PLoS ONE: LINE-1 hypometylering Under Primær Colon Cancer Progression

Abstrakt

Baggrund

methylering niveauer af genomiske gentagelser såsom lange indflettede nukleotid elementer (LINE-1) er repræsentative for den globale methylering status og spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af ​​genomisk stabilitet. Formålet med undersøgelsen var at vurdere LINE-1 methylering status i kolorektal cancer (CRC) i relation til adenomatøs og ondartet progression, væv heterogenitet, og TNM-stadie.

Metode /vigtigste resultater

DNA blev indsamlet ved hjælp af laser-capture mikrodissektion (LCM) fra normale, adenom, og kræftvæv fra 25 patienter med TisN0M0 og fra 92 primære CRC patienter af forskellige TNM-etaper. Paraffinen vævssnit blev behandlet ved

in situ

DNA natriumbisulfit modifikation (SBM). LINE-1 hypometylering indeks (LHI) blev målt ved absolut kvantitativ analyse af methylerede alleler (AQAMA) realtime PCR; en større indeks angivet forbedret hypometylering. LHI i normal, cancer mesenchymal, adenom, og CRC væv var 0,38 (SD 0,07), 0,37 (SD 0,09), 0,49 (SD 0,10) og 0,53 (SD 0,08) henholdsvis. LHI var signifikant større i adenom væv i forhold til sin sammenhængende normale epitel (

P

= 0,0003) og cancer mesenkymvæv (

P

0,0001). LHI ikke signifikant forskellig mellem adenom og tidlig kræft væv af Tis etape (

P

= 0,20). LHI forhøjet med højere T-stadie (

P

0,04), var signifikant større i lymfeknude-positiv end node-negative CRC patienter (

P

= 0,03), og var signifikant større i stadie IV end alle andre faser sygdom (

P

0,05).

Konklusion /betydning

Ved at bruge

in-situ

SBM og LCM celle udvælgelse vi viste tidligt indsættende LINE-1 demethylering under adenomatøs ændring af kolorektal epitelceller og viste, at LINE-1 demethylering progression er lineær i forhold til TNM-stadie progression

Henvisning:. Sunami E, de Maat M, vu A, Turner RR, Hoon DSB (2011) LINE-1 hypometylering Under Primær Colon Cancer Progression. PLoS ONE 6 (4): e18884. doi: 10,1371 /journal.pone.0018884

Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 12. oktober 2010; Accepteret: 24 Marts 2011; Udgivet: 14 April, 2011

Copyright: © 2011 Sunami et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelserne blev støttet af Weil Family Foundation (Los Angeles, Californien) og Leslie og Susan Gonda (Goldschmied) Foundation (Los Angeles, CA). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ca. 17-18% af det humane genom består af lange afbrudt nukleotid element (LINE-1) gentages. Groft 500.000 trunkeret og 3.000 til 5.000 fuld længde LINE-1-sekvenser er til stede i hele genomet [1]. I normale somatiske celler, er LINE-1s stærkt methylerede, begrænser aktiviteter retrotransposal elementer og dermed forhindre genomisk ustabilitet [2], [3]. LINE-1 sekvenser er moderat CpG rige, og mest methylerede CpG’er er placeret i 5′-området og kan opføre sig som interne promotorer [2]. LINE-1 methyleringsstatus menes at repræsentere hele genomet status DNA-methylering, idet LINE-1-sekvenser er stærkt gentaget, bredt indflettede humane retrotransposoner. Forskellige undersøgelser har vist en relation vigtige genomiske begivenheder i kolorektal carcinogenese til LINE-1 methylering. For eksempel 18q tab af heterozygositet (LOH) (+) colorectal cancer (CRC) viser en LINE-1 methylering niveau lavere middelværdi [4]. En omvendt forhold er blevet rapporteret mellem LINE-1 methylering og mikrosatellit instabilitet (MSI) + /CpG ø methylator fænotype (CIMP) + /BRAF V600E mutation CRC [5], [6]. Der er for nylig blevet rapporteret en signifikant omvendt korrelation mellem niveauer af LINE-1 methylering og det samlede antal af kromosomafvigelser, herunder både tab og gevinster i gastrointestinale stromale tumorer (GIST) [7]. Med hensyn til CRC, Bariol et al. afslørede, at den globale DNA hypometylering niveau var større i neoplastiske læsioner (herunder hyperplastiske polypper og adenom) end i normal slimhinde [8].

