PLoS ONE: MALDI Profilering for Human Lung Cancer undertyper

Abstrakt

Baggrund

Proteomics forventes at spille en central rolle i kræft biomarkør opdagelse. Selv om det er blevet muligt hurtigt at analysere proteiner fra rå celleekstrakter ved hjælp af massespektrometri, kompleks prøve sammensætning hæmmer denne type måling. Derfor, for effektiv proteomanalyse, bliver det afgørende at berige prøver til analytterne af interesse. Trods at en tredjedel af proteinerne i eukaryote celler menes at være phosphoryleret på et tidspunkt i deres livscyklus, kun en lav procentdel af intracellulære proteiner er phosphoryleret på et givet tidspunkt.

Metodologi /vigtigste resultater

i dette arbejde har vi anvendt kromatografiske phosphopeptid berigelse teknikker til at reducere kompleksiteten af ​​humane kliniske prøver. En hidtil ukendt fremgangsmåde til high-throughput peptid profilering af humane tumorprøver under anvendelse Parallel IMAC og MALDI-TOF MS, er beskrevet. Vi har anvendt denne metode til at analysere humane normale og cancer lunge prøver i jagten på nye biomarkører. Ved hjælp af en meget reproducerbar spektral behandling algoritme til at producere peptid masse profiler med minimal variation på tværs af prøverne blev lineære diskriminant-baserede og beslutningsprocesser træ-baserede klassifikationsmodeller genereret. Disse modeller kan skelne normale fra tumor prøver, samt skelne de forskellige ikke-småcellet lungecancer histologiske undertyper.

Konklusioner /Betydning

En roman, optimeret prøveforberedelse metode og en omhyggelig data opkøbsstrategi er beskrevet for high-throughput peptid profilering af små mængder af humane normale lunge og lungekræft prøver. Vi viser, at den rette kombination af peptid udtryk værdier er i stand til at skelne normal lunge fra ikke-småcellet lungekræft prøver og mellem forskellige histologiske undertyper. Vores undersøgelse gør understrege det store potentiale af proteomics i den molekylære karakterisering af kræft

Henvisning:. Gámez-Pozo A, Sánchez-Navarro I, Nistal M, Calvo E, Madero R, Díaz E, et al. (2009) MALDI Profilering for Human Lung Cancer undertyper. PLoS ONE 4 (11): e7731. doi: 10,1371 /journal.pone.0007731

Redaktør: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hongkong

Modtaget: Juli 3, 2009; Accepteret: 8 oktober 2009; Udgivet: 5. november 2009

Copyright: © 2009 Gámez-Pozo et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: yde støtte : FIS KP05 /00248, FIS PI050668 og Red Tematica de Investigacion Cooperativa en Cancer (RTICC, RD06-0020-1022) fra Fondo de Investigacion Sanitaria (Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovacion, Spanien). Grant finansieret af Fundacion Mutua Madrilena. A. Gamez-Pozo er modtageren af ​​et stipendium fra Ministerio de Educación, Spanien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i vestlige lande, lungekræft repræsenterer den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald [1]. Det 5-års samlet overlevelse sats er 15% og har ikke forbedret over mange årtier. Det er primært fordi ca. to tredjedele af lungekræft opdages ved fremskredne stadier. Selv blandt patienter tidlige fase, som behandles primært ved operation med helbredende hensigt, vil 30-55% udvikle og dø af metastaser gentagelse [2].

I dag er lungekræft klassificeret i henhold til histologiske kriterier. De fire vigtigste undertyper er: småcellet lungecancer (SCLC), pladecellecarcinom (SC), adenocarcinom (AC), og storcellet carcinom (LC). Klinisk, de sidste tre betragtes som ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som tegner sig for omkring 85% af alle lungekræfttilfælde [3]. Præcis diagnose og klassificering af kræft er afgørende for valget af passende behandlinger. Fremkomsten af ​​effektive målrettede behandlinger for lungekræft, såsom epidermal vækstfaktor receptor-hæmmere erlotinib og gefitinib, og udsigten til at udvikle yderligere målrettede behandlinger, har understreget betydningen af ​​præcis diagnose [4].

