PLoS ONE: treg Udtømmelse inhiberer Effekten af ​​Cancerimmunterapi: Konsekvenser for Klinisk Trials

Abstrakt

Baggrund

Regulatory T-lymfocytter (Treg) infiltrere menneskelige glioblastom (GBM); er involveret i tumorudvikling og korrelerer med tumorklassificering. Forbigående eliminering af tregs bruger CD25 nedbrydende antistoffer (PC61) har vist sig at mægle GBM regression i prækliniske modeller for hjernetumorer. Kliniske forsøg, der kombinerer treg udtynding med tumor vaccination i gang for at afgøre, om forbigående treg udtømning kan forbedre anti-tumor immunrespons og forbedre overlevelsen langsigtet hos kræftpatienter.

Resultater

Ved hjælp af en syngen intracrabial glioblastoma (GBM) musemodel viser vi, at systemisk udtømning af tregs 15 dage efter tumorimplantation hjælp PC61 resulterede i et fald i tregs stede i tumorer, drænende lymfeknuder og milt og forbedret overlevelse på lang sigt (50% af musene overlevede 150 dage). Der blev ikke observeret nogen forbedring i overlevelse, når tregs blev depleteret 24 dage efter tumorimplantation, hvilket antyder, at tumorbyrde er en vigtig faktor til bestemmelse af effektiviteten Treg udtømning i kliniske forsøg. I en T-celle afhængige model af hjerne tumorregression fremkaldt ved intratumoral levering af adenovirale vektorer (Ad), der udtrykker fms-lignende tyrosinkinase 3 ligand (Flt3L) og Herpes Simplex type 1-thymidinkinase (TK) med ganciclovir (GCV), viser vi at administration af PC61 24 dage efter tumorimplantation (7 dage efter behandlingen) inhiberede T-celle afhængige tumorregression og langtidsoverlevelse. Yderligere, udtømning med PC61 fuldstændig hæmmet klonal ekspansion af tumor antigenspecifikke T-lymfocytter som respons på behandlingen.

Konklusioner

Vores data viser for første gang, at selv Treg udtømning inhiberer progressionen /eliminerer GBM tumorer, dets virkningsfuldhed er afhængig af tumorbyrde. Vi konkluderer, at denne fremgangsmåde vil være nyttig i en indstilling af minimal residual sygdom. Yderligere viser vi også, at Treg udtømning ved anvendelse PC61 i kombination med immunterapi, inhiberer klonal ekspansion af tumor antigenspecifikke T-celler, hvilket antyder, at nye, mere specifikke mål at blokere tregs vil blive nødvendige ved anvendelse i kombination med terapier, der aktiverer anti- tumor immunitet

Henvisning:. Curtin JF, Candolfi M, Fakhouri TM, Liu C, Alden A, Edwards M, et al. (2008) treg Nedbrydning inhiberer Effekten af ​​Cancerimmunterapi: Konsekvenser for kliniske forsøg. PLoS ONE 3 (4): e1983. doi: 10,1371 /journal.pone.0001983

Redaktør: Karen S. Aboody, City of Hope Medical Center og Beckman Research Institute, USA

Modtaget: 9. januar 2008; Accepteret: 10 marts 2008; Udgivet 23. april, 2008

Copyright: © 2008 Curtin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af National Institutes of Health /National Institute of Neurologiske Stroke (NIH /NINDS) Tilskud 1R01 NS44556.01, Minority Supplement NS445561.01; 1R21-NSO54143.01; 1UO1 NS052465.01, en RO3 TW006273-01 til M.G.C .; NIH /NINDS Tilskud 1 RO1 NS 054.193,01; RO1 NS 42893,01, U54 NS045309-01 og 1R21 NS047298-01 til P.R.L. Den Bram og Elaine Goldsmith og medaljoner Group begavet Stole i Gene Therapeutics til PRL og MGC henholdsvis The Linda Tallen David Paul Kane Foundation Annual Fellowship og styrelsesrådet på CSMC. MC er støttet af NIH /NINDS 1F32 NS058156.01

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

glioblastoma multiforme (GBM) er en dødbringende primær hjernetumor, som er meget invasiv med tumorceller infiltrerer det omgivende sundt hjernevæv [1]. Den mediane overlevelse af patienter diagnosticeret med GBM er et år (4-6 måneder efter tilbagefald), med mindre end 5% af de patienter, resterende live 5 år efter diagnosen [2]. Forbedringer i kirurgi, kemoterapi og strålebehandling er ikke blevet oversat til væsentligt forbedret prognosen for patienter med GBM; langsigtet overlevelse (5 år efter diagnosen) er ikke blevet bedre siden 1950 [3]. Tumortilbagefald næsten altid opstår, selvom kirurgi held fjerner størstedelen af ​​den primære tumormasse. Nye behandlinger til at forebygge eller behandle tumor tilbagefald er et presserende behov for at behandle patienter diagnosticeret med GBM.