En vigtig problem i vurderingen af ​​LINE-1 methylering status i CRC er, at CRC er stærkt heterogen og indeholder forskellige infiltrerende celler, såsom stromaceller, lymfocytter og blodkar. Den stromale komponent og omfanget af lymfocytinfiltrering varierer meget blandt CRCs. Denne heterogenitet kan forvirre molekylær analyse, især LINE-1 methylering status, som LINE-1 methyleres i normale celler. For at opnå nøjagtige fortolkninger, er det derfor nødvendigt at specifikt at isolere tumorceller fra vævsprøver. Tidligt stadium CRC primær tumor analyse uden histopatologi-rettet mikrodissektion til vurdering af genomisk methylering status er ikke korrekt. Dette er især en problematisk ved vurderingen CRC progression og når man sammenligner adenom til kræft væv. Robuste og præcise teknikker til sådanne analyser ikke eksisterer; Derfor udviklede vi en praktisk tilgang. Vi udnyttede laser-capture mikrodissektion (LCM) at høste cellerne af interesse direkte uden forurening af ikke-kræftceller. Natriumbisulfit modifikation (SBM) af genomisk DNA er en almindeligt anvendt metode til at skelne methylering status CpG-øer [9]. Konventionelle SBM metoder resulterer i 84% til 96% tab af prøve-DNA [10]. Denne betydelige tab af skabelon-DNA nødvendiggør store mængder af start vævsprøve. For at reducere tabet af prøve-DNA fra celler, indsamlet af LCM, udviklede vi en

in-situ

SBM-protokol. DNA blev ændret, mens de opfangede celler stadig er fastgjort på LCM cap.

Der er rapporteret Talrige undersøgelser identificerer CRC-associerede epigenetiske afvigelser såsom promoter region hypermethylering af tumorsuppressorgener. Et andet karakteristisk ændring i CRC vedrørende DNA methylering status er global hypometylering [11], [12]. Progressionen af ​​LINE-1 hypometylering niveau under udviklingen af ​​CRC malignitet og progression af sygdommen er ikke blevet strengt vurderet. Bestemmelse af histopatologi forbundet med indtræden af ​​tab af LINE-1 methylering og udviklingen i LINE-1 methylering langs aksen af ​​sygdommens stadie progression kunne præcisere den rolle, LINE-1 hypometylering i CRC sygdom. I denne undersøgelse LCM,

in-situ

SBM, og absolut kvantificering af methylerede alleler (AQAMA) blev anvendt i kombination på prøver fra patienter med adenomer indeholder

in situ

invasiv adenokarcinom (Tis) og patienter med mere fremskreden CRC. Dette gav vellykket præcis analyse af LINE-1 hypometylering niveauer under primær tumor progression mellem progressive T-etaper, node positive versus node negativ sygdom, og fjern metastatisk versus lokale og locoregional sygdom.

Resultater

AQAMA linearitet for LINE-1 vurdering

methylering niveau

først, vi evaluerede nøjagtigheden af ​​AQAMA vurdere forskellige LINE-1 methylering. Den største fordel ved AQAMA er, at den kvantitative måling af methylerede og ikke-methylerede alleler udføres i en enkelt PCR-reaktion, hvilket giver fremragende kontrol sammenlignet med to separate PCR-reaktioner for methyleret og umethyleret allel analyse. Kvantificeringen er absolut med standard kurver for at bestemme kopitallet. For en negativ kontrol, assayet reaktion indeholdt universelle umethyleret kontrol-DNA, der blev syntetiseret som beskrevet i en tidligere offentliggjort undersøgelse [13]. For en positiv kontrol anvendte vi universel methyleret kontrol-DNA ekstraheret fra perifere blodlymfocytter fra en rask donor og behandlet med

SSSI methyltransferase.

