PLoS ONE: Den rolle Metabotropic glutamatreceptor 5 på Stromal celleafledt faktor-1 /CXCR4 System i Oral Cancer

Abstrakt

Vi har vist, at blokering kan CXCR4 være en potent anti-metastatisk behandling for CXCR4-relateret kræft i mundhulen. Men som CXCR4-antagonister er i øjeblikket i klinisk anvendelse til at inducere mobilisering af hæmatopoietiske stamceller, kontinuerlig administration som en inhibitor for metastase kan medføre vedvarende leukocytose. I denne undersøgelse undersøgte vi hidtil ukendt terapeutisk nedstrømsmål (e) af SDF-1 /CXCR4 system, ved hjælp B88-SDF-1-celler, som har en autokrin SDF-1 /CXCR4-system og udviser fjernt metastatisk potentiale

i vivo

. Microarray analyse afslørede, at 418 gener blev opreguleret i B88-SDF-1-celler. Vi identificerede et gen, som er stærkt opreguleret i B88-SDF-1-celler, metabotropiske glutamatreceptor 5 (mGluR5), der blev nedreguleret efter behandling med 1,1 ‘- [1,4-phenylen (methylen)] bis-1,4 , 8,11-tetraazacyclotetradecan octahydrochloride (AMD3100), en CXCR4-antagonist. Opregulering af mGluR5 mRNA i SDF-1 /CXCR4 systemet blev overvejende reguleret af Ras-ekstracellulære signal-regulerede kinase (ERK) 1/2 pathway. Desuden blev væksten af ​​B88-SDF-1 celler ikke påvirkes af mGluR5 agonist (S) -3,5-DHPG (DHPG) eller mGluR5-antagonister 2-methyl-6- (phenylethynyl) pyridin (MPEP) og 3- ((2-methyl-1,3-thiazol-4-yl) ethynyl) pyridin (MTEP). observerede dog, at DHPG forfremmet B88-SDF-1 celle migration, mens både MPEP og MTEP hæmmede B88-SDF-1 celle migration. For at vurdere lægemiddeltoksicitet blev antagonisterne intraperitonealt injiceret i immunokompetente mus i 4 uger. Mus injiceret med MPEP (5 mg /kg) og MTEP (5 mg /kg) ikke udviser nogen bivirkninger, såsom hæmatotoksicitet, allergiske reaktioner eller vægttab. Administrationen af ​​antagonister inhiberede signifikant metastase af B88-SDF-1-celler til lungerne hos nøgne mus. Disse resultater antyder, at blokering mGluR5 med antagonister såsom MPEP og MTEP kunne forhindre metastase i CXCR4-relateret oral cancer uden at forårsage bivirkninger

Henvisning:. Kuribayashi N, Uchida D, Kinouchi M, Takamaru N, Tamatani T, Nagai H, et al. (2013) Den rolle Metabotropic glutamatreceptor 5 på Stromal celleafledt faktor-1 /CXCR4 System i Oral Cancer. PLoS ONE 8 (11): e80773. doi: 10,1371 /journal.pone.0080773

Redaktør: En R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA

Modtaget: 11. juli, 2013; Accepteret: 6 oktober 2013; Udgivet: November 13, 2013 |

Copyright: © 2013 Kuribayashi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B; 24.792.225; https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Vi har tidligere vist, at B88 celler, mundtlige kræftceller, der udtrykker kemokinreceptoren CXCR4, specifikt. metastaserer til cervikale lymfeknuder via en stromal celleafledt faktor (SDF) -1 gradient produceret af lymfe stroma [1-3]. Den tvungne-ekspression af SDF-1 i B88-celler (opkaldt B88-SDF-1-celler) Tildelt forøget cellemotilitet og lungemetastaser efter intravenøs inokulation [4]. For nylig har vi også vist, at CXCR4 ekspression bidrager til metastatiske potentiale spytkirtel cancere [5]. Endvidere har vi også vist, at blokering CXCR4 med 1,1 ‘- [1,4-phenylen (methylen)] bis-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan octahydrochloride (AMD3100), en CXCR4-antagonist, kan være en potent anti -metastatic terapi for CXCR4-relaterede hoved- og halscancer [5,6].

