PLoS ONE: MUC1-C oncoprotein Regulerer Glycolysis og pyruvatkinase m2 Aktivitet i cancerceller

Abstrakt

Aerobic glykolyse i kræftceller reguleres af flere effektorer, der omfatter Akt og pyruvat kinase M2 (PKM2). Mucin 1 (MUC1) er et heterodimert glycoprotein, der udtrykkes afvigende overudtrykkes af humane bryst- og andre carcinomer. Her viser vi, at transformation af rottefibroblaster af den onkogene MUC1-C-underenheden er associeret med Akt-medierede stigninger i glukoseoptagelse og lactat produktion, i overensstemmelse med stimulering af glykolyse. Resultaterne viser også, at MUC1-C cytoplasmatiske domæne binder direkte til PKM2 på B- og C-domæner. Interaktion mellem MUC1-C cytoplasmatisk domæne Cys-3 og den PKM2 C-domænet Cys-474 viste sig at stimulere PKM2 aktivitet. Omvendt, epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) -medieret phosphorylering af MUC1-C cytoplasmatisk domæne på Tyr-46 Tildelt binding til PKM2 Lys-433 hæmmede PKM2 aktivitet. I humane brystkræftceller, blev silencing MUC1-C er forbundet med fald i glukoseoptagelse og laktat produktion, hvilket bekræfter inddragelse af MUC1-C i reguleringen af ​​glykolyse. Desuden blev EGFR-medieret phosphorylering af MUC1-C i brystcancerceller associeret med fald i PKM2 aktivitet. Disse resultater viser, at MUC1-C underenhed regulerer glykolyse og at dette svar er tillagt delvist af PKM2. Således kunne overekspression af MUC1-C oncoprotein i forskellige humane carcinomer være af betydning for Warburg effekten af ​​aerob glykolyse

Henvisning:. Kosugi M, Ahmad R, Alam M, Uchida Y, Kufe D (2011) MUC1-C oncoprotein Regulerer Glycolysis og pyruvatkinase m2 Aktivitet i kræftceller. PLoS ONE 6 (11): e28234. doi: 10,1371 /journal.pone.0028234

Redaktør: Rebecca Berdeaux, University of Texas Health Science Center på Houston, USA

Modtaget: Juli 1, 2011; Accepteret: November 4, 2011; Udgivet: November 28, 2011

Copyright: © 2011 Kosugi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Grants CA97098, CA42802 og CA100707 udstedt af National Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: DK holder egenkapital i genus Onkologi og er konsulent for selskabet. Genus Oncology holder patentansøgninger for celle-gennemtrængende peptider, såsom GO-203, der blokerer MUC1-C funktion og virksomheden har en relateret peptid under klinisk udvikling. Der er ingen markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kræftceller adskiller sig fra deres normale modstykker ved metaboliske forskelle, der omfatter øget udnyttelse af glukose ved aerob glykolyse. Denne egenskab af maligne celler, kendt som Warburg virkning associerer en høj glucose forbrug med forøget lactat-produktion i nærværelse af oxygen [1]. Aerob glycolyse i cancerceller er blevet forbundet med forøget ekspression af glycolytiske gener [2], [3]. Pyruvatkinase (PK) er en af ​​de opregulerede glycolytiske genprodukter, der katalyserer produktionen af ​​pyruvat og ATP fra phosphoenolpyruvat (PEP) og ADP. Der er fire PK isoenzymer, M1, M2, L og R. M1 isoformen udtrykkes i de fleste voksne celler. M2 isoform (PKM2), en splejsningsvariant af M1, findes i embryoniske celler, visse normale prolifererende celler og cancerceller [4]. Heterogene nukleare ribonucleoproteiner binder til PKM1 mRNA og hæmmer dens splejsning [5]. Konvertering PKM2 udtryk for PKM1 i kræftceller vender Warburg effekten og er forbundet med tab af tumorgenicitet, oprettelse betydningen af ​​PKM2 til aerob glykolyse og spredning af maligne celler [6]. Den tydelige region PKM2, sammenlignet med PKM1, funktioner i allosteriske aktivering af enzymet efter fructose-1,6-bisphosphat (FBP) [7] og dets inaktivering ved phosphotyrosin indeholdende proteiner [8], [9]. Under disse omstændigheder, regulering af PKM2 aktivitet dikterer metabolismen af ​​glucose til pyruvat, som omdannes ved lactatdehydrogenase (LDH) til lactat eller udnyttes af mitokondrie tricarboxylsyre (TCA) cyklussen [10]. Disse resultater har således støttet behovet for mere fuldt ud at forstå de signaler, der regulerer aerob glykolyse og PKM2 aktivitet i maligne celler.