Til denne undersøgelse har vi udarbejdet trinvise blandinger af den methylerede og ikke-methylerede cDNA standard og målt dem som prøver med ukendt methylering niveau. Linearitet AQAMA assay for LINE-1 methylering niveau (figur 1) blev evalueret ved Pearsons koefficient på linearitet: 0,99 (

P

0,001), som viste stor nøjagtighed i kræsne LINE-1 methylering niveauforskelle.

Plot af målt (feltet) og forventede (x) værdier viser nøjagtigheden af ​​AQAMA LINE-1-analysen.

Optimering af

in-situ

SBM-indstillinger

LCM blev udført for at høste celler af interesse (figur 2a) til opnåelse af nøjagtig repræsentation af celler pågældende for vellykket AQAMA måling. Tre forskellige prøve væv områder på 10

4, 10

5 og 10

6 um

2 høstet fra 4 um-tyk paraffin-indstøbt arkivering væv (tørv) blev testet. Gennem analyser, vi konstateret, at 2 × 10

5 um

2 af 4 um tykke tørv resultater i cirka 10

5 kopi antal LINE-1 DNA. Dette medførte signifikante reproducerbare niveauer af DNA LINE-1 methylering assay. Efter LCM,

in-situ

SBM blev optimeret på en lignende måde som blev udført i de tidligere undersøgelser af on-slide SBM via bestemte genomiske sekvens amplifikation [14]. Omregningskurserne for modificeret DNA ved

in-situ

SBM var 18,4 ± 14,9%, 87,8 ± 7,8% og 94,4 ± 2,1% ved inkubation indstilling på 60 ° C i 2, 4 og 8 timer, (figur 2b). De omregningskurser steg med stigende inkubationstiden, hvorved efter 8 timer nåede omkring 95%. Udbyttet af totalt DNA (modificeret og umodificeret DNA) ikke faldt med stigende inkubationstid på op til 8 timer (figur 2C). Ud fra disse resultater blev en inkubationstid indstilling på 60 ° C i 8 timer valgt som optimal for

in-situ

SBM.

A viser specifik afhentning af target celler ved LCM. B og C viser resultaterne for DNA konverteringsfrekvens (%) og til DNA-indhold (× 10

4 kopi numre), henholdsvis i 8 forskellige prøver på 3 forskellige inkubationsperioder.

linje- 1 hypometylering niveauer under CRC progression

Femogtyve patienter med TisN0M0 læsioner med tilstedeværelsen af ​​normal, adenom (lav eller mellemliggende klasse) og Tis cancerceller på samme vævssnit blev udvalgt. Brug af LCM blev fire forskellige vævsprøver (normal slimhinde, adenom, cancer og cancer mesenkymale væv) indsamles fra hver patient.

In-situ blev udført

SBM og LINE-1 AQAMA assay på hver prøve. Niveauet af LINE-1 hypometylering (LHI) blev beregnet som Q

unmeth /(Q

unmeth + Q

meth), hvor Q

unmeth og Q

meth er de absolutte antal kopier af methyleret og methyleret LINE-1 hhv. I normal slimhinde støder op til tumorlæsioner og kræft mesenkym, den gennemsnitlige LHI var 0,382 og 0,366, henholdsvis. Der var ingen forskel på LHI mellem kræft mesenkym og normal slimhinde støder op til tumor. LHI var signifikant større i den tilstødende adenom og kræftvæv af tidligt stadium end i normal slimhinde (gennemsnitlig LHI = 0,49, 0,52, og 0,38, henholdsvis) (Figur 3). Ud fra disse resultater konkluderede vi, at LINE-1 hypometylering forekommer i den tidlige fase af CRC tumorigenese. Desuden er disse forsøg viste nødvendigheden af ​​at anvende detaljerede procedurer for DNA samling ved analyse LINE-1 methylering plan, som f.eks målcelle isolation, ved LCM. På grundlag af dette, blev LCM anvendt til DNA prøve kollektion til alle eksperimenter i vores studier.