SDF-1 /CXCR4 systemet primært fungerer som en kemotaktisk faktor i kræftceller at nå metastatiske steder. Men for at etablere den metastase, flere vigtige processer, såsom invasion, intravasation, ekstravasation og ektopisk vækstpotentiale, er uundværlige. Således er det kritisk at undersøge funktionen af ​​nedstrømsmål (er) er ansvarlig for etableringen af ​​metastase i SDF-1 /CXCR4-system. Desuden har nylige kliniske forsøg vist, at en enkelt indgivelse af AMD3100 er effektivt til at mobilisere hæmatopoietiske stamceller, selvom om AMD3100 hurtigt elimineres med en estimeret fordeling halveringstid på 0,3 timer og terminal halveringstid på 5,3 timer [7, 8]. Dog kan effektive CXCR4-relaterede anti-metastatiske behandlinger kræver den daglige administration af AMD3100 til løbende at forhindre spredning af premetastatic celler til metastatiske steder, som kan forårsage kronisk leukocytose. Hvis blev identificeret nedstrøms målgen (er) af SDF-1 /CXCR4 systemet specifikt udtrykkes i cancerceller, forventes det, at anti-metastatisk terapi kan udføres mere sikkert og effektivt. Dog er målet gen (er) af SDF-1 /CXCR4 systemet ikke fuldt forstået. Således i denne undersøgelse undersøgte vi hidtil ukendt terapeutisk nedstrømsmål (e) af SDF-1 /CXCR4-system i B88-SDF-1-celler, som har en autokrin SDF-1 /CXCR4-system og udviser fjernt metastatisk potentiale in vivo, anvendelse af cDNA microarrays [4].

Materialer og metoder

Etik erklæring

Musene blev håndteret i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske dyreforsøg fra University of Tokushima (Permit nummer: 10084). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

cDNA microarray analyse

Total RNA til cDNA microarray analyse blev udvundet serum-sultede B88-mock celler og B88-SDF-1 celler. Applied Biosystems Chemiluminescent RT-IVT Labeling Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) blev anvendt til at omdanne total RNA til digoxigenin (DIG) -mærkede cRNA. Et ug totalt RNA blev anvendt til at danne det dobbeltstrengede cDNA. CDNA’et blev transkriberet med DIG-mærkede nukleotider (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz), fragmenterede og hybridiseret til humane genom Survey Array (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. Efter vask hver opstilling, blev signalet fremkaldt med anvendelse af et kemiluminescerende detektion kit (Life Technologies). Forarbejdede arrays blev scannet med en 1700 kemiluminescerende microarray analysator (Life Technologies). Disse resultater blev analyseret med anvendelse af GeneSpring GX 12.5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com, Redwood City, CA) software. Funktionel analyse af IPA identificerede biologiske funktioner eller sygdomme, der var mest markant for datasæt. Fischers eksakte test blev anvendt til at beregne en p-værdi bestemme sandsynligheden at hver biologiske funktion eller sygdom tildelt det pågældende datasæt skyldtes chance alene. De microarray rå data er deponeret i Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) i henhold til minimum oplysninger om microarray eksperiment (MIAME) retningslinjer. Tiltrædelsen nummer er GSE50507.