Proteomics er forventes at spille en central rolle i kræft biomarkør opdagelse. Selv om det er blevet muligt hurtigt at analysere proteiner fra rå celleekstrakter ved hjælp af massespektrometri, prøve kompleksitet komplicerer disse undersøgelser [5], [6]. Derfor, for effektiv proteomanalyse er det vigtigt at berige prøver til analytterne af interesse [7]. Trods det faktum, at en tredjedel af proteinerne i eukaryote celler menes at være phosphoryleret på et tidspunkt i deres livscyklus, kun en lav procentdel af de intracellulære proteiner er phosphoryleret på ethvert givet tidspunkt [8], [9]. Således ville en rensning eller berigelse skridt, der isolerer phosphorylerede arter reducere kompleksiteten og øge følsomheden [10].

MALDI profilering er en af ​​de mest lovende teknikker til at mindske kløften mellem high-throughput proteomics og klinik [7] , [11]. MALDI MS kan bruges som en høj-throughput metode med fremragende følsomhed [6], hvilket muliggør undersøgelser kompromittere store serier af patienter, og har potentialet til at revolutionere tidlig diagnosticering af mange sygdomme [12]. Denne kapacitet er blevet eksemplificeret ved MALDI protein profilering på tumor prøver, der er tilladt at identificere markører, der kan være korreleret med histologiske vurdering og patientresultater gennem statistisk analyse [13], [14]. I dette arbejde har vi anvendt phosphopeptidsøjler berigelsesteknikker til små humane kliniske prøver baseret på immobiliseret metalaffinitetschromatografi (IMAC) for at reducere prøven kompleksitet. For at detektere nye biomarkører, har vi defineret en dataanalyse workflow anvender lineære diskriminant-baserede og beslutningsprocesser træ-baserede klassifikationssystemer metoder til at analysere peptid profiler fra humane normale og cancer lunge prøver ved massespektrometri.

Metoder

Etik erklæring

på tidspunktet for første diagnose, havde alle patienter forudsat samtykke i den forstand, at deres tumorprøver kunne anvendes til testpræparater formål. Institutionel godkendelse fra vores etiske komité blev opnået for gennemførelse af undersøgelsen (Comité Ético de Investigación Clínica, Hospital Universitario La Paz). Data blev analyseret anonymt. Patienterne forudsat skriftligt samtykke, således at deres prøver og kliniske data kan bruges til undersøgelsesformål

Sample valg

Frosne prøver fra patienter diagnosticeret med lungekræft:. (15 Adenocarcinom (AC), 15 Pladecellekræft celle carcinom (SC) og 14 storcellet carcinom (LC) prøver) og 15 normale lunge (NL) prøver blev hentet fra Patologisk Institut for Hospital Universitario La Paz (Madrid, Spanien). De histopatologiske træk af hver prøve blev gennemgået af en erfaren lunge patolog at bekræfte diagnosen og tumor indhold. Støtteberettigede prøver skulle omfatte mindst 50% af tumorcellerne.

Total protein udvinding, solubilisering, og fordøjelse

Prøver blev skåret i en Leica CM3050S kryostat, opnåelse 10 afsnit af 10 mikron tykkelse hver. Væv blev forarbejdet med TRIzol-reagens (Invitrogen, Carsbald, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Pellets blev resuspenderet i guanidinhydrochlorid 6 M og opvarmet 10 minutter ved 95 ° C under omrøring. Efterfølgende blev 950 pi 50 mM ammoniumbicarbonat (pH 7-9) per prøve tilsat. koncentration proteinprøve blev målt ved MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Trypsin MS Grade Guld (Promega, Madison, WI, USA) blev tilsat til hver prøve til en 01:50 forhold. Fordøjelse blev udført natten over ved 37 ° C. Den fordøjede prøve blev delt i to portioner.

Parallel IMAC (PIMAC)

IMAC-Fe (III) baseret blev udført i en portion af fordøjet protein med PHOS-Select Iron Affinity Gel (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA) ifølge producentens anvisninger. IMAC-baserede Ga (III) blev udført i den anden portion af spaltet protein med phosphopeptid Isolation Kit (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) ved at følge producentens instruktioner. Prøver blev opbevaret ved -20 ° C indtil yderligere analyse.