LINE-1 hypometylering og væv heterogenitet

I analysen af ​​LHI af normal, cancer mesenchymal, adenom, og CRC væv, var 0,38 (SD 0,07), 0,37 (SD 0,09), 0,49 (SD 0,10) og 0,53 (SD 0,08) henholdsvis. For at teste, om der er heterogenitet af LINE-1 hypometylering inden for en tumor, blev 20 T3N0 tumorer udvalgt til analyse. Prøve-DNA blev opsamlet fra den luminale overflade og den dybeste invasional site af hver tumor. LHI af disse to loci blev sammenlignet (figur 4). Middelværdien LHI var 0,58 i overfladen og 0,54 i den dybeste loci. LHIs var ens i overfladen og i den dybeste loci og tumor heterogenitet LINE-1 hypometylering blev ikke observeret.

Målte LHI værdier i T3N0 CRC tumorer sammenligne celler opnået fra overfladen luminale tumor område til den dybe invasion tumor område.

LINE-1 hypometylering og CRC etape

for at vurdere ændringen af ​​LINE-1 hypometylering niveauer efter tumor progression, blev sammenhængen mellem Dukes stadier og LHI analyseret. Dukes A (n = 38), Dukes B (n = 18), og Dukes C (n = 29) prøver blev udvalgt (5c). Den gennemsnitlige LHI i Dukes A, B og C var 0,533, 0,607, og 0,621, henholdsvis. Dukes B og C tumorer viste signifikant større LHI end Dukes A tumorer. Relationen mellem LINE-1 methylering og T-fase (T1 (n = 24), T2 (n = 21), T3 (n = 21), og T4 (n = 26)) såvel som N-fase (N0 ( n = 57) og N1 (n = 35)) blev analyseret. Stigningen af ​​LHI ifølge tumorinvasion (figur 5a) og forskellen af ​​LHIs mellem lymfeknude positive og negative tilfælde (figur 5B) blev vurderet. Middelværdien LHI af T1, T2, T3 og T4 var 0,50, 0,58, 0,60, og 0,65 hhv. LHI var signifikant større (

P

= 0,03) i de tilfælde med positive lymfeknuder (LHI = 0,64) end negative lymfeknuder (LHI = 0,54). Forudsigelsen af ​​lymfeknudestatus ville være den mest klinisk relevant og derfor en modtager koerselskurve (ROC) blev analyseret for at skelne mellem om node metastase positivt kan være en prognostisk indikator for den primære CRC ved hjælp af LHI (figur 6). T-stadie avancement korrelerede signifikant med stigende LHI (

P

= 0,01). Vi analyserede også tilfælde med fjernt sygdomsspredning (Dukes D, n = 6), og disse tilfælde viste signifikant større LHI forhold til Dukes C CRC’er (

P

= 0,05) alene og til alle andre Duke stadier (

P

0,0001). En ROC blev plottet for at vise nøjagtighed for forudsigelse af lymfeknudeinvolvering ved LHI (figur 6). Dette viste, at den prædiktive værdi havde en følsomhed på 0,77 med en specificitet på 0,62. Der var signifikant lavere LHI for højresidig versus venstre-sidet kolon (

P

0,05). Der blev dog ikke observeret nogen signifikante forskelle mellem LHI for differentiering status eller køn.

I A, B og C forskelle vist mellem Duke etape, T-scenen og N-scenen, hhv.

X-aksen betegner 1-specificitet og y-aksen følsomhed. Arealet under kurven (AUC) blev beregnet til 0,69. P = 0,003.

Disse analyser viste en positiv lineær sammenhæng mellem udviklingen af ​​LINE-1 hypometylering og CRC fase progression.

Diskussion

Ændringen af ​​DNA methylering mønstre er blevet undersøgt i mange typer af kræft [15]. Hypermethylering af specifikke cancer-associeret gen promotorområder og global DNA hypometylering under tumorprogression har nu vist som en væsentlig egenskab ved kræft [16], [17]. Hypomethylering af LINE-1-DNA repeat, som danner 20% af genomet er blevet foreslået som et surrogat for global DNA hypometylering [5], [18], [19], [20]. Yang et al. viste, at hele genomet methylering kan estimeres ved vurdering [21]. Alu gentagelser er Sines, mere komplekse, og forskelligartet end linjer. Pålidelige methylering analyser at studere Alu er ikke godt underbygget. En præcis analyse repræsentant for global methylering fænomen eksisterer ikke; dog kan LINE-1 fungerer godt som et surrogat.