mucin 1 (MUC1) protein er overudtrykt i de fleste humane carcinomer og visse hæmatologiske maligniteter, hvilket gør det en af ​​de mere almindelige ændringer i humane cancere [11]. MUC1 udtrykkes som to underenheder, der danner en heterodimer på cellemembranen. Den store MUC1 N-terminale underenhed (MUC1-N) er positioneret ekstracellulært og indeholder de glycosylerede tandemgentagelser der er karakteristiske for mucin familien. Den MUC1 C-terminale underenhed (MUC1-C) spænder over cellemembranen og indeholder en 58 aminosyre ekstracellulære domæne og et 72 aminosyre cytoplamic domæne [11]. Den MUC1-C ekstracellulære domæne interagerer med galectin-3 og danner derved komplekser på celleoverfladen med den epidermale vækstfaktor receptor (EGFR) [12]. Aktivering af EGFR igen er forbundet med phosphorylering af MUC1-C cytoplasmatisk domæne [11]. Betydeligt, overekspression af MUC1-C underenhed, og specifikt det cytoplasmatiske domæne, er tilstrækkelig til at inducere forankringsuafhængig vækst og tumorigenicitet [13], [14]. Med overekspression af MUC1 i cancerceller, MUC-1-C-underenheden akkumuleres i cytoplasmaet og er målrettet mod kernen, hvor det bidrager til reguleringen af ​​genekspression [11]. I denne henseende er MUC1-C-induceret forandring i forbindelse med aktiveringen af ​​gener involveret med proliferation og tumorigenese [15], [16]. MUC1-C inducerer også en signatur forbundet med lipidmetabolisme og opregulering af gener, der regulerer kolesterol og fedtsyresyntese [17]. Andre undersøgelser har vist, at MUC1-C aktiverer PI3K- Akt pathway [18], [19], som igen stimulerer aktiviteten af ​​glycolytiske enzymer, hexokinase og phosphofructose kinase. Der er imidlertid ingen kendt sammenhæng mellem MUC1-C og den glycolytiske vej.

De foreliggende undersøgelser viser, at MUC1-C er involveret i reguleringen af ​​glukoseoptagelse og laktat produktion i MUC1-C-induceret transformation af rottefibroblaster og i humane brystcancerceller. Resultaterne viser også, at MUC1-C cytoplasmatiske domæne interagerer direkte med PKM2 og regulerer PKM2 aktivitet. Den MUC1-C cytoplasmatisk domæne indeholder en Cys-rest, som binder til PKM2 C-domænet Cys-474 og stimulerer PKM2 aktivitet. Derimod EGFR-phosphoryleret MUC1-C cytoplasmatiske domæne interagerer med PKM2 C-domæne ved Lys-433 og inhiberer PKM2. Disse resultater viser, at overekspression af MUC1-C i cancerceller bidrager til reguleringen af ​​aerob glykolyse.

Resultater

MUC1-C-induceret transformation er forbundet med induktion af aerob glykolyse

MUC1-C underenhed består af en 58 aminosyre (aa) ekstracellulært domæne, et 28 aa transmembran domæne og et 72 aa cytoplasmisk domæne (fig. 1A). Ekspression af MUC1-C cytoplasmatisk domæne (MUC1-CD) i 3Y1 fibroblaster er associeret med induktion af kolonidannelse i blød agar og tumordannelse i nøgne mus [13], [14]. I de foreliggende undersøgelser fandt vi, at MUC1-CD-induceret transformation af 3Y1 celler er associeret med en stigning i glucoseoptagelse (fig. 1B) og laktat produktion (fig. 1C), konsistent med stimulering af glykolyse. For at vurdere, i det mindste delvist, i henhold til denne reaktion, undersøgelser blev udført for at bestemme virkningerne på PKM2. Især var der en signifikant stigning i PKM2 aktivitet i MUC1-CD transformerede 3Y1 fibroblaster (Fig. 1D). 3Y1 /vektor celler udtrykker PKM2, men ikke PKM1, og MUC1-CD-induceret transformation havde ingen tilsyneladende virkning på PKM2 niveauer (Fig. 1E). Andre undersøgelser har vist, at PKM2 aktivitet inhiberes ved phosphorylering på Tyr-105 i visse celler cancer [9]. MUC1-CD-induceret transformation var ikke forbundet med en ændring i Tyr-105-phosphorylering (fig. 1F). Desuden var der ingen synlig cellulær omfordeling af PKM2 som bestemt ved konfokal mikroskopi (fig. S1). Tidligere undersøgelser har vist, at Akt aktivering som bestemt ved phosphorylering ved Ser-473 forøges i 3Y1 /MUC1-CD-celler i sammenligning med den, der findes i 3Y1 /vektor-celler [18]. For at vurdere om stigningen i p-Akt er ansvarlig for aktiveringen af ​​PKM2, vi tavshed Akt i 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD-celler (fig. 1G) og målt glucoseoptagelse, lactat produktion og PKM2 aktivitet. Resultaterne viser, at silencing Akt reducerer glucoseoptagelse i både 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD-celler (fig. 1H, venstre). Desuden silencing Akt i 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD-celler var associeret med partielle fald i lactat produktion (fig. 1H, højre). Derimod silencing Akt havde ringe eller slet ingen virkning på PKM2 aktivitet i 3Y1 /MUC1-CD-celler (fig. 1 i), hvilket indikerer, at MUC1-CD-medieret induktion af PKM2 er ikke afhængig af Akt aktivering.