Celler og cellekultur

B88 celler blev oprindeligt etableret fra en patient med tungen kræft [1], og skønnes fri for mycoplasma og bakterielle forureninger. Celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Sigma, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin i en fugtig atmosfære af 95 % luft og 5% CO2 ved 37 ° C

Glutamat assay

i alt 5 x 10

6 celler, blev podet på 100 mm skåle (Falcon,. Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA). Medium blev erstattet med DMEM uden L-glutamin og FCS efter 24 timer. Efter yderligere 24 timers dyrkning blev det konditionerede medium opsamlet og 100 pi blev analyseret med en Amplex® Red Glutaminsyre /Glutamat oxidase Assay Kit (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. Fluorescens blev målt med en Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) med 530 nm excitation og 590 nm fluorescens detektion.

Mus og in vivo undersøgelse

C3H /høne mus og BALB /c nøgne mus blev købt hos CLEA Japan (Osaka, Japan) og blev holdt under patogenfrie betingelser. I den eksperimentelle kemoterapi, blev C3H /HeN mus anvendt som kontrol immunkompetente mus [9], og blev behandlet dagligt med enten subkutan (SC) injektioner af AMD3100 (2,5 mg /kg; Sigma) [5,6] eller intraperitoneal (ip) injektioner af 2-methyl-6- (phenylethynyl) pyridin (5 mg /kg; MPEP, Tocris Bioscience, Bristol, UK) [10], 3 – ((2-methyl-1,3-thiazol-4-yl) ethynyl ) pyridin (5 mg /kg; MTEP; Calbiochem, San Diego, CA, USA) [10], eller det samme volumen saltvand. Mus behandlet med AMD3100 blev aflivet på dag 1, 14 og 28, og mus behandlet med MPEP eller MTEP blev aflivet på dag 1, 7, 14, 21, og 28. Alle mus blev aflivet ved afblødning under bedøvelse med natriumpentobarbital og en komplet blod tæller blev udført ved hjælp af en ADVIA120 (Siemens Healthcare Diagnostics KK, Tokyo, Japan) ved Taiho Pharmaceutical Co, Ltd (Tokyo, Japan). For metastase assayet blev 1 x 10

6 B88-SDF-1-celler inokuleret intravenøst ​​(i.v.) før behandling med midler. Mus blev aflivet 30 dage efter celleinokulering, og lunger blev eksstirperet og gennemskåret. Den ene halvdel af lungen blev fastsat til histopatologisk analyse og farvet med H-E og den anden blev lyseret til kvantitativ analyse ved hjælp Alu-PCR. De primere, der blev anvendt til Alu-PCR var Halu-UP: ACGCCTGTAATCCCAGCACTT, Halu-DN: TCGCCCAGGCTGGAGTGCA [11]. Gen-specifikke produkter blev målt kontinuerligt ved en ABI PRISM 7000 Sequence Detection System til 35 cykler bruger Thunderbird SYBR® qPCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japan).

RT-PCR

Celler dyrkes som monolag blev høstet ved sub-konfluens. Efter 24 timer blev RNA isoleret med TRlzol-reagens (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. RT-PCR for mGluR5 og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) mRNA blev udført under følgende betingelser: 94 ° C i 2 min; derefter 30 cykler ved 94 ° C i 1 min, 60 ° C i 1 min og 72 ° C i 1 min; og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 1 min. Primer sekvenser for human mGluR5 og GAPDH var som følger: mGluR5-UP: 5′-TGGCCACCCTGTTTGTTACT-3 ‘, mGluR5-DN: 5′-GCACTGAGGCTGACCGAGAA-3′, GAPDH-UP: 5’-GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3 ‘, og GAPDH- DN: 5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3 ‘. Til kvantitativ RT-PCR, undersøgte vi ekspressionen af ​​mGluR5 og GAPDH af en

Δ

ACt metode. mGluR5 og GAPDH mRNA blev samtidig detekteret med Taqman

TM Gene Expression Assays (Life Technologies) ifølge producentens anvisninger. Genspecifikke blev kontinuert målt med en ABI StepOnePlus Real-Time PCR systemet i løbet af 40 cyklusser af PCR.