phosphopeptid analyse ved massespektrometri

peptidblandinger blev vakuumtørret og opløst i en opløsning indeholdende acetonitril (30%) og TFA (0,1% ). Efter bad-sonikering (3 min), peptiderne var 01:01 blandet med enten α-cyan-4-hydroxykanelsyre (CHCA) eller 2,5-dihydroxybenzoesyre (DHB), der anvendes som matricer. Et volumen på 0,5 pi blev anbragt på MALDI plade og blev holdt ved stuetemperatur, indtil tørret. MALDI-MS-spektre (to gentagelser) blev målt på et Bruker Ultraflex TOF /TOF MALDI massespektrometer (Bruker-Daltonics, Billerica, MA, USA) [15] i positiv ion reflektor mode. Til identifikation protein, peptid ioner af interesse var genstand for MALDI-MS /MS-analyse i TOF /TOF-tilstand, og den tilsvarende MS /MS-spektre blev overført via MS Biotools programmet (Bruker-Daltonics, Billerica, MA, USA) som input til at søge i NCBInr databasen ved hjælp MASCOT software (Matrix Science, London, UK) [16].

Differential m /z toppe valg

ClinProTools (CPT) software 2.1 (Bruker-Daltonics , Billerica, MA, USA) blev anvendt til at vælge differentielle m /z toppe blandt prøver undertyper (NL, AC, SC og LC). Spectra blev behandlet som følger:

Normalisering af alle spektre til deres samlede Ion Count,

Rekalibrering af spektre på hinanden ved hjælp af de mest fremtrædende m /z toppe,

Baseline subtraktion og m /z topdetektion.

Når standardiseret og justeret, CPT vælger masse intervaller der blev betragtet som m /z toppe, og beregner peak områder for hvert spektrum [17]. Spectra blev delt i to sæt (Set 1 og Set 2), som omfatter et andet sted måling per prøve. Hvert sæt blev delt i fire spektre grupper afhængigt af kombinationer mellem MALDI-matrix og IMAC metal (Mx-Mt), der anvendes til at opnå dem (DHB-Fe, DHB-Ga, CHCA-Fe og CHCA-Ga). Hver af disse spektre grupper blev efterfølgende opdelt i histologiske undergrupper (NL, AC, SC og LC) og analyseret separat ved CPT. CPT indstillinger var S /N 3 og Savitzky-Golay udjævning (1 cyklus, m /z interval = 5) [18]. Kombinationen af ​​disse lister giver en kombineret Mx-Mt m /z peak listen. Så inkluderet vi alle spektre af en Mx-Mt kombination i CPT at måle alle m /z toppe i korrespondent kombineret Mx-Mt m /z peak listen. Peaks med Kruskal-Wallis p-værdi 0,1 blev kasseret. Fælles m /z toppe mellem to sæt blev udvalgt. Endelig blev Pearson test mellem områdets værdier for hver m /z peak opnået i Set 1 og Set 2 for alle prøver udføres, og m /z toppe med r 0,4 blev udelukket. Således har vi fået fire endelige Mx-Mt lister over m /z-toppe: DHB-Fe, DHB-Ga, CHCA-Fe og CHCA-Ga lister. Udvalgte m /z toppe blev anset konsekvente toppe.

Discriminant Analyse og model generation

Discriminant Analyse af hver endelige Mx-Mt m /z peak lister blev udført i SPSS 9.0. m /z toppe inkluderet i hver diskriminant model blev inkluderet i en anden Trinvis Discriminant Analysis, som tillod oprettelsen af ​​en global model diskrimination, herunder m /z toppe fra alle Mx-Mt kombinationer.

Overvåget hierarkisk klyngedannelse

Kort fortalt er en vektor tildelt hver pseudo-element, og denne vektor anvendes til at beregne afstanden mellem denne pseudo-post og alle resterende elementer eller pseudo-elementer ved hjælp af samme lighed metriske, der blev brugt til at beregne den indledende lighed matrix. Analyser blev udført i BRB-ArrayTools v3.6.1 udviklet af Dr. Richard Simon og Amy Peng Lang.