EN. Struktur af MUC1-C underenhed med det ekstracellulære domæne (ED), transmembrandomæne (TM) og aminosyresekvensen af ​​det cytoplasmatiske domæne (MUC1-CD). Den CQC motiv og EGFR phosphoryleringssite er fremhævet. B og C. 3Y1 /vektor- og 3Y1 /MUC1-CD-celler blev analyseret for glukoseoptagelse (B) og lactat produktion (C). Resultaterne (gennemsnit ± SD af fem separate forsøg hver udført tredobbelt) er udtrykt som nmol /10

6 celler. D. Lysater fra rotte 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD-celler blev analyseret for PKM2 aktivitet. Resultaterne (gennemsnit ± SD af tre separate forsøg hver udført tredobbelt) udtrykkes som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået i 3Y1 /vektor-celler (tildelt en værdi på 1). Den t-test blev anvendt til bestemmelse af p-værdier. E og F. lysater fra 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD-celler blev immunoblottedes med de angivne antistoffer. G-I. 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD celler blev transficeret med kontrol siRNA eller Akt siRNA puljer for 72 timer. Lysater fra de angivne celler blev immunoblottet med anti-Akt og anti-β-actin (G). De angivne celler blev analyseret for glukoseoptagelse (H, venstre) og lactat produktion (H, højre). Resultaterne (gennemsnit ± SD af tre replikater) er udtrykt som nmol /10

6 celler. Lysater fra de angivne celler blev også analyseret for PKM2 aktivitet (I). Resultaterne (gennemsnit ± SD af tre replikater) er udtrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået i 3Y1 /vektor-celler (tildelt en værdi på 1).

MUC1-C cytoplasmatisk domæne Cys-3 rest interagerer med PKM2

For at bestemme om MUC1-CD interagerer med PKM2 og dermed påvirker dets aktivitet, blev co-immunpræcipitationseksperimenter studier udført med 3Y1 /MUC1-CD cellelysater. Analyse af anti-PKM2 udfælder ved immunoblotting med anti-MUC1-C støttet foreningen af ​​disse proteiner (fig. 2A). I GST pull-down eksperimenter, inkubation af 3Y1 /vektor cellelysater med GST og GST-MUC1-CD gav yderligere støtte til en vekselvirkning mellem PKM2 og MUC1-CD (fig. 2B). For at udvide disse indlæg for celler, der udtrykker endogene MUC1 blev co-immunpræcipitationseksperimenter studier udført på lysater fra humane ZR-75-1 brystkræftceller. Her PKM2 var påviselig i komplekser med 25-20 kDa MUC1-C underenhed (fig. 2C). Pull-down eksperimenter med ZR-75-1 cellelysater viste også binding af MUC1-CD til PKM2 (fig. 2D). Undersøgelser med MUC1-CD deletionsmutanterne viste desuden, at foreningen med PKM2 er tillagt ved MUC1-CD (1-45) og ikke MUC1-CD (46-72) (fig. 2D). Inkubation af GST-MUC1-CD med renset rekombinant His-mærket PKM2 bekræftet direkte binding af MUC1-CD og PKM2 (fig. 2E). Resultaterne viste også, at MUC1-CD (1-45) og ikke MUC1-CD (46-72) er ansvarlig for den direkte interaktion (fig. 2E). MUC1-CD indeholder en CQC motiv (aa 1-3), som bidrager til dannelsen af ​​MUC1-C homodimerer (fig. 1A) [20]. Mutation af CQC motiv til AQA (C1A /C3A) blokeret binding af MUC1-CD til PKM2 (fig. 2F). Binding af MUC1-CD til PKM2 blev også ophævet med C3A, og ikke den C1A, mutant, hvilket indikerer, at Cys-3 er ansvarlig for interaktionen (Fig. 2F). Disse resultater viser, at MUC1-C associerer med PKM2 i celler gennem en direkte interaktion medieret af MUC1-C cytoplasmatisk domæne Cys-3 rest.