Flowcytometrisk analyse

logaritmisk voksende celler blev trypsinbehandlet og fikseret i 4% paraformaldehyd (V /V) på is i 10 min. Cellerne blev vasket og inkuberet med anti-mGluR5 mAb (fortynding 1: 100; R 0.05.

Resultater

Isolering af målgenet, metabotropiske glutamat receptor 5, som er foranlediget af SDF-1 /CXCR4 systemet

Vi undersøgte roman terapeutisk nedstrøms mål ( e) af SDF-1 /CXCR4-system under anvendelse af de orale cancerceller, B88-SDF-1, som har en autokrin SDF-1 /CXCR4-system og udviser fjerne metastatiske potentialer

in vivo

. Microarray analyse afslørede, at 418 gener blev opreguleret i B88-SDF-1-celler sammenlignet med mock-celler, og at ekspressionen af ​​metabotrope glutamatreceptor 5 (mGluR5) steg 46 gange (5th ovenfra) i B88-SDF-1-celler, med den højeste score svarende til mGluR5 vej som vist ved IPA (data ikke vist). Desuden Park og kolleger viste, at stærk mGluR5 udtryk er forbundet med patientens overlevelse og at mGluR5-antagonister hæmmer migration af orale kræftceller

in vitro

[13]. Således har vi analyseret mGluR5 som en mulig kandidat gen involveret i SDF-1 /CXCR4-system. For at bekræfte specificiteten af ​​microarray analyse blev mRNA-ekspression af mGluR5 bekræftet ved RT-PCR. Svarende til microarray resultater blev mRNA ekspression af mGluR5 opreguleret i B88-SDF-1 celler, sammenlignet med mock-celler (figur 1A) og inhiberet af behandling med AMD3100 (figur 1A). Vi har tidligere vist, at SDF-1 /CXCR4 systemet aktiverer både Ras-ekstracellulære signal-regulerede kinase (ERK) 1/2 og phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt pathways [1]. Vi har derfor næste undersøgte inddragelse af disse veje i opregulering af mGluR5. Ekspressionen af ​​mGluR5 blev fuldstændigt ophævet ved behandling med U0126, en MEK-inhibitor og delvist inhiberet med wortmannin, en PI3K-inhibitor (figur 1B). Vi opnåede også lignende resultater i kvantitativ RT-PCR (figur 1C). Desuden blev opregulering af mGluR5-protein også observeret i flowcytometri og immuncytokemi resultater (figur 1D, E).

(A) Ekspression af mGluR5-mRNA blev bekræftet i B88-mock og B88-SDF-1-celler i både nærvær og fravær af AMD3100 (1 ug /ml). Human placenta blev anvendt som en positiv kontrol (PC). (B) Celler blev behandlet med U0126 (10 nM) eller wortmannin (50 nM) i 48 timer og mRNA-ekspression af mGluR5 blev analyseret ved RT-PCR. (C) Ekspression af mGluR5-mRNA blev bekræftet af real-time PCR. **;

s

0,01 sammenlignet med ubehandlede B88-SDF-1-celler ved envejs ANOVA. ND; ikke påvises. (D) Protein ekspression af mGluR5 blev evalueret i B88-mock og B88-SDF-1-celler ved anvendelse af flowcytometri. Logaritmisk voksende celler blev inkuberet med eller uden anti-mGluR5-mAb og farvet med gede-PE-mærket anti-muse IgG. Hvide og røde zoner indikerer celler farvet med isotype kontrol og anti-mGluR5 mAb hhv. (E) Protein ekspression af mGluR5 blev påvist ved immunocytokemi. Kernen blev farvet med DAPI (blå)

Udtrykket af glutamatreceptorer i B88-SDF-1 celler

glutamatreceptorer er opdelt i to kategorier.; mGluR’er og ionotrope GluRs (iGluRs), som yderligere er karakteriseret som enten N-methyl-D-aspartat (NMDA), a-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionsyre (AMPA) eller kainat (KA) receptorer [14,15]. Vi valideret ekspressionen af ​​glutamatreceptorer, der er involveret i SDF-1 /CXCR4-system under anvendelse af en cDNA-mikroarray. Af de 8 typer af mGluR’er undersøgte, var kun ekspressionen af ​​mGluR5 markant opreguleret i B88-SDF-1-celler (tabel 1). Endvidere af de 14 typer iGluRs undersøgte ekspressionen af ​​GluR1, en AMPA-receptor, steg 6 gange i B88-SDF-1-celler (tabel 2).