Afgørelse-tree ensemble algoritme

Med henblik på at vælge toppe, der kunne skelne mellem histologiske undertyper af prøver lungekræft, vi byggede en multi-peak klassificeringen hjælp AdaBoost beslutningstræ-baserede klassificeringen ensemble [19], [20]. Tre uafhængige analyser blev udført: AC vs. (SC + LC), LC vs. (AC + SC) og SC vs. (AC + LC) under anvendelse af endelige DHB-Ga m /z peak listen. Normaliserede m /z peak intensitetsværdier fra SÆT1 blev anvendt som træningssæt. Normaliseret m /z peak intensitet værdier fra SET2 blev brugt som test sæt. 200 iterationer blev udført i alle tilfælde. Arealet under ROC (Modtagelse Betjening Karakteristisk) kurven (AUC) er lig med sandsynligheden for korrekt at klassificere et par prøver, hver for en separat klasse, og anvendes som en måling af klassifikator ydeevne (20). Statistiske analyser blev udført i R-version 2.4 med Boost softwarepakken udgave 1,0-0 og SPSS 9.0.

statistiske analyser for identificerede toppe

Efter protein identifikation ved MS /MS, ANOVA (når det er muligt ) og Kruskall-Wallis analyser blev udført for at vurdere forskelle i ekspressionen af ​​sådanne proteiner i de forskellige histologiske undertyper. Mann-Whitneys U blev anvendt til at studere forskelle mellem to undergrupper efter Kruskall-Wallis-analyser. Statistiske analyser blev udført i SPSS 9.0.

Immunhistokemi

formalin-fikseret, paraffinindlejrede væv blokke, repræsentant for NSCLC diagnose, blev hentet efter rutine histopatologisk vurdering. Sektioner blev behandlet på en Dako Autostainer universal farvning systemet (Dako, Glostrup, Danmark). Til denne undersøgelse blev 3,5-um snit immunfarvet med monoklonalt antistof Ck8 (1:100 fortynding Novacastra, Newcastle upon Tyne, UK). To vævssnit fra hver prøve blev evalueret.

Resultater

Det primære formål med denne undersøgelse var at teste, om tryptiske peptid profiler, opnået fra humane normale og tumor lunge prøver ved hjælp PIMAC og MALDI- TOF MS-teknikker, kunne diskriminere Normal Lung (NL) af lungekræft, samt mellem de mest almindelige lungekræft histologiske undertyper: adenocarcinom (AC), Large Cell carcinom (LC) og pladecellekræft (SC). Kun 49 fra 59 prøver blev udvalgt til den følgende analyse, fordi prøver uden et indhold på 50% tumorceller minimum blev kasseret. Således blev efterfølgende analyseret 15 NL, 14 AC, 9 LC og 11 SC prøver. Massespektret genereret for hver prøve indeholdt typisk flere hundrede toppe med S /N . 3 [5]

Masse signalintensiteter af tryptiske peptider afledt af komplekse proteinblandinger medieres af flere faktorer, nemlig relative proteinkoncentration , varierende enzymatisk fordøjelse effektivitet, og sekvensafhængige desorption /ionisering effektivitet. Vi udførte en procedure meget reproducerbar spektre processer for at frembringe peak profiler med en høj grad af sammenfald i prøven serien. Ensartede m /z toppe blev udvalgt efter disse kriterier: masse toppe skulle være til stede i begge eksempler pletter og Pearsons korrelation mellem intensiteter af hver top opnået i Set 1 og Set 2 for alle prøver skulle være 0,4. Mean Pearsons korrelationskoefficient var 0,8 for DHB toppe og 0,65 for CHCA toppe. En yderligere krav (Kruskal-Wallis p-værdi 0,1) blev anvendt til at omfatte toppe med diskriminerende magten mellem prøven undertyper. Disse kriterier forudsat en konsekvent og reproducerbar metode, som det fremgår af gennemsnitlig Pearsons korrelationskoefficient på udvalgte masse toppe.

Vi har undersøgt overlapningen mellem toppe udvalgt af hver af Mx-Mt kombinationer (Figur S1). Samlet set blev 97 sammenhængende masse toppe identificeret på tværs af de fire Mx-Mt kombinationer. Med hensyn til MALDI matricer, blev 81 toppe målt i DHB og 41 i CHCA analyser. I modsætning hertil blev 80 toppe målt i Ga-baserede iMac og 42 i Fe-baserede IMAC analyser. I begge tilfælde blev der fundet 25 overlappende toppe. Kun fire toppe var konstant til stede på tværs af alle Mx-Mt kombinationer.

