 1 og 4). Forskellen i cyclin D-ekspression mellem C-33 og C-81-celler var kvalitativt overens med forøget C-81 proliferation [13]. Mens ekspressionen af ​​cPAcP i C-81 reduceret cyclin D niveauer (fig. 5C, bane 2), sPAcP ekspression resulterede ikke i nogen ændring (Fig. 5C, bane 3). Endvidere modellen

forudsagt

en dosisafhængig stigning i C-33 cyclin D niveauer 24 timer efter tilsætning af DHT (fig. 6A). Selvom cyklin D stigningen er kun bemærkelsesværdig reaktion på høje niveauer af DHT (10 eller 100 nM) forudsigelsen er kvalitativt i overensstemmelse med eksperimentelle data

ikke

inkluderet i ensemblet beregninger [60].

A: Virkning af HER2 og MEK overekspression på LNCaP C-33 steady state PSA niveauer. Inhiberingen af ​​MEK blokerer virkningen HER2 overekspression. Eksperimentelle data tilpasset fra Lee

et al.

[14]. B: Virkning af HER2 og MEK-inhibering på LNCaP C-33 steady state PSA niveauer. Inhiberingen af ​​enten HER2 eller MEK blokerer høje AIPC PSA niveauer. Eksperimentelle data tilpasset fra Lee

et al.

[14]. C: Effekt af PAcP isoformer på LNCaP steady state cyklin D niveauer. Eksperimentelle data tilpasset fra Lingappa og kolleger (Prosetta Corporation, upubliceret data). D: Forbigående aktivering af ERK via ligand afhængig EGF signalering (8 nM EGF ved t = 60s) i HeLa-celler. Den HeLa-data er gengivet efter [30]. Indsat: Simuleret phosphorylerede ETS (ETSp) niveauer efter tilsætning af 8 nM EGF i nærvær og fravær af Her2. Her2 aktivering driver en vedvarende MAPK signal der på skift vedvarende ETS aktivering. Det skraverede region angiver én standardafvigelse centreret omkring ensemblet middelværdi (linje).

En Ensemble forudsigelse af cyclin D ekspression efter tilsætning af DHT på 1 time til C-33 kloner. Ensemblet forudsagde en dosisafhængig forøgelse af cyclin D ved 24 timer efter DHT tilsætning. Eksperimentel data blev tilpasset fra Barnes-Ellerbe

et al.

[60]. B Forudsagt virkning af en AR knockdown på PSA-ekspression efter tilsætning af androgen på 1 time til C-33 vildtype og C-33 AR knock-down kloner. Ensemblet forudsagde en omtrentlig 50% reduktion i androgen stimuleret PSA-ekspression skyldes AR-knockdown 72 timer efter behandling. Forsøgsdata blev rapporteret af Eder

et al.

[61]. Fejlen bar betegner én standardafvigelse centreret omkring ensemblet middelværdi.

For yderligere at begrænse forholdet mellem MAPK, Her2 og AR-aktivering, brugte vi Her2 forstyrrelse studie af Lee

et al.

[14] i ensemblet beregninger. Fordi den forstyrrelse størrelser ikke blev rapporteret, antog vi 50% for alle ændringer. Hvor det er muligt, blev denne antagelse valideret ved at analysere de tilsvarende Western blots under anvendelse af GelEval softwarepakke (v1.22, Frog Dance Software). De 50% perturbation størrelsesorden var ca. overensstemmelse med de offentliggjorte blots. En stigning i Her2 50% førte til en stigning på ca. 50% i PSA-ekspression i C-33 uden androgen (fig. 5A, bane 1 og 3). Mens en formindskelse på 50% i Her2 i C-81 førte til en lignende nedgang i PSA sekretion (fig. 5B, bane 1 og 2). Yderligere afbrydelse af Her2 effektivt blokeret PSA udtryk i C-81 uden androgen (fig. 5B, bane 3). En reduktion på 50% af MEK, en af ​​de tre primære proteinkinaser i MAPK, resulterede i reduceret PSA ekspression i C-81 (fig. 5B, bane 4). Mens en stigning på 50% af MEK i C-33 steg PSA-ekspression med 5-fold (Fig. 5A, bane 2). Kombinationen af ​​MEK-inhibering og Her2-aktivering (50% stigning i Her2 og et fald i MEK 50%) faldt PSA ekspression i C-33 (fig. 5A, bane 4). Endvidere modellen

forudsagt

en stigning i C-33 PSA niveauer 72 timer efter en 2 nM tilsætning af androgenet testosteron. Simuleringer udført med 10% af den AR begyndelsestilstand forudsagde en omtrentlig 50% reduktion i testosteron stimuleret PSA (fig. 6B). Den nedsatte PSA niveauer er i overensstemmelse med de indberettede eksperimentelle data om AR antisense knock-downs i androgenafhængige LNCaP celler [61]. Disse data var

ikke

inkluderet i ensemblet beregninger. Tilsammen modellen kopieres kvalitative træk ved forholdet mellem MAPK, AR aktivering og androgen handling. Hertil kommer, at kvalitative aftale mellem model og eksperimenter for PSA og cyklin D udtryk foreslået, at transskription og translation delsystem modeller fungerer korrekt.