A. Lysater fra 3Y1 /MUC1-CD-celler blev underkastet immunpræcipitation med en kontrol-IgG eller anti-PKM2. Bundfaldene blev immunoblottedes med de angivne antistoffer. B. Lysater fra 3Y1 /vektor-celler blev inkuberet med GST eller GST-MUC1-CD. Adsorbaterne til glutathion perler blev immunoblottet med anti-PKM2. Input af GST-proteiner blev bedømt ved Coomassie blue-farvning. C. Lysater fra humane ZR-75-1 brystcancerceller blev immunpræcipiteret med et kontrol-IgG eller anti-PKM2. Bundfald blev immunoblottedes med de angivne antistoffer. D. ZR-75-1 cellelysater blev inkuberet med GST, GST-MUC1-CD og de angivne GST-MUC1-CD deletionsmutanter. Adsorbaterne blev immunoblottet med anti-PKM2. Input af GST-proteiner blev bedømt ved Coomassie blue-farvning. E. PKM2 blev inkuberet med GST, GST-MUC1-CD og de angivne GST-MUC1-CD-deletionsmutanter. Adsorbaterne blev immunoblottet med anti-PKM2. F. PKM2 blev inkuberet med GST, GST-MUC1-CD og de angivne GST-MUC1-CD-mutanter, hvori Cys-1 og /eller Cys-3 blev erstattet med ALA. De adsorbater blev immunoblottet med anti-PKM2.

MUC1-CD binder direkte til PKM2 B-domænet Cys-165 og C-domænet Cys-474

PKM2 består af en N-terminus (aa 1-43), A1-domæne (aa 44-116), B-domæne (aa 117-218), A2-domænet (aa 219-389) og C-domæne (aa 390-531) [7] (fig. 3A). Binding af MUC1-CD kunne påvises med PKM2 (1-218) og PKM2 (390-531), men ikke med PKM2 (219-389) (fig. 3B). Yderligere analyse med PKM2 (1-218) deletionsmutanter viste, at MUC1-CD binder direkte til B-domæne (aa 117-218), og ikke den N-terminale ende (aa 1-43) eller A1-domæne (aa 44-116 ) (fig. 3C). Den PKM2 B-domænet indeholder to cysteiner i positionerne 152 og 165. Mutation af PKM2 (117-218) Cys-152 til Ala (C152A) havde ingen virkning på interaktionen med MUC1-CD (fig. 3D, venstre). Derimod binding af MUC1-CD og PKM2 (117-218) blev ophævet ved mutation Cys-165 til Ala (C165A) (fig. 3D, højre). Med hensyn til PKM2 C-domæne (aa 390-531), Cys-rester er lokaliseret i positionerne 423, 424 og 474. Binding af MUC1-CD til PKM2 (390-531) blev ikke påvirket ved at mutere Cys-423 til Ala ( C423A) (fig. 3E, venstre) eller Cys-424 til Ala (C424A) (fig. 3E, midten). Imidlertid blev interaktionen med MUC1-CD svækket ved mutation af PKM2 (390-531) Cys-474-rest til Ala (C474A) (fig. 3E, højre). Disse resultater indikerer, at MUC1-CD Cys-3-rest binder direkte til (i) PKM2 B-domænet Cys-165, og (ii) PKM2 C-domænet Cys-474.

A. Skematisk afbildning af PKM2 proteinet med N-terminalen (N) og A1-, B-, A2- og C-domæner. Fremhæve, er Cys-165 og Cys-474-rester. B og C. MUC1-CD blev inkuberet med GST og de angivne GST-PKM2 deletionsmutanter. Adsorbaterne blev immunoblottet med anti-MUC1-C. Input af GST-proteiner blev bedømt ved Coomassie blue-farvning. D. MUC1-CD blev inkuberet med GST, GST-PKM2 (117-218) og GST-PKM2 (117-218) med de anførte C152A og C165A mutationer. Adsorbaterne blev immunoblottet med anti-MUC1-C. E. MUC1-CD blev inkuberet med GST, GST-PKM2 (390-531) og GST-PKM2 (390-531) med den angivne C423A, C424A og C474A mutationer. De adsorbater blev immunoblottedes med anti-MUC1-C.