Når konsekvente toppe var blevet udvalgt, blev en Trinvis Discriminant Analyse udført i hver afsluttende Mx-Mt peak listen. Derfor blev fire diskriminant modeller konstrueret og massen signaler er involveret i hver model, er anført i tabel S1. Alle disse diskriminant modeller var i stand til at klassificere prøverne i fire grupper, der svarer til NL, AC, SC og LC. Procenter af korrekt klassificerede prøver ved hver model og forlade-én-out cross-validering procentdele af korrekt klassificerede prøver er vist i tabel S1. En anden Trinvis Discriminant Analyse blev udført med toppe inkluderet i de fire Mx-Mt Discriminant modeller (22 peaks) for at undgå at medtage støjende masse signaler i analysen. Global Model omfattede 9 m /z toppe og korrekt klassificeret 98,0% af prøverne (48 af 49) i LOOCV.

Vi udførte en Overvåget Hierarkisk Centroid Linkage Clustering ved hjælp af de 9 toppe indgår i Global Model. Som vist i figur 1, er der to hovedgrupper, der adskiller normale lunge prøver fra de fleste tumorprøver. Men der er ikke perfekt adskillelse mellem histologiske undertyper. Med henblik på at udvælge masse signaler, der kunne karakterisere prøver fra en histologisk subtype sammenlignet med de øvrige undertyper af NSCLC prøver blev AdaBoost beslutningstræ-baserede klassifikator ensemble udført. Tre uafhængige analyser blev udført: AC vs (SC + LC), LC vs. (AC + SC) og SC vs (AC + LC), ved hjælp af data i Set 1 uddannelse sæt og data i Set 2 som test sæt fra den endelige DHB-Ga peak listen. Arealet under kurven (AUC) fra ROC blev beregnet for hver sammenligning i både træning og test sæt. Den relative indflydelse af hver top i model generation blev opnået. Arealet under ROC-kurven og top toppe for hver sammenligning er vist i tabel 1.

Heat Kort over Overvåget Hierarkisk Centroid Linkage Gruppering af normaliserede m /z toparealer, i to dimensioner, for de 49 prøver, og de 9 m /z toppe indgår i den globale diskriminant model.

MS /MS identifikation af nogle m /z toppe udvalgt af diskriminant og AdaBoost analyser blev udført af MALDI-TOF /TOF ( tabel S2). For at evaluere forskelle i identificerede peptid signaler blandt histologiske undertyper, analyser ANOVA og Kruskal-Wallis blev udført. p-globin masse signaler viste en signifikant nedsat styrke i tumorprøver i sammenligning med normale lunge dem, mens GAPDH og p-actin toppe viste øget intensitet i tumorprøver. Ck8 topintensiteten faldt i storcellede carcinomer sammenlignet med adenocarcinom og pladecellecarcinom prøver.

ekspressionsmønster ved immunhistokemi (IHC) af nogle af disse markører blev analyseret. Det humane protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) [21] viser ekspression og lokalisering af proteiner i en lang række humane normale og cancer væv samt cellelinier ved hjælp af IHC. IHC udtryk profiler for β-actin og GAPDH blev vurderet på denne nyttige database. Der er en øget ekspression af β-actin i nogle lungekræft prøver sammenlignet med normale dem. Men GAPDH udtryk i lungekræft er meget varierende. Desuden har vi udført IHC analyser af Ck8 ekspression i fem AC, LC og SC-prøver. Positive celler for Ck8 immunfarvning blev fundet i alle LC og AC prøver. Derimod viste kun tre af fem SC prøver positiv farvning. Positivt farvede prøver viste i gennemsnit 20-70% farvede celler (figur 2).

Ck8 immunfarvning (forstørrelse x 40). Pile peger på tumorceller. (A) pladecellekarcinom lungen viser negative farvede tumorceller. Lunge epitel viser positiv farvning. (B) pladecellekarcinom lungen positivt farvede. (C, D) storcellet lungecarcinom viser forskellige grader af positiv farvning. (E, F) adenocarcinom i lungerne viser forskellige grader af positiv farvning.

Diskussion

Global gen-udtryk profilering har forbedret vores forståelse af den histologiske heterogenitet af ikke-småcellet lungekræft og har identificeret potentielle biomarkører og gen underskrifter til klassificering af patienter med markant forskellige overlevelse udfald [22]. En omfattende forståelse af mekanismerne bag carcinogenese, tumor progression, og metastase vil kræve en tilbundsgående analyse af ikke blot genomet, men også den proteom [23]. Analyser på genniveau kan ikke registrere de biologiske finesser indført gennem post-translationelle modifikationer af proteiner og kræver således en proteomisk tilgang [5], [24].