Group

mGluR’er

Fold induction

*

ImGluR11.27mGluR546.13IImGluR20.98mGluR30.67mGluR40.19IIImGluR61.54mGluR71.06mGluR80.46Table 1. Angivelse af mGluR’er i cDNA microarray analyse.

* Opregulering af B88-SDF-1 celler vs B88-mock celler CSV Hent CSV Group

iGluRs

Fold induktion

*

AMPAGluR16.05GluR21.42GluR3NDGluR41.04KAGluR50.46GluR60.47GluR70.84KA10.41KA20.39NMDANMDA12.34NMDA2A2.21NMDA2B0.71NMDA2C0.12NMDA2D1.23Table 2. Angivelse af iGluRs i cDNA microarray analyse.

* Opregulering af B88-SDF-1 celler vs B88-mock celler CSV Hent CSV

Produktionen af ​​glutamat i orale kræftceller

Vi næste undersøgt produktionen af ​​glutamat, en mGluR5-ligand, i B88 og dets transfektanter, B88-mock og B88-SDF-1-celler. Glutamat produktion blev påvist i de konditionerede medier afledt af disse celler ved en koncentration på ca. 12 pM (tabel 3). Imidlertid glutamat produktionen var ikke afhængig af enten SDF-1 /CXCR4 system eller ekspressionsniveauet for mGluR5.

Celler

B88

B88-mock

B88-SDF-1

glutamat release (uM) 12,23 ± 0.3012.17 ± 0.1712.21 ± 0.29Table 3. Produktion af glutamat i oral cancer celler.

CSV Hent CSV

rolle mGluR5 på cellevækst

Vi undersøgte effekten af ​​mGluR5 på cellevækst ved anvendelse af et specifikt mGluR5 agonist, DHPG, og to antagonister, MPEP og MTEP. Agonisten og antagonister påvirkede ikke væksten af ​​enten B88-mock eller B88-SDF-1-celler (figur 2).

Et konfluent monolag af celler blev behandlet med enten 100 uM DHPG, 20 pM MPEP (A) eller 20 uM MTEP (B). Virkningen af ​​mGluR5 på cellevækst blev vurderet ved anvendelse af MTT-assayet. Der var ingen signifikante forskelle mellem de tre grupper ved envejs ANOVA.

rolle mGluR5 på SDF-1 /CXCR4-afhængig cellevandring

Derefter undersøgte vi virkningen af ​​mGluR5 på SDF-1 /CXCR4-afhængige migrering af celler. Sårheling analyser viste, at den forbedrede motilitet af B88-SDF-1 celler blev yderligere accelereret med DHPG behandling, men blev væsentligt forringet ved MPEP og MTEP behandling (figur 3A, B). Antagonister til mGluR5 inhiberede også migreringen af ​​B88-SDF-1-celler, som vist ved en migrering kammer assay (figur 3C). Desuden DHPG forbedrede F-actin polymerisering på forkant, mens MPEP og MTEP hæmmede F-actin polymerisering (Figur 3D-G). Vi har også observeret inhiberingen af ​​matrigel invasion med MTEP behandling i B88-SDF-1-celler (data ikke vist).