Phosphoryleret MUC1-CD binder til PKM2 C-domænet Lys-433

MUC1-C cytoplasmatisk domæne phosphoryleres på Tyr -46 af EGFR (fig. 1A) [21]. Andre undersøgelser har vist, at visse phosphotyrosin peptider interagerer med PKM2 C-domænet og inhiberer dets aktivitet [8]. For at bestemme om tyrosinphosphoryleret MUC1-C cytoplasmatisk domæne bindes til PKM2, vi først inkuberes MUC1-CD og MUC1-CD (Y46F) med EGFR og ATP. Analyse af reaktionsprodukterne ved immunoblotting med anti-P-Tyr bekræftet phosphorylering på Tyr-46 (fig. 4A, venstre). Som fundet med MUC1-CD, inkubation af p-MUC1-CD med PKM2 deletionsmutanter påvist binding til PKM2 (1-218) og PKM2 (390-531) (fig. 4A, højre). Binding af p-MUC1-CD var også detekterbar med PKM2 (390-531 /C474A) (fig. 4B), støtte en interaktion, der ikke medieres af PKM2 Cys-474-rest. For at udvide disse bemærkninger MUC1-CD (C3A) mutant, der er blottet for binding til PKM2, blev udsat for EGFR fosforylering. Sammenligning af MUC1-CD (C3A) og p-MUC1-CD (C3A) bekræftede, at EGFR-phosphorylering inducerer binding til PKM2 (390-531) (fig. 4C). Disse resultater blev også bekræftet i forsøg, hvor binding af fuld-længde PKM2 var påviselig med p-MUC1-CD (C3A) og ikke MUC1-CD (C3A) (Fig. 4D). Den PKM2 C-domænet indeholder en Lys-433-rest, som er afgørende for phosphotyrosin peptidbinding [8]. Faktisk mutation af PKM2 (390-531) Lys-433 til glutamat (K433E) delvis nedsat binding af p-MUC1-CD (fig. 4E). Inkubation af ZR-75-1 cellelysater med GST-PKM2 (390-531) og GST-PKM2 (390-531 /K433E) yderligere demonstreret, at binding til endogen MUC1-C er delvist faldet med den K433E mutationen (fig. 4F) . Disse resultater viser, at phosphorylering af MUC1-C cytoplasmatisk domæne Tyr-46-rest giver binding til PKM2 C-domæne ved Lys-433.

A. His-mærket MUC1-CD og MUC1-CD (Y46F) blev inkuberet med EGFR i fravær og nærvær af ATP. Reaktionsprodukterne blev analyseret ved immunoblotting med anti-p-Tyr og anti-MUC1-C (venstre). GST og de angivne GST-PKM2 deletionsmutanter blev inkuberet med EGFR-phosphoryleret MUC1-CD (p-MUC1-CD) (højre). Adsorbaterne blev immunoblottet med anti-MUC1-C. Input af GST-proteiner blev bedømt ved Coomassie blue-farvning. B. GST og GST-PKM2 (390-531 /C474A) blev inkuberet med MUC1-CD eller p-MUC1-CD. Adsorbaterne blev immunoblottet med anti-MUC1-C. C. GST og GST-PKM2 (390-531) blev inkuberet med MUC1-CD (C3A) eller EGFR-phosphoryleret p-MUC1-CD (C3A). Adsorbaterne blev immunoblottet med anti-MUC1-C. D. PKM2 blev inkuberet med GST, GST-MUC1-CD (C3A) og EGFR-phosphoryleret GST-p-MUC1-CD (C3A). Adsorbaterne blev immunoblottet med anti-MUC1-C og anti-p-Tyr. E og F. GST, GST-PKM2 (390-531) og GST-PKM2 (390-531 /K433E) blev inkuberet med p-MUC1-CD (E) eller ZR-75-1-cellelysat (F). Adsorbaterne blev immunoblottet med anti-MUC1-C.

Stimulering af PKM2 aktivitet ved MUC1-CD Cys-3

PKM2 er allosterisk aktiveres ved binding af FBP til C-domænet [7]. Af potentiel funktionel betydning for interaktionen mellem MUC1-CD og PKM2, inkubation af MUC1-CD med PKM2 var forbundet med et beskedent stimulering af PKM2 aktivitet (fig. 5A, venstre). MUC1-CD-induceret stimulering af PKM2 afhang af MUC1-CD Cys-3 motiv i denne MUC1-CD (C3A) havde ingen tilsyneladende virkning på PKM2 aktivitet (fig. 5A, højre). Som tidligere [7] vist, FBP effektivt til at stimulere PKM2 aktivitet (fig. 5B). Endvidere tilsætningen af ​​både FBP og MUC1-CD resulterede i mindst en additiv forøgelse (fig. 5B), hvilket viser, at MUC1-CD kan fremme FBP-induceret PKM2 aktivering. At forlænge disse observationer, inkuberede vi PKM2 med GO-203, et peptid, der indeholder poly-Arg ([R]