Immunterapi er blevet foreslået som en kraftfuld metode til at forhindre tumor tilbagefald ved at fjerne tumorceller, mens besparende normale omgivende raske celler [4], [5]. Flere kliniske forsøg er nu i gang for at teste, om immunterapi er sikkert og effektivt til at behandle GBM [6], [7]. GBMS overudtrykker tumorantigener såsom MAGE, Her2 /neu, Tyrosinase, Trp-1, Trp-2, gp100, IL13Rα2, Survivin (gennemgået i [8]) og EphA2 [9]. Immunsystemet normalt sculpts tumorer resulterende tab af tumorantigen-ekspression [10], [11], men placeringen af ​​GBM i hjernen, en lokalitet af immun privilegium [12], [13], eller tilstedeværelsen af ​​et stærkt immunosuppressiv miljø i hjernetumorer [14], [15] kan være grunde til GBM almindeligt løbet udtrykkelige tumorantigener i patienter. Autologe dendritiske celler (DC) lastet med GBM tumor peptider [16] eller autolog tumor lysat [17], er blevet anvendt til at vaccinere patienter i to nylige kliniske fase I forsøg. Ingen signifikant stigning i overlevelse blev observeret ved anvendelse af autologe tumorlysater [17]. Men for at den gennemsnitlige tid progression og median overlevelse af patienter behandlet med peptid baserede vacciner blev øget i forhold til patienter, der blev behandlet i løbet af den samme periode med konventionelle behandlinger [16]. Interessant nok blev en subpopulation af respondere til behandlingen identificeret ved ekspressionen af ​​lave koncentrationer af TGFp i hjernen. Intratumoral ekspression af TGFp kan undertrykke adaptive immunreaktioner mod antigen [4], [5] og var indikerer klinisk udfald efter vaccination [16]. Desuden cirkulerende tumorantigen specifikke CD8

+ T-lymfocytter er blevet identificeret i GBM patienter [18], men den immunsuppressive miljø i tumoren forhindrer fjernelsen af ​​GBM fra disse patienter. Salg

T-celle responser mod tumorantigen målt ved tetramerer og ELISPOT ikke altid hænger sammen med tumorregression i kliniske forsøg test immunterapier til human GBM [19]. Dette antyder, at undertrykkelse af effektive immunresponser mod tumorantigener kan forstyrre immune tumor regression. For nylig har forskere undersøgt, om udtømning af en delmængde af T-lymfocytter kaldet regulatoriske T-lymfocytter (tregs) kan potensere immunterapier mod kræft. Tregs er en subpopulation af CD4

+ T-lymfocytter, som konstitutivt udtrykker transkriptionsfaktoren Foxp3, højaffinitets IL2 receptor CD25 og B7 ligand CTLA4 [20]. Tregs er nødvendige for opretholdelse af tolerance i hele levetiden af ​​organismen [21] og mutationer i Foxp3 er kendt for at forårsage akutte autoimmune lidelser hos mennesker [22]. Foxp3

+ tregs ophobes i menneskelige gliomer under tumorprogression [23], og har vist sig at korrelere med tumor kvalitet [24]. Overlevelse blev forbedret, når tregs blev depleteret fra GL261 tumorbærende mus under anvendelse CD25 antistoffer administreres 7 dage efter tumorimplantation og derefter tre gange om ugen i 3 uger [25]. Også, administration af CD25 depletterende antistoffer blev også vist sig at forbedre overlevelsen når det indgives i kombination med DC transficeret med tumor-mRNA i en GBM model [26].