Reproducerbarhed har vist sig at kompromittere protein profilering i alle faser, fra peptid isoleringsmetoder prøve spektre erhvervelse og behandling [5], [11], [25], [26]. I denne undersøgelse har vi anvendt phosphopeptid berigelse kromatografiske teknikker til at reducere kompleksiteten af ​​menneskelige lungekræft prøver og analyseret isoleret peptider ved MALDI-TOF MS. Vi beskriver en masse peak udvælgelsesmetode som giver en reproducerbar peptid profil fra MALDI MS forsøg med ClinProTools. Groseclose et al. beskrev en begrænsning af anvendelse af CPT er, at toppe, der kan være signifikant blandt en lille delmængde af spektre i en gruppe, kan blive ubetydelig i gennemsnit med de andre spektre ved, at [5] gruppe. For at evaluere så mange toppe som muligt, udførte vi en tidligere trin i peak selektion ved anvendelse af CPT. I hver Mx-Mt analyse blev alle spektre fra en enkelt prøve subtype indført i CPT, opnåelse af et subtype karakteristisk top liste. Når alle undertype lister blev opnået, blev en ny liste genereres af kombinationen, herunder alle tilstedeværende toppe i disse undertype lister. Bagefter spektre fra alle prøve undertyper blev inkluderet i CPT, og alle toppe i denne kombinerede liste blev målt. Vi bekræftede, at nogle diskriminant toppe blev udelukket, da spektre fra alle eksempler undertyper indregnes direkte i CPT og er udført standard analyse.

Det er bemærkelsesværdigt, at når du bruger DHB som MALDI matrix forudsat et højere antal af masse toppe som sammenlignet med CHCA. Ligeledes Ga-baserede IMAC tilgang fører flere masse signaler sammenlignet med Fe-baseret assay. Desuden peak lister afledt af DHB-spektre viste en højere gennemsnitlig korrelation mellem datasæt. Disse resultater tyder på, at MALDI analyser bruger Ga-baserede iMac og DHB som MALDI-matrix er mere reproducerbar og giver et større antal af masse signaler. Toppene identificeres afledt af højt udtrykte proteiner og de resterende diskriminerer peptider kunne ikke identificeres ved MALDI MS. Alternative identifikation strategier bør testes for at øge identifikationen af ​​lavintensive signaler i MALDI MS studier.

Discriminant analyser tilladt os at adskille normale lunge- og NSCLC prøver og til at identificere de peptider, som bedst diskriminerede mellem normal og syge væv, som vist ved clustering analyse (figur 1). Men denne opgave er normalt ikke problematisk på grund af de betydelige forskelle mellem normale og cancer væv. Hvad beviser tricky er at finde forskelle mellem forskellige histologiske undertyper. Som vist i figur 1, er der to hovedgrupper af prøver lungecancer, herunder adenocarcinomer og storcellede carcinomer separat, men pladecellecarcinom prøver splittet mellem disse klynger.

Det er blevet beskrevet, at ensemble klassifikatorer udkonkurrerer enkelt beslutning træer klassificeringen ved at have større nøjagtighed og mindre forudsigelsesfejl når de anvendes til proteomics datasæt [27]. Så vi testede hvis AdaBoost analyser kunne klassificere de forskellige NSCLC prøverne korrekt. Vores resultater antyder, at AdaBoost kan skelne prøver af én lungekræft histologisk subtype fra de to andre. Brugen af ​​tekniske gentagelser som test sæt tilladt os at vurdere robustheden af ​​den anvendte metodologi.

Vores data tyder på, at både GAPDH og β-actin har en signifikant øget udtryk i prøver lungekræft. Overekspression af GAPDH i humane lungecancere blev tidligere beskrevet af Tokunaga et al [28], og der er mange publikationer, der viser forøget ekspression af GAPDH i bryst- [29], pancreas [30] og cervikale [31], [32] humane cancere. På den anden side, flere undersøgelser indikerede, at β-actin differentielt blev udtrykt i human cancer (oversigt i 28). Begge proteiner viste øget niveauer i rotte hepatoma [33]. Desuden IHC udtryk profiler for β-actin og GAPDH, vurderet i det humane protein Atlas, var meget variable i prøver lungekræft. Disse resultater spørgsmålstegn ved brugen af ​​disse proteiner som husholdning produkter i proteomikanalyser af tumor prøver.