9), og MUC-1-CD sekvens CQCRRKN ​​indeholdende Cys-3-rest, der blev vist ovenfor til at binde PKM2 ( fig. 5C). GO-203 var meget effektive til at stimulere PKM2 aktivitet, hvorimod en kontrol peptid, betegnet CP-2, hvori Cys-3 remanens blev erstattet med Ala (AQARRKN) havde ringe virkning (fig. 5C). Endvidere mutation af PKM2 Cys-474, men ikke Cys-165, til Ala resulterede i ophævelse af GO-203-inducerede stigninger i PKM2 aktivitet (fig. 5D). Inkubation af PKM2 med både FBP og GO-203 yderligere demonstreret, at GO-203 er additiv med FBP til induktion PKM2 aktivitet (fig. 5E). Disse resultater viser, at samspillet mellem MUC1-CD Cys-3 rester og PKM2 Cys-474 stimulerer PKM2 aktivitet.

A. Rekombinant PKM2 blev inkuberet i fravær og nærvær af de angivne koncentrationer af MUC1-CD (venstre) eller MUC1-CD (C3A) (højre) i 30 minutter ved stuetemperatur. Resultaterne (gennemsnit + SD af fem separate forsøg) er udtrykt som den relative PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået med kontrollen. B. PKM2 blev inkuberet med de angivne koncentrationer af FBP alene, MUC1-CD alene eller FBP og MUC1-CD. Resultaterne (gennemsnit + SD af tre separate forsøg) er udtrykt som den relative PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået med kontrollen. C. Aminosyresekvenser af GO-203 og CP-2-peptider. PKM2 blev inkuberet med 100 pM GO-203 eller CP-2. Resultaterne (gennemsnit + SD af fem separate forsøg) er udtrykt som den relative PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået med kontrollen. D. PKM2 og de angivne PKM2 mutanter blev inkuberet i fravær (åbne søjler) og tilstedeværelse af 100 uM GO-203 (udfyldte søjler). Resultaterne (gennemsnit + SD af tre separate forsøg) er udtrykt som den relative PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået i fravær af GO-203. E. PKM2 blev inkuberet med de angivne koncentrationer af FBP alene, GO-203 alene, eller FBP og GO-203. Resultaterne (gennemsnit + SD af tre separate forsøg) er udtrykt som den relative PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået med kontrollen.

tyrosin-phosphoryleret MUC1-CD inhiberer PKM2 aktivitet

binding af tyrosin-phosphorylerede peptider til PKM2 C-domæne er forbundet med inhibering af PKM2 [8]. Derfor vi sammenlignede virkningerne af MUC1-CD og EGFR-phosphoryleret p-MUC1-CD på PKM2 aktivitet. Som vist ovenfor, blev FBP-induceret stimulering af PKM2 steg med MUC1-CD (fig. 6A). Til sammenligning phosphoryleret p-MUC1-CD var ineffektiv i stigende PKM2 aktivitet (fig. 6A). Disse studier med p-MUC1-CD er imidlertid kompliceret af potentiale for både stimulerende virkninger af Cys-3 og inhibitoriske virkninger af p-Tyr-46. Derfor blev forsøg udført med MUC1-CD (C3A) mutant, som er ineffektiv til stimulering PKM2. Her MUC1-CD (C3A) havde ingen tydelig stimulerende virkning og EGFR-phosphoryleret MUC1-CD (C3A) undertrykt PKM2 aktivitet (fig. 6A). Som en kontrol, MUC-1-CD (Y46F) mutant, der var blevet inkuberet med EGFR og ATP havde ringe eller slet ingen virkning (fig. 6A). For at bekræfte disse observationer, syntetiserede vi peptider svarende til kontrollen og EGFR-phosphoryleret MUC1-CD Tyr-46 (YEKV) motiv (fig. 6B). Phospho-Tyr-46-peptidet, men ikke den phosphorylerede form inhiberet PKM2 aktivitet (fig. 6C). Eksperimenter blev også udført med GO-203 alene og i kombination med phospho-Tyr-46 peptidet. Under disse forsøgsbetingelser, GO-203-induceret stimulering af PKM2 aktivitet var upåvirket af phospho-Tyr-46-peptid (fig. 6D). Disse resultater viser, at EGFR-medieret phosphorylering af MUC1-CD på YEKV motiv inhiberer PKM2 aktivitet, og at GO-203-induceret stimulering af PKM2 ikke blokeres af denne mekanisme.