Vi har for nylig udviklet en kombineret gen terapeutisk tilgang for engineering tumormikromiljøet at inducere migrationen ind i tumormassen af ​​APC’er og fremkalde tumorcelledød [27]. Vores tilgang består udtrykke fms-lignende tyrosinkinase 3 ligand (Flt3L), som inducerer dendritiske celle (DC) infiltration i hjerneparenkymet [28] i kombination med den betingede cytotoksiske genet thymidinkinase (TK) [27], [29], der i nærvær af GCV inducerer tumor- celledød. Denne kombinerede fremgangsmåde inducerer T-celle tumor regression [27]. Vi ønskede at vurdere virkningerne fremkaldt af udtømning af tregs; på tumorprogression i ubehandlede GBM bærende mus og på T-celle-afhængig hjernetumor regression fremkaldt af Ad-Flt3L og Ad-TK behandling. Vores data viste, at udtømning af tregs hjælp af CD25 specifikt hybridoma PC61 induceret tumorregression og langtidsoverlevelse når de indgives 15 dage efter tumorimplantation, uafhængig af tumor-specifikke T-lymfocytter. I kombination med intratumoral levering af Ad-Flt3L og Ad-TK, dog fandt vi, at PC61 administration 24 dage efter tumor implantering (7 dage efter behandling) helt undertrykt adaptive immunrespons mod GL26 tumorantigener. Foruden tregs, er CD25 også udtrykkes på celleoverfladen af ​​precursor B og T-lymfocytter og en moden subpopulation af DC [30] og opreguleres også på celleoverfladen af ​​aktiverede T-lymfocytter og B-lymfocytter [31]. I vores model, administration af CD25-antistoffer også elimineret aktiveret, CD25

+ T-lymfocytter og forhindrede klonal ekspansion af tumor-specifikke T-celler. Vores data tyder på, at brugen af ​​PC61 sigter mod treg udtømning kunne reducere effekten af ​​immunterapeutiske regimer ved at undertrykke aktivering og klonal udvidelse af tumor antigen-specifikke T-lymfocytter.

Resultater

Syngene intrakranielle GBM tumorer er tæt infiltreret med immunceller, herunder tregs

Ophobning af Foxp3

+ tregs i humane gliomer korrelerer med karakteren af ​​tumor og patientens overlevelse [24]. Ophobning af Foxp3

+ tregs i syngene mus gliomer er også blevet beskrevet og udtømning af tregs med CD25-specifikke immunoglobuliner kan fremkalde tumorregression og forbedre overlevelsen i disse prækliniske modeller [25], [32], [33]. For at undersøge, om Treg udtømning kunne forbedre terapeutiske resultat i kombination med immunterapi /genterapi, vi først undersøgt, om tregs infiltreret i det syngene mus gliom følge af intrakranielle implantation af GL26-celler ind i hjernen striatum. Implantation af syngene GL26 celler reproducerbart ført til lineær vækst af tumorer (R

2 0,99) med en gennemsnitlig tumorvolumen på ca. 0,5 mm

3 på dag 15 og 30 gange større (15mm

3) ved dag 24 (fig. 1A). Disse tumorer udviser kraftig infiltration af CD45

+ og F4 /80

+ celler, som er tydelige i hele tumoren masse og også ved grænserne (Fig 1B). Immuncelle infiltration i tumorerne blev også vurderet ved flowcytometri 24 dage efter tumorimplantation (fig. 1 C). Vi har detekteret tumor infiltrerer MDC (CD11c

+ CD45

+ IA

b +, fig. 1CI) og MO (CD11b

+ CD45

+ IA

b +, fig. 1Cii), som udgjorde 3,5% og 19% af det samlede antal CD45 + immunceller til stede i tumoren hhv. Lymfocytter blev også identificeret og udgjorde -80% af det samlede antal CD45 + immunceller infiltrerer tumorerne (fig. 1 C III-VI). Disse omfattede CD4

+ T-celler (CD3e

+ CD4

+ CD8a

-, 26%), CD8a

+ T-celler (CD3e

+ CD4

– CD8a

+, 18%), Foxp3

+ tregs (CD3e

+ CD4

+ Foxp3

+, 8,4%), NK-celler (CD3e

– NK1.1

+ CD45

+, 18%), NK-T-celler (CD3e

+ NK1.1

+ CD45

+, 7%) og B-celler (CD3e

– CD19

+ CD45

+, 5%). Tilstedeværelsen af ​​CD4

+, CD8a

+, blev CD19

+ lymfocytter samt CD205 MDC også observeret ved immunfluorescens (fig. 1 D). Desuden blev et stort antal lymfocytter, der var immunreaktive for CD25 observeret i tumoren ved hjælp af konfokal mikroskopi (fig. 1 D) og flowcytometri (CD3e