LINE-1 hypometylering er ikke specifik for cancerceller, og omkring en tredjedel af LINE-1 er ikke-methyleret i normal slimhinde og cancer mesenchymalceller [22], [23]. Den mulige forurening af prøven DNA, som består af cancer sammen med mesenkymale celler såsom fibroblaster eller lymfocyter, kan derfor forårsage unøjagtige resultater. Af denne grund, især med hensyn til LINE-1 methyleringsanalyse, nøjagtig isolering af målceller er meget vigtigt. For at minimere forureningen og få celler kun interesse, vi med succes integreret LCM i LINE-1 methylering analyser i denne undersøgelse. Vi vurderede

in situ

SBM kombineret med LCM som en tilgang til at forbedre DNA methylering assay effektivitet, som gør det muligt evaluering af celler fra specifikke Histopatologisk defineret målregioner af meget tidligt stadium primære CRC udvikling. En nylig undersøgelse har sandsynliggjort, at resultaterne er sammenlignelige, om macrodissection eller LCM bruges [24]. Dette er imidlertid meget afhængig af assayets følsomhed. Begrebet LCM er imidlertid state-of-the-art og overlegen i forhold til macrodissection når der ønskes små målrettede væv input prøve til DNA-analyse. Først, når den tidlige fase små læsioner skal vurderes, og kun små områder med specifikke cancerceller er til rådighed for analyse, den mikroskopi-guided celle afhentning giver præcision og kontrol af input prøve-DNA. Sekund, LINE-1 methylering er ikke cancer-specifik og, som vores resultater viser, findes i cancer stromale væv. Med den nuværende forståelse af tumormikromiljøet og tumor stromal heterogenitet, er det yderst vigtigt at udføre LCM analyse for specifikke væv DNA hentning. Også, ville forventes LINE-1 methylering at variere i tilstødende “normale” celler af en primær tumor siden lysmikroskopi patologi analyse er ikke altid korrekt at identificere tidlige transformation stadie kræftcelle.

In-situ

SBM designet baseret på on-slide SBM [14], som blev tilpasset fra et koncept som rapporteret af Nuovo et al [25]. On-slide SBM er en kraftfuld metode til methylering analyse under anvendelse tørv; men efter on-slide SBM prøven bliver for klæbemiddel på objektglasset, hvilket gør det vanskeligt for LCM til effektivt at fange målceller til tider.

In-situ

SBM eliminerer de talrige DNA-isolering og purifikationstrin klassiske SBM, som er hovedårsagen til DNA tab ved vurderingen lave mængder af DNA fra begrænset antal celler. Vores undersøgelse beskriver

in situ

behandling af væv /celler direkte ved bisulfit assay integreret med LCM. En begrænsning af assayet er, at analyse af status for methylering af enkeltceller stadig vanskelig på grund af DNA nedbrydende natur af SBM-protokollen og begrænset DNA til methyleringsanalyse.

kombinere LCM,

in situ

SBM, og AQAMA assay blev LINE-1 hypometylering påvist i lav til mid adenom, en tidlig fase af kolorektal tumorigenese som tidligere vist [5], [6]. Et signifikant fald i LINE-1 methylering blev målt sammenligne adenom med det tilstødende normale epitel. Ingen signifikant forskel blev vist, da adenom blev sammenlignet med den tilstødende kræft Tis stadium væv som også blev for nylig rapporteret i af Kwon et al [26]. Dette resultat adskiller sig fra undersøgelser af Ibrahim et al. og ved Irahara et al. der findes betydelige forskelle i LHI mellem kolorektale adenomer og CRC [24], [27]. Det er vigtigt at bemærke, at disse undersøgelser ikke angive TNM-stadie af prøverne. Den ikke-signifikant forskel mellem adenom og cancervæv i vores undersøgelse forklares ved anvendelse af en heterogen gruppe af cancervæv fra den tidligste cancer etape (

in situ

carcinom, Tis). Vores resultater bekræfter, at LINE-1 methylering varierer i forskellige TNM-etaper. Når LHI i adenomer blev sammenlignet med mere avancerede stadie CRC prøver i vores undersøgelse forskellene var signifikante (data ikke vist). Dette viser, at umethylerede LINE-1 ikke kan spille en vigtig rolle i processen, når adenom celler vinde deres første invasive aktivitet.