A. PKM2 blev inkuberet med 10 pM FBP i fravær (kontrol) og tilstedeværelse af 10 uM uphosphoryleret og EGFR-phosphoryleret MUC1-CD, MUC1-CD (C3A) og MUC1-CD (Y46F). Resultaterne (gennemsnit + SD af tre separate forsøg) er udtrykt som den relative PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået med kontrollen. B. Sekvenser af de Tyr-46 og phospho-Tyr-46 peptider. C. PKM2 blev inkuberet med 10 pM FBP i fravær (kontrol) og nærvær af 100 uM phospho-Tyr-46 peptid eller Tyr-46 peptidet. Resultaterne (gennemsnit + SD af tre separate forsøg) er udtrykt som den relative PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået med kontrollen. D. PKM2 blev inkuberet i fravær (kontrol) og nærvær af 20 uM GO-203 alene, 100 uM phospho-Tyr-46-peptid alene eller GO-203 med phospho-Tyr-46 peptidet. Resultaterne (gennemsnit + SD af tre separate forsøg) er udtrykt som den relative PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået med kontrollen.

MUC1-C fremmer aerob glykolyse i brystcancerceller

for at bestemme om endogen MUC1-C påvirker glykolyse, vi studerede ZR-75-1 og MCF-7 brystkræftceller med stabil lyddæmpning af MUC1-C-ekspression (fig. 7A). Nedregulering af MUC1-C havde ingen virkning på PKM2 niveauer eller phosphorylering på Tyr-105 (fig. 7A). Betydeligt, analyse af både ZR-75-1 og MCF-7-celler viste, at silencing MUC1-C er forbundet med nedsat glukoseoptagelse (Fig. 7B) og nedsat lactat produktion (fig. 7C), hvilket indikerer, at MUC1-C fremmer glycolyse i brystcancerceller. Foruden undertrykkelsen af ​​glycolyse, silencing MUC1-C tillagt fald i ZR-75-1 og MCF-7 kolonidannelse (Fig. 7D).

A. Lysater fra ZR-75-1 og MCF-7-celler der stabilt udtrykker en tom vektor eller en MUC1siRNA blev immunoblottedes med de angivne antistoffer. B. De angivne celler blev analyseret for glukoseoptagelse. Resultaterne (gennemsnit ± SD af tre separate forsøg hver udført tredobbelt) er udtrykt som nmol /10

6 celler. C. De angivne celler blev analyseret for produktion af lactat. Resultaterne (gennemsnit ± SD af tre separate forsøg hver udført tredobbelt) udtrykkes som relativ lactatproduktion sammenlignet med den i celler, der udtrykker den tomme vektor (tildelt en værdi på 1). D. De angivne celler blev udpladet i blød agar og kolonier blev talt efter inkubation i 14 dage. Resultaterne (gennemsnit ± SD af to separate forsøg hver udført tredobbelt) er udtrykt som antallet af kolonier i forhold til det, der opnås med ZR-75-1 eller MCF-7-celler, der udtrykker en tom vektor (hver tildelt en værdi på 1).

virkninger af MUC1-C på PKM2 aktivitet i bryst kræftceller

Undersøgelser blev udført for at bestemme, hvorvidt effekten af ​​MUC1-C på aerob glykolyse i brystkræftceller er forbundet med ændringer i PKM2 aktivitet. Ved 24 timer efter passage af ZR-75-1 celler blev PKM2 aktivitet aftog med nedregulering af MUC1-C-ekspression (fig. 8A, til venstre). Derimod ved 72 timers dyrkning blev silencing MUC1-C forbundet med en stigning i PKM2 aktivitet (fig. 8A, til venstre). Disse observationer svarede til en stigning i omfanget af MUC1-C tyrosinphosphorylering fra 24 til 72 timer af kultur (fig. 8A, højre). Lignende resultater blev opnået med MCF-7 celler (fig. 8B, venstre og højre), hvilket indikerer, at MUC1-C-tyrosinphosphorylering status bidrager til reguleringen af ​​PKM2. I denne argumentation, blev undersøgelser udført for at vurdere virkningerne af EGF stimulering. Behandling af MCF-7 /vektor-celler med EGF blev associeret med en stigning i phosphorylering af MUC1-C på tyrosin (Fig. 8C, venstre). Desuden EGF stimulering af MCF-7 /vektor, men ikke MCF-7 /MUC1siRNA, celler resulterede i nedregulering af PKM2 aktivitet (fig. 8C, højre). Disse resultater viser, at tyrosinphosphoryleret MUC1-C undertrykker PKM2 aktivitet i brystkræftceller, og at denne effekt er mere udtalt i respons på EGF-stimulering.