+ CD25

+ CD45

+) (fig. 1 E, F). Derudover er den procentdel af CD3e

+ T-celler, som udtrykte celleoverflade CD25 var ~ 40% af det samlede antal tumorinfiltrerende T-celler og var stærkt forhøjede i dræningen (cervical) lymfeknude (DLN) (p 0,01) (. figur 1 E). sammenlignet med milten fra tumorbærende mus

(A) GL26 tumorvolumen 7, 14 og 21 dage efter implantion ind i hjernen striatum hos C57BL /6-mus blev bestemt. Reaktiv astrocytisk farvning (GFAP +) blev anvendt til at definere grænsen af ​​tumoren med ikke-malign hjernevæv. Repræsentative sektioner af musehjerner bærer tumorer implanteret 7, 14 og 21 dage og farvet med GFAP er vist til venstre. Tumorvækst kinetik var i det væsentlige eksponentiel for den periode analyseret med en fordoblingstid på cirka 1,8 dage. 5 mus blev anvendt til at bestemme tumorvolumen på hvert tidspunkt. (B) infiltration af immune celler i intrakranielle GL26 tumorer. Hjernesnit fra tumor-bærende mus blev farvet med antistoffer mod CD45 (leukocytter) eller F4 /80 (makrofager /aktiveret mikroglia). Repræsentative Konfokal billeder viser immunceller (grøn) i tumormassen og i tumoren grænser. DAPI (blå) blev anvendt til at farve kerner. Gule pile angiver immunoreaktive celler. T: tumor. (C) tumorinfiltrerende immune celler blev isoleret fra tumorer 24 dage efter tumorimplantation og analyseret under anvendelse af flowcytometri. (I) Dot plot af CD11c mod I-Ab, som først blev gated for levende CD45 + leukocytter. DC (CD11c + CD45 + I-Ab +) vises i det røde felt. (Ii) makrofager (MO) blev vurderet ved gating levende leukocytter med CD45, derefter plotte CD11 mod I-Ab. Den røde boks skitserer befolkningen i tumor infiltrerer makrofager (CD11 + CD45 + I-Ab +). (Iii) T-celler blev farvet med CD3e-PE, CD4-PerCP og CD8a-FITC. Plottet viser CD4 mod CD8a, når celler først blev gated for CD3e + levende leukocytter. CD4 + T-celler og CD8a + T-celler er vist i røde kasser. (Iv) tumorinfiltrerende tregs blev observeret ved farvning med CD3e-PE, CD4-PerCP og Foxp3-FITC. CD3e + levende leukocytter blev indhegnet og dot plots vise Foxp3 mod CD4 farvning. Befolkningen i tregs (CD4 + Foxp3 + CD3e +) vises i det røde felt. (V) NK og NK-T-celler blev visualiseret ved gating levende CD45 + leukocytter, derefter vise NK1.1 mod CD3e. Bestanden af ​​tumor infiltrerende NK-celler (CD3ε- CD45 + NK1.1 +) og NK-T-celler (CD3e + CD45 + NK1.1 +) er vist i røde kasser. (Vi) tumorinfiltrerende B-celler visualiseret ved gating for levende leukocytter, derefter afbilde CD45 mod CD19. Bestanden af ​​B-celler (CD19 + CD45 +) vises i en rød boks. Procentdelene af hver immun cellepopulation infiltrere tumoren i forhold til det samlede antal tumor CD45 + celler er vist i repræsentative dot plots. (D) Nissl-farvning blev anvendt til at visualisere tumorer i hjernen. Tumorer er tætte i Nissl substans, så plette mørkere end normalt hjernevæv. Repræsentant Konfokal billeder viser tumorinfiltrerende CD4 + -T-celler, CD8 + T-celler, CD205 + MDC’er, CD19 + B-celler og CD25 + immunceller (set i grøn) og DAPI (blå) blev anvendt til at visualisere cellekerner. Gule pile angiver immunoreaktive celler. (E) Flowcytometrisk analyse af den procentdel af T-celler, som udtrykker CD25 i milte, DLN og tumorer i mus, der bærer intrakranial GL26 hjernetumorer 24 dage efter tumorimplantation. (F) Repræsentative dot plots af CD25 vs CD3e i immunceller isoleret fra milten, LN og tumor. Procentdelene af CD25 + -celler population med hensyn til det totale antal CD3e + celler i tumoren, drænende lymfeknuder eller milt er angivet i repræsentative dot plots.