Cytokeratin 8 (Ck8) er en type II mellemliggende filament protein der vedvarende udtrykt i de fleste epitelmalignanser [34], herunder alle NSCLC undertyper [35]. Forøgede niveauer af Ck8 i sera har været forbundet med tumorprogression og nedsat overlevelse hos patienter med NSCLC [36]. I modsætning til disse rapporter, vi ikke observere øget udtryk for Ck8 i tumorprøver ved MALDI-MS-analyser. Vi fandt imidlertid, at Ck8 niveauer faldt i store celle karcinom prøver sammenlignet med normal lunge.

For at vurdere nytten af ​​Ck8 udtryk som en biomarkør af store celle carcinomer, vi udførte IHC analyser af Ck8 udtryk i 15 lung cancer prøver (fem AC, fem LC og fem SC). Det er vores opfattelse, kunne ingen konklusion gøres om forholdet mellem IHC og peptid udtryk profilering fra vores data. Denne forskel mellem teknikker kan skyldes phosphopeptid berigelse inden prøveanalyse eller kunne medføre, at MS tilgange er mere følsomme end IHC. Det peptid identificeret ved MALDI MS /MS (DVDEAYMNKVELES) indeholder en potentiel fosforylering websted på Tyr204, relateret til phosphorylering med onkogene kinaser [37]. Tidligere undersøgelser vurderer nytten af ​​Ck8 som biomarkør i lungekræft ikke omfatter nogen storcellet carcinom [35], [36].

Undersøgelsen har nogle begrænsninger. Der er således begrænset kapacitet til at identificere mindre masse toppe baseret på MS /MS-analyse af relativt komplekse peptidblandinger. Men MALDI MS har nogle fordele for biomarkører,: kan genereres proteinekspression og relative kvantificering data for flere patient vævsprøver i et enkelt eksperiment. På den anden side, sammenligning af IHC og peptid profilering udtryk værdier forhold skal udføres omhyggeligt, da det lader til, at forudgående affinitet berigelse af prøver kunne indføre nogle bias.

Men vores undersøgelse ikke understrege det store potentiale for proteomics i den molekylære karakterisering af cancer. Identifikation af differentielt udtrykte proteiner ved PIMAC og MALDI-TOF /TOF MS blev udført på fraktionerede tryptiske fordøjelser afledt af små mængder af væv fra normale lunge og NSCLC prøver. Ved hjælp af en optimeret prøveforberedelse metode og en omhyggelig datafangst strategi, vi overvandt den største udfordring af reproducerbarhed af MALDI MS-baserede peptid profilering. Uanset arten af ​​peptiderne identificeret ved MS /MS, den passende kombination af peptidekspression værdier er i stand til at skelne normal lunge fra NSCLC prøver og mellem de forskellige NSCLC histologiske undertyper. Fremtidige undersøgelser er rettet mod oprettelse peptid profilering som et nyttigt redskab i opdagelsen af ​​nye biomarkører med potentiel diagnostisk eller theragnostic relevans.

Støtte Information

Figur S1.

Venn diagrammer viser m /z toppe overlapper mellem endelige m /z peak lister fra:. (A) fire forskellige Mx-Mt kombinationer, (B) IMAC harpiks, og (C) MALDI matricer

doi: 10,1371 /journal.pone.0007731.s001

(0,04 MB PPT)

tabel S1. Salg Procenter af korrekt klassificerede prøver, leave-én ud cross-validering procentdele af korrekt klassificerede prøver og m /z toppe i hver enkelt Mx-Mt kombination diskriminant model. Peaks i fed er også inkluderet i /z toppe global model diskrimination på 9 m

doi:. 10,1371 /journal.pone.0007731.s002

(0,03 MB DOC)

tabel S2.

differentielt udtrykte peptidmasser fra CHCA-MALDI spektre identificeret ved MALDI-TOF /TOF og MASCOT søgemaskine. Individuel MASCOT ioner scoringer er signifikant (p 0,05)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0007731.s003

(0,03 MB DOC)