følsomhed og robusthed Analyse Revealed Key delsystemer i AI og AD Celler

følsomhedsanalyse identificeret interaktioner vigtige i C-33, C-51 og C-81-celler (fig. 7 og tabel S4). Vi beregnede samlede State Følsomhed koefficienter (OSSCs) for de tre LNCaP kloner over parameter ensemble (materialer og metoder). De OSSC værdier blev rangeret-bestilt baseret på deres absolutte størrelse. Den dissociation af AR fra Heat Shock Proteins (HSP), dele af Akt signalering aktivering akse og MAPK var vigtige (top 2% af følsomme interaktioner), uanset androgen status. Afsondret AR var ude af stand til at blive aktiveret af androgener eller MAPK. Således steg AR-HSP dissociation fremmes øget AR aktivering og AR-drevet genekspression. Flere komponenter af MAPK cascade var også vigtigt herunder Ras-binding til GAP og Raf, og dephosphorylering af ERK. Følsomheden af ​​MAPK var ikke uventet. ERK var kritisk at forbyde aktivering af AR. Desuden blev ERK-aktivering modelleret som værende Ras afhængige. Vi fandt også Akt signalering akse at have komponenter i top 2% af følsomme interaktioner uanset androgen status. For eksempel dannelsen af ​​PIP3, et tidligt trin i PI3K /Akt signalering akse reguleret af PTEN, viste sig at være meget følsomme i alle klonerne. Ser ud over den øverste 2% af følsomme interaktioner blev yderligere fælles mekanismer identificeret. Disse omfattede AR interaktioner med DHT, rekruttering af adapter molekyler ved Her2, aktivering af ERK af MEKpp og yderligere regulering af PIP3 dannelse ved PTEN

A:. Sammenligning af den gennemsnitlige OSSC parameter rangerer for C-33 og C -81 LNCaP modeller. Store rækker angiver skrøbelighed. Points tilbage af 45 linje er vigtigere i C-33, mens skift til højre viser øget betydning i C-81. Points er organiseret efter biologisk funktion. B: Sammenligning af den gennemsnitlige OSSC parameter rangerer for oversættelse mekanismer (herunder rolle Akt signalering i translationsinitiering) i C-33 versus C-81 LNCaP kloner. Fejlsøjlerne angiver en standardafvigelse centreret omkring middelværdien ensemble værdi. C: Den endelige mekanisme i PSA transskription bliver stadig mere robust w.r.t cancer aggressivitet, som indikeret ved en signifikant reduktion i middel OSSC Rank. D: Den endelige mekanisme i PSA oversættelse (translation terminering) var stadig mere skrøbelig w.r.t kræft aggressivitet, som indikeret af en betydelig stigning i den gennemsnitlige OSSC rang. Resultaterne indikerer et skift i flaskehalsen til generering af PSA fra transkription til oversættelse som prostatacancerceller mister deres androgen afhængighed. Toppen og bunden af ​​hver kasse betegne 25. og 75. percentil af OSSC rang over parameter ensemble. Centret linje angiver medianværdien. Whiskers viser de længst observationer og sorte kors angiver outliers.