Udtømning af tregs hjælp PC61 inducerer hjernetumor regression men også reducerer T-celler i tumor og DLN

i betragtning af at vi har registreret omfattende infiltration af T regs inden for de intrakranielle GL26 tumorer, vi havde til formål at udtømme denne immun celle population med henblik på at bestemme deres effekt på tumorceller progression og på anti-tumor immunrespons induceret af et T-celle-afhængig immunterapeutisk fremgangsmåde, dvs. Ad-Flt3L /TK. Rotte IgG1 hybridoma PC61 blev fundet at binde med muse høj affinitet IL-2 receptor (CD25) [34] og

in vivo

administration af PC61 mus forårsager nedbrydning af tregs i mere end en uge [33] , [35]. , Anvendes således vi dette antistof for at inducere T reg udtømning

in vivo

i en syngen mus intrakraniel gliom model. Vi først afgøres, om PC61 ville påvirke levedygtighed og vækst

in vitro

tumorceller og

in vivo

. Inkubation af GL26 celler med PC61 påvirkede ikke GL26 cellernes levedygtighed (fig. 2A) eller proliferation

in vitro

(Fig. 2B). Vi derefter administreret PC61 eller isotypekontrol IgG til tumor-bærende athymiske nu /nu mus, som har vist sig at være mangelfuld i T regs [26], [36]. Stemmeoptællingen med andre rapporter [26], fandt vi, at tumorvækst i T reg mangelfuld

nu /nu

immun mangelfuld mus blev ikke påvirket af PC61; både isotypekontrol eller PC61-injicerede mus bukkede grund tumorbyrde 18-22 dage efter tumorimplantation.

(A) GL26-celler blev inkuberet i 48 timer med 100 ug /ml PC61 eller 100 ug /ml rotte IgG1 isotypekontrol. Celler blev derefter høstet og farvet med Annexin V-FITC og propidiumiodid at identificere apoptotiske celler. Ingen signifikant stigning i apoptose blev bemærket, når cellerne blev inkuberet med PC61 eller isotypekontrol immunoglobuliner sammenligner med ubehandlede kontroller (p 0,05). En stor stigning i apoptose blev observeret, når cellerne blev inkuberet i 4 timer med H2O2 (p 0,001). (B) Proliferation af GL26-celler blev målt ved detektion BrdU-inkorporering i DNA. Ingen signifikant forskel i proliferation blev observeret (p 0,05), når cellerne blev inkuberet med PC61 (rotte IgG1αCD25) sammenlignet med isotype kontroller (rotte IgG1) eller ubehandlede celler (*** p 0,001 sammenlignet med negativ (ingen celler) kontrol, ns = ikke-signifikant). (C) athymiske nu /nu mus (Balb /c baggrund) blev provokeret med en enkelt intrakraniel injektion af GL26-celler og behandlet 15 d senere med 1mg enten PC61 eller isotypekontrol immunoglobuliner injiceret i.p. Overlevelse blev overvåget og mus blev aflivet, når døende. Ingen signifikant forskel i overlevelse blev observeret ved anvendelse af en log rank test (p 0,05) (n = 5)

Efter udelukke nogen direkte virkning af PC61 på tumorcellevækst undersøgte vi effekten af ​​T. reg udtømning i vildtype C57 /B6 mus, der bærer intrakraniel GL26 gliom. Den eksperimentelle paradigme anvendes er afbildet i fig. 3A. Udtømning af tregs 15 dage efter tumor celle implantation steget markant antallet af langsigtede overlevende med 40% af musene stadig var i live 150 dage senere (p 0,05, figur 3B.). Dette var mere end 5 gange længere end den gennemsnitlige overlevelse af kontrol tumorbærende mus (fig. 3B). Ingen signifikant stigning i overlevelse på lang sigt blev observeret, når tregs blev depleteret i større tumorer (24 dage) (p 0,05), og kun 10% af musene overlevede langsigtet fra denne gruppe (figur 3B.). Interessant, vi ikke observere nogen DTH reaktioner, når vi injicerede bestrålede GL26 celler i trædepuden af ​​langsigtede overlevende fra treg udtømt mus (fig. 3C). For at vurdere effekten af ​​behandling med PC61