Den øgede heterogenitet findes i større, avancerede læsioner er en indikation af, at der eksisterer undergrupper af CRC, der er i stand til at opretholde methylering af LINE-1. På den anden side, observerede vi, at to Dukes stadie D tilfælde havde en LHI på 0,9, som kun blev set i denne undergruppe. Heterogenitet er et kendt klinisk problem som resultat sygdom varierer meget for CRC patienter med samme TNM-stadie. Mangfoldigheden af ​​de LHIs inden for de forskellige stadier i vores undersøgelse kan afspejle dette. De mekanismer, der styrer vedligeholdelse af LINE-1 methylering og hvordan de påvirker tumor progression er stadig ukendt.

I en stor undersøgelse af Baba et al [28], en relation til sygdom fase er blevet beskrevet med højere LINE- 1 demethylering i mere fremskreden sygdom, selv om forskellene var meget mindre. Også ifølge undersøgelsens resultater, LINE methylering niveauer var højere i fase II-sygdom i forhold til fase I. Denne undersøgelse analyserede hele vævssnit uden brug mikrodissektion. En af grundene til, at forskellene var små og scene II udviste højere LINE-1 methylering kan være graden af ​​mesenkymale celler DNA-kontaminering i prøven DNA. Vores resultater viste, at ikke blot tilstødende normale slimhinde, men også mesenkymale celler i kræft, viser omkring en tredjedel af LINE-1 hypometylering. Dette understøtter vores fokus at specifikke mål celle isolation er nødvendig. Prognostiske værdi af LINE-1 methylering niveauer i CRC er blevet rapporteret [29]; kan dog variation mellem tumorer være et resultat af forurening det stromale /mesenkymale komponent [30].

Vores undersøgelse viser en klar trinvis positiv lineær sammenhæng for tab af LINE-1 methylering til T-, N-, som samt M-fase. Niveauerne af LINE-1 demethylering kan derfor være nyttigt i flere kliniske situationer. Præoperativ analyse af CRC’er biopsi materiale, der kan forudsige T-stadie (Tis vs. T1 eller T1 vs. T2) kan være til nytte at afgøre, om endoskopisk resektion (dvs. transanal slimhinde excision af rektal kræft) kan forsøges versus åben resektion kirurgi, som er forbundet med meget højere sygelighed /dødelighed. N-fase forudsigelse kunne anvendes til at vælge CRC patienter til at teste effektiviteten af ​​neoadjuvansterapi. Endvidere kan M-fase forudsigelse anvendes som biomarkør til at foretage yderligere metastatisk præoperativ billeddannelse med PET-CT-scanning i tillæg til den standard oparbejdning. For at vurdere om præoperative tumor biopsi materiale fra den luminale side er repræsentativ, vurderede vi tumor heterogenitet. Sammenligningen mellem den dybeste del og overfladen af ​​tumoren viste, at tumor heterogenitet LINE-1 methylering status er forholdsvis subtil. Resultaterne antyder, at CRC biopsiprøver indsamlet under koloskopi er repræsentative og kan anvendes til vurdering af en tumor LINE-1 status for methylering analyse. Den gennemsnitlige LHI afveg betydeligt mellem node positive og node negative CRCs; hvorved ROC-analyse viste diskriminerende resultater. Der var overlap LHI værdier mellem N + og N0 kategorier og følsomheden og specificiteten var forholdsvis lav. Dette blev også set for T- og diskrimination M-fase. Større undersøgelser er nødvendige for at bestemme nytten af ​​LHI som en enkelt biomarkør eller kombination med andre biomarkører.

Som konklusion undersøgelse viste at LINE-1 methylering status korrelerer med patologisk stadium af CRC. Desuden dens præcis analyse med LCM eller tilsvarende teknikker er nødvendig, som understøttende mesenkymale væv omkring tumorceller klart kan påvirke resultaterne. Starten af ​​LINE-1 demethylering forekommer meget tidligt, når normal kolorektal slimhinde udvikler sig til en adenom med lav eller mellemliggende dysplasi. Resultaterne viste en klar og signifikant lineær korrelation af progression af tab af methylering LINE-1 element til progression af CRC sygdom (figur 7) med hensyn til t samt N- og M-fase. Disse resultater tyder på fortsatte tab af genomisk methylering under CRC udvikling, hvilket indikerer, at høje epigenomic og dermed genomiske begivenheder er centrale træk ved tumor progression.