(A) B88-mock eller B88-SDF-1 celler blev dyrket til konfluens. En sårhelende assay blev udført i nærvær af enten 100 uM DHPG, 20 pM MPEP eller 20 uM MTEP. (B) De kvantitative data fra (A). *;

s

0,05 sammenlignet med DHPG-behandlede celler ved envejs ANOVA. (C) Den motilitet af B88-SDF-1-celler i nærvær af enten 100 uM DHPG blev 20 pM MPEP eller 20 uM MTEP undersøgt under anvendelse af et transwell migration assay. *;

s

0,05 sammenlignet med ubehandlet kontrol eller DHPG-behandlede celler ved envejs ANOVA. (D-G) F-actin polymerisation i forkanten af ​​B88-SDF-1-celler blev undersøgt af immuncytokemi følgende (D) ingen behandling, (E) DHPG behandling, (F) MPEP behandling og (G) MTEP behandling. Nucleus blev farvet med DAPI (blå).

Effekt af mGluR5 antagonister på immunkompetente mus

Fordi mGluR5 kan være en roman metastatisk mål i oral cancer, vi evaluerede bivirkninger af mGluR5-antagonister i C3 /HeN mus. Intet vægttab eller makroskopiske orgel abnormiteter blev detekteret hos mus, der blev behandlet med de mGluR5-antagonister MPEP og MTEP (data ikke vist). Desuden har disse antagonister fremprovokere hematotoxicities såsom anæmi og leukocytose (figur 4A-C). Vi evaluerede også bivirkninger af AMD3100 på C3H /HeN mus. Intet vægttab, makroskopiske organsystemer abnormiteter eller ændring i røde blodlegemer blev observeret i mus administreret med AMD3100 (data ikke vist); dog var betydelig og kronisk leukocytose observeret efter daglig subkutan administration af AMD3100 (data ikke vist).

C3H /HeN mus blev behandlet intraperitonealt med MPEP (5 mg /kg), MTEP (5 mg /kg) eller den samme volumen saltvand dagligt. Mus blev aflivet på dag 1, 7, 14, 21, og 28 ved afblødning og WBC (

A

), røde blodlegemer (RBC, B) og hæmoglobin (Hb c) niveauer blev målt. Der var ingen signifikante forskelle mellem de tre grupper ved envejs ANOVA.

rolle mGluR5 i SDF-1 /CXCR4-afhængige celle metastase

Derfor bestemte vi effekt af mGluR5-antagonister på lungemetastaser af B88-SDF-1-celler. Talrige metastatiske knuder blev detekteret i lungerne hos mus, som blev inokuleret med B88-SDF-1-celler (figur 5A, venstre). Imidlertid blev en signifikant reduktion i metastatiske lungeknuder observeret hos mus behandlet med MPEP (figur 5A, midterste) og MTEP (figur 5A, højre), som vist ved histopatologisk analyse i en 4 ugers observationsperiode. Vi bekræftede også tilstedeværelsen af ​​metastatiske kræftceller i udvundet lungevæv ved hjælp af kvantitativ Alu-PCR. Følgelig ekspressionen af ​​humant Alu DNA i mus behandlet med mGluR5-antagonister var signifikant lavere end hos mus behandlet med saltvand (figur 5B).

Celler blev podet i blodkarret af nøgne mus, der blev aflivet på dag 30. (A) repræsentant H 0,01 sammenlignet med saltopløsningskontrollen ved envejs ANOVA.

Discussion

Glutamat er en unik ligand for mGluR5, en metabotrop glutamatreceptor tilhører familien af ​​G-protein-koblet receptorer [16,17], der er ubikvitært findes i hjernebarken, hippocampus, nucleus caudatus og nucleus accumbens i nervesystemet (CNS) [16,17]. Det er blevet foreslået, at mGluR5 er involveret i CNS-lidelser, der induceres af hypersekretion af glutamat, såsom epilepsi, neurogen eller inflammatorisk smerte, psykose, dyskinesi, hovedpine og narkotikamisbrug [16,17]. På det cellulære niveau, mGluR5 regulerer vækst og migration af gliaceller [18], neurale forløber stamceller [19], embryonale stamceller [20] og gliom celle [21]. Selvom rollen som mGluR5 i cancer progression fortsat uklart, seneste undersøgelser tyder på, at mGluR5 funktioner i tyktarmen [22], bryst [22] og prostatacancerceller [23]. Desuden Park og kolleger viste, at stærk mGluR5 udtryk er forbundet med patientens overlevelse og at mGluR5-antagonister hæmmer migration af orale kræftceller