in vivo

, analyserede vi tilstedeværelsen af ​​Foxp3

+ CD4

+ tregs infiltrere GBM masse såvel som i de drænende lymfeknuder og milten efter intraperitoneal injektion af PC61 (dag 15 og 24) eller rotte IgG1-isotypekontrol (dag 15 dage) i tumorbærende mus. PC61 injektion på dag 15 førte til en 9 gange reduktion (p 0,001) i antallet af tumorinfiltrerende tregs når den måles ved anvendelse af flowcytometri 12 dage senere (dag 27), og injektion af PC61 på dag 24 førte til en næsten fuldstændig udtømning af tregs (p 0,001) i tumoren 3 dage senere (dag 27) (. figur 3D). Som forventet, perifere Treg befolkninger i de drænende lymfeknuder (. Figur 3E) og milt (. Figur 3F), blev også signifikant reduceret i forhold til isotype behandlede kontroller (p 0,001). Interessant, observerede vi en 3 gange formindskelse i den absolutte procentdel af CD4

+ T-celler (fig. 4A) og CD8a

+ T-celler (fig. 4B) infiltrerer i tumoren efter administration af PC61. Endvidere PC61 signifikant reducerede populationer af CD4

+ T-celler (p. 0,05, figur 4C) og CD8

+ T-celler (p. 0,01, figur 4d) i tumoren drænende lymfeknuder. Der var ingen ændring bemærket i de procentdele af CD4

+ T-celler og CD8a

+ T-celler i milten (p . 0,05, figur 4E-F) og MO og DC forblev uændret i tumorer og drænende lymfeknuder selv om steg en smule i milt (fig. 5).

(A) Diagram skildrer de forskellige behandlinger, 4 kohorter af tumor bærende mus. GL26-celler blev implanteret i hjernen hos alle mus på dag 0 og blev behandlet ved intratumoral levering af saltvand på dag 17 med udtømning af CD25

+ -celler under anvendelse af PC61 på dag 15 (grøn) eller på dag 24 (rød). Kontrolgrupper af tumorbærende mus fik rotte IgG1-isotypekontrol på dag 15 (blå), eller ingen systemisk administration af immunglobuliner (sort) som angivet. Mus blev anvendt enten til overlevelse undersøgelser, eller aflivet på dag 27 efter tumorimplantation til analyse af immuncellepopulationer ved flowcytometri. (B) Kaplan-Meier-kurve viser overlevelsen af ​​de 4 grupper mus er beskrevet i (A). Ti mus blev anvendt i hver gruppe og en log-rank testen blev anvendt til at beregne signifikans mellem ubehandlede gruppe og PC61-behandlede grupper. * P 0,05 sammenlignet med ubehandlede mus og isotypekontrol behandlede mus. (C) DTH test blev udført på langsigtet overlevende mus 100 d efter tumor implantering. Mus blev oprindeligt behandlet med PC61 på dag 15 (grønne linjer). Bestrålet GL26 celler i PBS i den rigtige bageste trædepude (fyldt kasse) eller PBS-kontrol i venstre bageste trædepude (åben kasse) af mus. Tykkelsen af ​​trædepuden bestemtes 0 timer, 4 timer, 24 timer og 48 timer efter injektion af bestrålede celler eller PBS. Tovejs ANOVA med Tukey post-test blev anvendt til beregning signifikante forskelle. (D-F) tregs (CD3e

+ CD4

+ Foxp3

+) infiltrerer tumorer (D), drænende lymfeknuder (E) eller milt (F) blev kvantificeret i mus administreret rotte IgG1-isotypekontrol ( iso) eller PC61 på dag 15 (15) eller dag 24 (24) som angivet i graferne (til venstre). Dot plots (til højre) viser repræsentative data fra 5 mus per gruppe. Procentdelene af T regs med hensyn til det totale antal CD45 + celler i tumorerne, drænende lymfeknuder (DLN) eller milt er angivet i repræsentative dot plots. One Way ANOVA med Tukey post-test blev anvendt til at bestemme signifikante forskelle (*** p 0,001).