Materialer og Metoder

Måling af LINE- 1 hypometylering

status methylering af LINE-1 blev evalueret ved AQAMA assay for præcis vurdering af CpG ø methylering niveauer [31]. Inden du udfører AQAMA analysen af ​​LINE-1 methylering status blev SBM anvendt på hver DNA-prøve som beskrevet tidligere [32]. AQAMA kræver en fremadrettet og en revers primer, som vil amplificere målsekvensen uafhængig af status for methylering, som dem frem og bak primersæt ikke indeholder nogen CpG. status methylering bedømmes af to mindre-groove-bindende (MGB) molekyle indeholder prober (Applied Biosystems): en methylering specifikke og én unmethylation specifikke. 5′-primeren, 3′-primer, methyleringsspecifik probe og unmethylation-specifik probe er som følger: 5′-GGGTTTATTTTATTAGGGAGTGTTAGA-3 ‘(fremad), 5′-TCACCCCTTTCTTTA ACTCAAA-3′ (revers), FAM-5′ -TGCGCGAGTCGAAGT-3′-MGB-BHQ og VIC-5′-TGTGTG AGTTGAAGTAGGG-3’-MGB-BHQ. Reaktionsblandingen i hvert AQAMA PCR bestod af DNA-template, 0,4 pmol /L i fremadrettet og revers primer, 1,4 enheder af

iTaq

DNA-polymerase (Bio-Rad, Hercules, CA), 350 pmol /l hver deoxynukleotidtriphosphat og 0,025 pmol af hver MGB probe med 5 mmol /l Mg

2+. PCR-amplifikation blev udført med præ-cyklus varmeaktivering af DNA-polymerase ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 15 sek, annealing og forlængelse ved 60 ° C i 60 sek. Det absolutte antal kopier i hver prøve blev bestemt ved hjælp af en standardkurve etableret ved at forstærke seks alikvote dubletter af skabeloner med kendte kopiantal (10

* 6 til 10

* 1 kopier). Vi har tidligere beskrevet fremgangsmåder til syntese af standard prøve med kendt kopital i AQAMA assayet [31]. For en negativ kontrol, assayet reaktion indeholdt universelle umethyleret kontrol-DNA, der blev syntetiseret som beskrevet i en tidligere offentliggjort undersøgelse [13]. For en positiv kontrol anvendte vi universel methyleret kontrol-DNA ekstraheret fra perifere blodlymfocytter fra en rask donor og behandlet med

SSSI methyltransferase

. Kort beskrevet

SSSI methyltransferase

behandlet, bisulfit modificerede, blev donor PBL DNA amplificeret ved PCR med primersæt at skabe standardprøven for fuldt methyleret LINE-1. For konstruktion af standard prøve til umethyleret LINE-1 brugte vi universel umethyleret kontrol-DNA, fremstillet som beskrevet tidligere [13]. Det helt methyleret og umethyleret PCR-produkt blev ligeret ind i en pCR 2.1-TOPO-kloningsvektor (Invitrogen); klonerne blev omdannet til

Escherichia coli

DH5-a-celler; og kulturer blev ekspanderet som tidligere [33] beskrevne. Plasmider indeholdende målgenet blev oprenset og kvantificeret ved UV-spektrofotometri. Dette blev anvendt til fremstilling fortyndingsrække af kendte kopital til konstruktion standardkurver for absolut kvantificering. Alle kvantitative PCR-assays blev udført i et blindet måde uden kendskab til prøven identitet. Middelværdier blev beregnet ud fra tredobbelte reaktioner. LINE-1 hypometylering indeks (LHI) af hver prøve blev beregnet som følger: LINE-1 LHI = umethyleret kopi nummer /(methylerede kopi nummer + umethyleret kopi nummer)

LCM

LCM var. anvendt til DNA prøvetagning for alle eksperimenter i vores undersøgelse. Principper og tekniske grundlag for LCM er beskrevet i detaljer af Fend F et al. [34]. Celler blev opsamlet med LCM, som huser et digitalt kamerasystem, der registrerer de markerede celler. Dette gør det muligt, at den samme mængde firkantede mikrometer af celler kan afhentes for hver prøve.