A og B. Lysater fra den angivne ZR-75-1 ( A) og MCF-7 (B) celler høstet på de angivne tidspunkter efter passage blev analyseret for PKM2 aktivitet (venstre). Resultaterne (gennemsnit + SD af tre separate forsøg hver udført tredobbelt) udtrykkes som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået i celler, der udtrykker den tomme vektor (tildelt en værdi på 1). ZR-75-1 /vektor (A) og MCF-7 /vektor (B) cellelysater blev også inkuberet med anti-MUC1-C, og præcipitaterne blev immunoblottedes med de angivne antistoffer (højre). C. MCF-7 /vektor og MCF-7 /MUC1siRNA celler blev efterladt ubehandlet og stimuleret med EGF i 5 min. Lysater fra MCF-7 /vektor-celler blev inkuberet med anti-MUC1-C, og præcipitaterne blev immunoblottedes med de angivne antistoffer (til venstre). Lysater blev undersøgt for PKM2 aktivitet (højre). Resultaterne (gennemsnit + SD af tre separate forsøg) er udtrykt som den relative PKM2 aktivitet sammenlignet med den i ustimulerede MCF-7 /vektor-celler.

Virkninger af ekspression af et MUC1 (C3A) mutant på PKM2 aktivitet

for at bestemme, om virkningerne af lyddæmpende MUC1-C kunne tilskrives interaktionen mellem MUC1-C cytoplasmatisk domæne og PKM2, blev udført studier med HCT116 celler, som er null for MUC1 udtryk og var stabilt transficeret til at udtrykke en tom vektor, vildtype MUC1 eller MUC1 med C3A mutationen (fig. 9A). MUC1 og MUC-1 (C3A) udtryk havde ingen effekt på PKM2 eller p-PKM2 (Tyr-105) niveauer (fig. 9A). Glucoseoptagelse blev forøget i HCT116 /MUC1, men ikke HCT116 /MUC1 (C3A), celler (fig. 9B). Lignende resultater blev opnået ved måling lactat-produktion (fig. 9C). MUC1, men ikke MUC1 (C3A), ekspression blev også forbundet med stigninger i PKM2 aktivitet (fig. 9d). Som vist tidligere [20], MUC1 ekspression blev forbundet med stigninger i HCT116 kolonidannelse og denne virkning blev ophævet af MUC1 (C3A) mutant (fig. 9E). Disse resultater viser, at blokering af interaktionen mellem MUC1-CD og PKM2 dæmper MUC1-CD-medierede virkninger på glykolyse, PKM2 aktivitet og kolonidannelse.

A. Lysater fra HCT116 celler, der stabilt udtrykker en tom vektor, blev vildtype MUC1 eller MUC1 (C3A) immunoblottedes med de angivne antistoffer. B. De angivne celler blev analyseret for glukoseoptagelse. Resultaterne (gennemsnit ± SD af tre separate forsøg hver udført tredobbelt) er udtrykt som nmol /106 celler. C. De angivne celler blev analyseret for produktion af lactat. Resultaterne (gennemsnit ± SD af tre separate forsøg hver udført tredobbelt) udtrykkes som relativ lactatproduktion sammenlignet med den i celler, der udtrykker den tomme vektor (tildelt en værdi på 1). D. Lysater fra de angivne celler blev analyseret for PKM2 aktivitet. Resultaterne (gennemsnit ± SD af tre separate forsøg hver udført tredobbelt) udtrykkes som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med den opnået i celler, der udtrykker den tomme vektor (tildelt en værdi på 1). E. De angivne celler blev udpladet i blød agar og kolonier blev talt efter inkubation i 14 dage. Resultaterne (gennemsnit ± SD af to separate forsøg hver udført tredobbelt) er udtrykt som antallet af kolonier i forhold til den, der opnås med HCT116 /vektor-celler (tildelt en værdi på 1).

Diskussion

MUC1-C oncoproteinet fremmer glykolyse

de fleste cancerceller er afhængige af aerob glykolyse til generering af energi, der er nødvendig for cellulære processer. Denne ændrede metabolisme, kendt som Warburg virkning, indebærer forøget optagelse af glucose med nedsat udnyttelse af TCA-cyklus, således at pyruvat genereres under glykolyse omdannes til lactat [22].