in vitro

[13]. Disse resultater antyder, at mGluR5 fungerer som et onkogen i faste cancere, herunder oral cancer. På den anden hænder, har nylige undersøgelser vist, at glutamat er produceret af mesenkymale celler, såsom osteoblaster og osteoklaster, epitelceller, såsom pancreas-ø-celler og keratinocytter, bryst- og prostatacancerceller [24-27]. Derudover er produktionen af ​​glutamat i gliomaceller blevet rapporteret at være forbundet med proliferation og invasion [21,28,29]. Derudover demonstrerede Badning og kolleger betydeligt forøgede koncentrationer af glutamat i sera fra patienter med kræft i bugspytkirtlen, som målt ved metabolomics analyse [30]. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at B88-celler og dets transficerede derivater, producere glutamat i deres konditionerede medier ved en koncentration på ca. 12 uM. Disse koncentrationer var i lighed med resultaterne beskrevet af Seidlitz og kolleger i brystcancercellelinje, MDA-MB-231 [29]. Disse resultater viser, at glutamat og dens receptor er associeret med cancer progression. Der blev imidlertid ikke observeret nogen forskel i glutamat produktionen mellem B88-mock og B88-SDF-1-celler, selv om ekspressionen af ​​mGluR5, en receptor for glutamat, blev opreguleret i B88-SDF-1-celler. Disse resultater antyder, at ekspressionen af ​​mGluR5, snarere end glutamat produktion, er nødvendig for glutamaterge system, at være involveret i SDF-1 /CXCR4 signalering.

For nylig har syntetiske mGluR5-antagonister blevet udviklet som potentielle lægemidler til CNS-lidelser, der induceres af hypersekretion af glutamat [11,31,32]. Det er blevet rapporteret, at indgivelse af MPEP og MTEP har været anvendt til effektivt at behandle smerte symptomer, Parkinsons sygdom, kognition lidelse, depression, angst og skizofreni [16,17]. Selvom vi oprindeligt brugt MPEP som mGluR5 antagonist i denne undersøgelse, betydelige ikke-specifikke handlinger MPEP, herunder hæmning af AMPA eller NMDA-receptorer, er blevet angivet [10]. Endvidere har vi fundet en 6-fold forøgelse i ekspressionen af ​​GluR1, en AMPA-receptor involveret i væksten og invasion af gliomaceller, i B88-SDF-1-celler [33,34]. For at udelukke den ikke-specifikke effekt af MPEP på mGluR5, vi re-evalueret rolle mGluR5 på SDF-1 /CXCR4 systemet ved hjælp af nyligt udviklede mGluR5 antagonist MTEP, hvilket er mere stærkt selektiv for mGluR5 og har færre off-target effekter end MPEP [10]. Men både MPEP og MTEP havde lignende virkninger på migration og metastase af B88-SDF-1 celler, hvilket indikerer en specifik effekt af mGluR5 på SDF-1 /CXCR4-system.