In-situ

SBM assay optimering

For at måle LINE-1 hypometylering indeks efter mikrodissektion hjælp LCM, vi udviklede

in-situ

SBM procedure baseret på tidligere introduceret på slide SBM teknik.

In-situ

SBM var designet til at analysere status for methylering af gener i lille mængde DNA opnået fra formalinfikseret tørv.

In-situ sigter

SBM at fjerne DNA-isolering og oprensningstrin, der udføres før den egentlige SBM i den klassiske procedure, som er den vigtigste årsag til DNA tab.

In-situ indeholder

SBM tre trin; denaturering af DNA, SBM og indsamling af modificeret DNA. Først blev cellerne mikrodissekeres fra afparaffinerede og rehydrerede vævssnit, der klæber på hætten anvendes i LCM inkuberes i 0,2 mol /l NaOH ved stuetemperatur i 15 minutter. Så prøverne på hætten inkuberes i 3 mol /l natriumbisulfitopløsning med 0,5 mmol /l hydroquinon (pH 5) i mørke. Tre inkubation indstilling blev testet med hensyn til de omregningskurser (satsen for ændring af cytosin til uracil) og udbytter af modificeret DNA og inkubation indstilling på 60 ° C i 8 timer blev valgt som optimal (se Resultater sektion). Efter inkubation blev prøverne på hætten skyllet med destilleret vand, dyppet i 0,3 mol /l NaOH i 15 min til desulfonate de modificerede cytosiner, og derefter afsaltet i destilleret vand ved 60 ° C i 2 timer. Endelig blev 50 pi lysepuffer indeholdende 4 ug proteinase K, 2,5% Tween 20, 50 mmol /L Tris, og 1 mmol /l EDTA tilsat på hætten og inkuberet ved 50 ° C i 24 timer efterfulgt af varme deaktivering af proteinase K ved 95 ° C i 10 min. I hver efterfølgende AQAMA reaktion blev 1-2 uL lysat bruges som skabelon uden DNA oprensning.

Etik Statement

tørv prøver af CRC blev opnået fra patienter, som gennemgik kolektomi eller proctectomy mellem 1995 og 1998 ved Saint Johns Health center /John Wayne Cancer Institute, Santa Monica, CA. Undersøgelsen blev gennemgået og godkendt af Saint Johns Health Center /John Wayne Cancer Institute ‘Institutional Review Board (IRB) og Western IRB. Skriftligt samtykke blev opnået fra patienterne.

TØRV CRC prøver

Alle vævsprøver var blevet fikseret i 10% bufferet formalin i 24 timer, og paraffin-indstøbt. For LCM efterfulgt af

in-situ

SBM og LINE-1 methylering analyse af AQAMA, sektioner (4 pm) blev skåret med en mikrotom fra hver TØRV blok. Celler blev opsamlet med Veritas® automatiserede LCM-system (Life Technologies). En af fordelene ved dette system er, at den muliggør styring af de firkantede mikrometer af celler, der er samlet op for hver prøve. For at vurdere forskellene i LINE-1 status methylering mellem normal slimhinde, adenom, kræft og kræft mesenchymal bindevæv blev 25 prøver af tidlige CRC i adenom (TisN0M0) udvalgt af en patolog (RRT) med speciale i CRC, der indeholdt alle fire af disse væv kategorier. At studere ondartet ændring, blev 94 kirurgisk resektion CRC prøver indkøbt til at undersøge ændringen af ​​LINE-1 methylering status i overensstemmelse med kræft progression. LCM blev udført på begge studiegrupper. Sammenhængen mellem klinisk-patologisk stadie, såsom T etape, nodal status og Dukes stadie og LINE-1 methylering indeks blev analyseret.

Statistisk analyse

Alle data er udtrykt som middelværdi +/- SD, og procenter efter behov.