C57BL /6-mus blev udfordret med tumorceller på dag 0 og behandlet på dag 17 ved intratumoral levering af saltvand. Tregs blev tømt på enten dag 15 eller dag 24 ved ip injektion af PC61. Immunceller blev isoleret fra milten, den cervikale LN og det intrakranielle tumor på dag 27 post-tumor implantation at bestemme procentdelen af ​​CD4 + T-celler og CD8a + -T-celler i hvert væv. Procentdelen af ​​tumorinfiltrerende immunceller, der var CD4 + T-celler (CD3e + CD4 + CD8a-) (A) og CD8a + T-celler (CD3e + CD4 CD8a +) (B); procentdelen af ​​immunceller i de drænende lymfeknuder, som var CD4 + T-celler (CD3e + CD4 + CD8a-) (C) og CD8a + T-celler (CD3e + CD4 CD8a +) (D); og procentdelen af ​​immunceller i milten der var CD4 + T-celler (CD3e + CD4 + CD8a-) (E) og CD8a + T-celler (CD3e + CD4 CD8a +) (F) er vist i graferne (venstre). Repræsentative dot grunde til hver behandlingsgruppe vises til højre (gated for levende leukocytter med FSC vs SSC og CD3e + T-lymfocytter). Procentdelene af hver immun cellepopulation med hensyn til det totale antal CD45 + celler i tumorerne, drænende lymfeknuder (DLN) eller milt er angivet i repræsentative dot plots. One Way ANOVA med Tukey post-test blev anvendt til at beregne signifikante forskelle. (* P 0,05, ** p 0,01).

GL26 celler blev implanteret i hjernen striatum af C57BL /6 mus. Rotte IgG1-isotypekontrol immunglobuliner (-) blev indgivet på dag 15 og PC61 blev administreret på dag 15 eller dag 24 som angivet. Procentdelen af ​​tumorinfiltrerende makrofager (MO; CD11 + CD45 + I-Ab +) (A, C, E) og myeloide dendritiske celler (MDC; CD11c + CD45 + I-Ab +) (B, D, F) blev kvantificeret på dag 27 post-tumor implantation ved anvendelse af flowcytometri i tumoren (A, B) DLN (C, D) og milt (E, F). Procentdelene af hver immun cellepopulation med hensyn til det totale antal CD45 + celler i tumorerne, drænende lymfeknuder (DLN) eller milt er angivet i repræsentative dot plots. 5 og 10 mus blev analyseret pr gruppe. One Way ANOVA med Tukey indlæg test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans.

Behandling med PC61 forhindrer aktivering af adaptive anti-tumor immunrespons og hæmmer tumor regression, når de anvendes i kombination med Ad-Flt3L og Ad- TK

Vi har også til formål at undersøge virkningerne af udtømning af tregs anvendelse af et anti-CD25-immunglobulin på effekten af ​​T-celle-afhængige immunterapi medieret af intratumoral levering af Ad-Flt3L og Ad-TK [27], [37]. Aktiverede CD4

+ og CD8

+ T-lymfocytter opregulere celleoverflade CD25 efter indledende binding af TCR med antigen vist på MHC [30], [31], og dette kan forklare den tilsyneladende fald i T-celler, der blev observeret i tumorer (fig. 4A-B) og DLN (fig. 4C-D) efter administration af PC61. For at undersøge dette yderligere, og afgøre, om eliminering af tregs hjælp PC61 kan påvirke T-celle afhængige immunterapi af GBM, vi implanterede tumorer i striatum på dag 0 og mus blev behandlet med Ad-Flt3L og Ad-TK 17 dage senere, mens PC61 eller isotypekontrol immunoglobuliner blev administreret til grupper på dag 15 eller dag 24 (fig. 6A). Da vi injicerede Ad-Flt3L og Ad-TK i tumoren på dag 17 (når tumoren var 1 mm

3 i størrelse (fig. 1A) observerede vi en robust stigning i overlevelse med 50% af musene alive 150 d senere ( p 0,01, figur 6B), der ikke var negativt påvirket af administration af rotte IgG1 isotypekontrol (p .. 0,05) PC61 administreret 2 dage før injektion af Ad-Flt3L og Ad-TK reducerede overlevelsen til 30%, selv om dette ikke var statistisk forskellig fra isotype behandlede kontroller (p . 0,05, figur 6B). da vi behandlede mus med Ad-Flt3L og Ad-TK på dag 17 og forarmet tregs på dag 24, vi fandt imidlertid, at langsigtet overlevelse var signifikant reduceret i forhold med mus, der ikke modtog PC61. (p. 0,05, figur 6B) Kun 10% af tumor-bærende mus overlevede 150 dage senere, hvilket tyder på, at administration af PC6 17 d efter intratumoral levering af Ad-Flt3L og Ad-TK ugunstigt påvirker T . celle afhængig hjernesvulst regression i langsigtede overlevende efter behandling med Ad-Flt3L og Ad-TK, en DTH reaktion på bestrålede GL26 celler i trædepuden blev observeret, når musene var blevet administreret enten PC61 (p 0,01) eller isotypekontroller (p 0,001, Fig 6D ). Interessant vi ikke observere nogen stigning i IFNy secernerende T-lymfocytter som reaktion på BMDC lastet med GL26 celleekstrakter når PC61 blev injiceret enten før (15 dage) eller post (24 dage) behandling ved hjælp af Ad-Flt3L og Ad-TK (p 0,05, fig. 6D). Antallet af tumor infiltrerende tregs blev reduceret efter systemisk levering af PC61 (p. 0,001, figur 6E), og procentdelen af ​​tregs blev også signifikant reduceret i DLN og milt, (p. 0,001, figur 6F-G), uanset om musene blev behandlet med saltvand eller med Ad-Flt3L og Ad-TK.