Vi har registreret additive virkninger af mGluR5 agonister DHPG i migration assay trods indeholdende en stor mængde af glutamat i medierne. Selvom vi ikke har overholdt den direkte aktivering af mGluR5, anses det DHPG sandsynligvis aktivere mGluR5 i B88-SDF-1 celler, fordi DHPG ikke øge migration i mock celler, som ikke udtrykker mGluR5 (data ikke vist). Cleva og Olive viste, at mGluR5 er fysisk koblet til NMDA-receptorer af forskellige stilladser proteiner, og er biokemisk koblet til NMDA receptor funktion via PKC [35]. Desuden har denne mGluR5-NMDA interaktion er observeret i adskillige hjerne præparater, hvorved aktiveringen af ​​mGluR5-receptorer med DHPG potentierer NMDA-receptormedierede responser til eksogent anvendt glutamat eller NMDA [35]. Fordi B88-SDF-1-celler udtrykker NMDA-receptorer i vores microarray analyse (tabel 1), kan dette additiv effekt af DHPG skyldes den samtidige aktivering af NMDA-receptor-vejen.

I den foreliggende undersøgelse påviste vi, inddragelse af Ras-ERK1 /2-vejen på opregulering af mGluR5 af SDF-1 /CXCR4-system. Selv om en associering mellem mGluR5 og SDF-1 /CXCR4 systemet ikke er blevet rapporteret i cancerceller, har Luo og hans kolleger viste induktionen af ​​mGluR5 på E14.5 neurale precursorceller ved stimulering med SDF-1. De foreslog også, at mGluR5 ekspression af SDF-1 /CXCR4-system induceres af transkriptionsfaktoren, Ets, som aktiveres af ERK1 /2 signalvej [36]. Fordi

mGluR5

gen er Ets bindingssites i deres promotorer [37], CXCR4 /ERK1 /2 /Ets-vejen kan være involveret i induktionen af ​​mGluR5 som blev observeret i vores eksperiment.

Vi gjorde det samme forsøg under anvendelse af en oral SCC cellelinie HNT, hvori ekspressionen af ​​CXCR4 er 7,5 gange lavere end den, B88-celler [1]. HNT-SDF-1-celler gjorde udviser mindre, men ikke signifikant, fænotypiske ændringer in vitro og in vivo [4], og mGluR5 induktion blev kun detekteret i en marginal niveau, sandsynligvis på grund af den reducerede ekspression af CXCR4, sammenlignet med den af B88 celler. Således kan CXCR4 ekspressionsniveauet og stærk nedstrøms signalering være også kritisk for aktiveringen af ​​mGluR5-vejen.

Vi opdagede, at mGluR5-antagonister signifikant hæmmede SDF-1 /CXCR4-afhængige migration og metastase. Selvom SDF-1 /CXCR4 systemet primært fungerer som en kemotaktisk faktor i cancerceller, er det også involveret i de adskillige metastatiske processer, såsom neovaskularisering, celleadhæsion, invasion, udvækst og epitelial til mesenkymale overgang [38-43]. I den foreliggende undersøgelse mGluR5 reguleret cellemigrering associeret med SDF-1 /CXCR4-system; det er imidlertid usandsynligt, at mGluR5-antagonister undertrykker SDF-1 /CXCR4-afhængige metastase kun via inhiberede celle migration. Selv mGluR5 har vist sig at forbedre vedhæftningen og invasion af orale cancerceller [13] og den udvækst af neurale celler [44], få oplysninger om metastase-relaterede funktioner. mGluRs aktiverer både MAPK og AKT veje, som er to kendetegnende signalveje, der fremmer kræft vækst og metastase [45,46]. Således kan målrette mGluR5 undertrykke disse kritiske metastatiske veje og hæmme kræft metastaser.

I vores tidligere undersøgelse, opdaget vi CXCR4 udtryk i ca. 60% af de primære oral cancer og konkluderede, at CXCR4-positive tilfælde havde en signifikant dårligere prognose end CXCR4-negative tilfælde [3]. Selvom vi ikke undersøge ekspressionen af ​​mGluR5 i orale kræft væv, Park og kolleger viste, at 70% af oral cancer udtrykker mGluR5, og at overekspression af mGluR5 falder overlevelsesraten for patienter med kræft i mundhulen [13]. Tilsammen er associationen mellem CXCR4 og mGluR5 stærkt foreslået at fremme udviklingen af ​​oral cancer.