Oversættelse interaktioner blev mere skrøbelig mens transskription blev mere robust med stigende androgen uafhængighed. Her2 auto-aktivering og Her2 cPAcP interaktioner var også stadig vigtigere med stigende androgen uafhængighed. Forskellen i betydningen af ​​interaktioner i AI versus AD LNCaP kloner blev estimeret ved at beregne forskydninger i følsomhed rankings (tabel S5). Virksomheden skal overveje C-33 og C-81 analyserede vi en tredje klon, C-51, som var moderat androgen afhængig. Der var 117 statistisk signifikante forskydninger (52 mere og 65 mindre følsom) mellem C-81 og C-33 kloner. Men kun 14 skift blev større end en standard over middelværdien skift. Af de 14 store forskydninger, 50% er involveret PSA og PAcP oversættelse mens resten var forbundet med Her2 og cPAcP. Omvendt PSA transskription blev mere robust med stigende androgen uafhængighed. Tilsvarende, når man sammenligner C-33 til C-51, PSA oversættelse og Her2-aktivitet blev mere følsom med stigende androgen uafhængighed. Inspektion af betydningen af ​​det sidste trin i PSA transskription og translation mellem de enkelte modeller i ensemblet viste et skift væk fra transskription (fig. 7C) mod oversættelse (fig. 7D) på tværs af befolkningen af ​​modeller. Den stigende betydning af oversættelse var ikke begrænset til PSA, selvom PSA var den mest betydningsfulde eksempel. Globalt 16 af de 52 interaktioner, der var mere følsomme i C-81 involveret oversættelse mens kun 4 af 52 involverede transkription. Ingen oversættelse mekanismer blev mere robust i C-81 i forhold til C-33. Svarende til PSA, oversættelse af andre vigtige proteiner såsom cPAcP blev mere følsom i C-81 versus C-33. Af de statistisk signifikante forskydninger, 7/9 af de cPAcP oversættelse interaktioner var mere følsomme i C-81. Derudover begge mekanismer til fosforylering af 4E-BP1 af TOR-kinase, et vigtigt skridt i translationsinitiering der frigiver eIF4E, var også mere betydning i C-81. Tilsammen følsomhedsanalysen foreslået, at skrøbeligheden af ​​den translationelle delsystem direkte korreleret til androgen uafhængighed.

For at kvantificere effekten af ​​forstyrrende vigtige arter i C-81 kloner vi præfabrikerede robusthed analyse på fire funktionelle proteinmarkører. De indledende betingelser for syv vigtige protein arter blev ændret med en faktor 10, 0,1 eller 0 for knock-in, knock-down eller knock-out forstyrrelser, hhv. Vi derefter beregnet effekten af ​​disse perturbation på cyclin D og PSA ekspressionsniveauer sammen med ERK og AR aktiveringsniveauer. Forstyrrelse af Raf, MEK eller ERK havde lignende effekt på de funktionelle markører med ERK er den mest bemærkelsesværdige (fig. 8, banerne 1, 2 og 3). Trivielt, ERK perturbationer direkte bevirkes ERK aktiveringsniveauer. Men endnu vigtigere, ERK perturbationer spænder bevirkes cyclin D ekspressionsniveauer. ERK knock-ins omtrent fordoblet cyklin D, mens ERK knock-outs reduceret cyklin D til mindre end en tredjedel af vildtype-niveauer. De funktionelle markører var robust over for forstyrrelser i AKT og TOR med forskellige effekter på ERK aktivitet og mindre fald i ekspressionsniveauerne upon AKT eller TOR knock-out (fig. 8, bane 4 og 5). Endvidere translationsinitierings- faktor eIF4E demonstrerede en begrænsende reagens adfærd i ekspressionen af ​​både cyclin D og PSA mens forstyrrelser i 4E-BP1 havde ringe virkning (figur 8, bane 6 og 7). Dog kunne 4E-BP1 resultater være en artefakt af kunstigt høje baggrundsniveauer af eIF4E som ingen direkte målinger eIF4E indgik i træningsdata. Knock-i simuleringer af eIF4E demonstrerede en 8,7 og 5,2 fold stigning i cyklin D og PSA udtryk. Reduktion af eIF4E resulterede i et tab 89% af udtryk og, fuld knock-out simuleringer forudsagde et fuldstændigt tab af cyklin D og PSA.

Udtrykket niveau på syv vigtige proteiner blev ændret med en faktor 10,. 1 eller 0 (knock-in, knock-down eller knock-out) og robusthed koefficienter (areal under kurven for den perturbed versus vildtype simulering) blev beregnet for cyclin D og PSA ekspressionsniveauer sammen med ERK og AR aktiveringsniveauer. Simuleringer blev kørt for C-81, med den angivne perturbation, at tilnærme ligevægt, og 10 nM af DHT blev tilsat i 72 timer. Ensemble middelværdier rapporteres.

De MAPK og Akt Pathways Synergistisk Aktiveret cyclin D Expression

Komplekse systemer bestående af interagerende delsystemer kan vise emergente egenskaber, der ikke forklares af de enkelte delsystemer alene [62]. I cancer biologi, er det almindeligt at tale om signaltransduktionsveje, som om de blev isoleret. I virkeligheden er disse komponenter høj grad indbyrdes forbundne og kan interagere i en række forskellige måder undertiden fører til uforudsigelige adfærd.