(A) C57BL /6-mus blev udfordret med tumorceller på dag 0 og behandlet på dag 17 ved intratumoral levering af Ad-Flt3L og Ad-TK eller saltvand som angivet. Tregs blev depleteret på enten dag 15 (grøn) eller dag 24 (rød) ved ip injektion af PC61 eller på dag 15 med isotypekontrol (blå). Immunceller blev isoleret fra milten, den cervikale LN og tumoren. Mus blev enten anvendt til overlevelse undersøgelser eller aflivet på dag 27 til analyse af immuncellepopulationer ved flowcytometri og ELISPOT. (B) Kaplan-Meier-kurve viser overlevelsesdata fra 10 mus per gruppe. Statistisk signifikante forskelle i forhold til Ad-Flt3L og Ad-TK behandlede mus kun (sort linje, ingen PC61 udtømning) blev beregnet ved anvendelse af log-rank test (* p 0,05, ** p 0,01). Administration af PC61 til mus 24 dage efter tumor implantering (7 dage efter behandling med Ad-Flt3L og Ad-TK) signifikant reduceret overlevelse på lang sigt. (C) Tumor bærende mus blev behandlet med Ad-Flt3L og Ad-TK alene (sorte linjer) eller med Ad-Flt3L og Ad-TK med PC61 udtynding på dag 15 (grønne linjer). Lang sigt overlevende (60 d efter tumor implantation) blev vurderet for en DTH reaktion på bestrålede GL26 celler sprøjtes ind i højre trædepude (sammenlignet med PBS kun i venstre trædepude). Two Way ANOVA med Tukey indlæg test blev anvendt til at beregne signifikante forskelle mellem grupperne (*** p 0,001 mus behandlet med Ad-Flt3L og Ad-TK ingen udtynding, p 0,01 Ad-Flt3L og Ad-TK behandlede mus udtømt med PC61 på dag 15). (D) IFNy ELISPOT viser det samlede antal IFNy producerende T-lymfocytter, der var stimuleret med DC ladet med GL26 tumorekstrakter. T-lymfocytter blev oprenset fra mus 10 d efter behandling med enten Ad-Flt3L og Ad-TK (+) eller saltvand (-) som angivet. Sorte bjælker er T-lymfocytter fra mus, der ikke modtog CD25 nedbrydende immunoglobuliner. Grønne søjler er T-lymfocytter oprenset fra mus forarmet med PC61 2 dage før behandling med Ad-Flt3L og Ad-TK (dag 15 efter tumor implantation) og røde bjælker er T-lymfocytter oprenset fra mus udtømt med PC61 7 dage efter behandling med Ad-Flt3L og Ad-TK (dag 24 efter tumorimplantation). (E-G) tregs (CD3e

+ CD4

+ Foxp3

+) infiltrerer tumorer (E), dræning lymfeknuder (F) eller milt (G) blev kvantificeret i mus administreret rotte IgG1 isotype kontrol ( Iso) eller PC61 på dag 15 (15) eller dag 24 (24) som angivet i graferne (til venstre). Administration af PC61 til mus medført langvarige udtømning af tregs i perifere steder (milt og lymfeknuder), og ved tumoren. Dot plots (højre) display repræsentant betyder ± SEM af Foxp3

+ tregs kvantificeret fra 5 mus pr gruppe. Det samlede antal af T regs i tumorerne (E) samt procentdelen af ​​T regs i forhold til det samlede antal CD45 + celler i de drænende lymfeknuder (DLN) eller milt (F og G) er angivet i repræsentative dot plots. Tovejs ANOVA med Tukey post-test blev anvendt til at bestemme signifikante forskelle (*** p 0,001).

Behandling med PC61 forhindrer stigninger i tumorinfiltrerende T-celler og MO, men ikke DC’er efter behandling med Ad