PLoS ONE: CCL21 /CCR7 Fremmer G2 /M fase Progression via ERK Pathway i Human ikke-småcellet lungekræft celler

Abstrakt

C-C kemokinreceptor 7 (CCR7) bidrager til overlevelsen af ​​visse cancer cellelinjer, men dens rolle i udbredelsen af ​​humane ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler forbliver vage. Proliferationsassays udføres på A549 og H460 NSCLC celler under anvendelse Cell Counting Kit-8 viste, at aktivering af CCR7 ved sin specifik ligand, exogent kemokinligand 21 (CCL21), var forbundet med en signifikant lineær stigning i celleproliferation med varigheden af ​​udsættelse for CCL21. Den CCL21 /CCR7 interaktion forøgede signifikant fraktion af celler i G

2 /M-fasen af ​​cellens cyklus som målt ved flowcytometri. I modsætning hertil CCL21 /CCR7 havde ingen signifikant indflydelse på G

0 /G

1 og S faser. Western blot og real-time PCR viste, at CCL21 /CCR7 signifikant opreguleret ekspression af cyclin A, cyclin B1 og cyclin-afhængig kinase 1 (CDK1), som er relateret til G

2 /M faseovergang. Ekspressionen af ​​cyclin D1 og cyclin E, der er relateret til G

0 /G

1 og G

1 /S overgange, blev ikke ændret. Den CCL21 /CCR7 interaktion signifikant forøget phosphorylering af ekstracellulært signal-reguleret kinase (P-ERK), men ikke Akt, som målt ved Western blot. LY294002, en selektiv hæmmer af PI3K, der forhindrer aktivering af nedstrøms Akt, ikke svække effekten af ​​CCL21 /CCR7 på P-ERK. Co-immunpræcipitationseksperimenter yderligere bekræftet, at der var en vekselvirkning mellem P-ERK og cyklin A, cyklin B1, eller CDK1, især ved tilstedeværelse af CCL21. CCR7 lille interfererende RNA eller PD98059, en selektiv inhibitor af MEK som afbryder aktiveringen af ​​downstream ERK, betydeligt afskaffet virkningerne af eksogent CCL21. Disse resultater antyder, CCL21 /CCR7 bidrager til den tidsafhængige proliferation af humane NSCLC-celler ved opregulering cyclin A, cyclin B1, og CDK1 potentielt via ERK-vejen

Henvisning:. Xu Y, Liu L, Qiu X Jiang L, Huang B, Li H, et al. (2011) CCL21 /CCR7 Fremmer G

2 /M Fase Progression via ERK Pathway i Human ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 6 (6): e21119. doi: 10,1371 /journal.pone.0021119

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: May 7, 2011; Accepteret: 19 maj 2011; Udgivet 16. juni, 2011

Copyright: © 2011 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.972.967) og Research Fund for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina (nr 20092104110018). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CC kemokinreceptor 7 (CCR7) udtrykkes på alle naive T-celler og på nogle hukommelses T-celler, B-celler og modne dendritiske celler [1]. Ved interaktion med dets ligander, kemokinligand 19 (CCL19) eller kemokinligand 21 (CCL21) [2], CCR7 bidrager til lymfocyttrafik og homing til lymfeknuder under immune og inflammatoriske reaktioner [3] – [5]. CCR7 udtrykkes kraftigt i ikke- småcellet lungecancer (NSCLC), brystkræft, og pladecellecarcinom i hoved og hals og er ansvarlig for mediering af metastase i visse cancerceller linjer [6] – [15]. Til dato har den rolle, CCR7 i proliferationen af ​​humane NSCLC-celler ikke blevet belyst.

Aktivering af CCR7 kan øge phosphorylering af ekstracellulært signal-reguleret kinase (P-ERK) eller Akt (P-Akt) via Gi-proteiner, der kan forbedre celleproliferation eller overlevelse [16] – [20]. ERK tilhører mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) -familie, som også omfatter c-Jun N-terminal kinase (JNK) og p38. Den ERK kaskade, aktiveret af mitogene stimuli, er afgørende for spredning og overlevelse [21], [22] og er nødvendig for normal progression i mitose [23], [24]. JNK- og p38 pathways aktiveres som reaktion på kemikalier og miljømæssige stress [25] – [27]. Akt (også kendt som Akt1), en mediator af vækstfaktor-induceret celle overlevelse [28] – [30]., Kan fremme celledeling via fosforylering [31]

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge effekt og reguleringsmekanisme af CCL21 /CCR7 interaktion på spredning af A549 og NCI-H460 (H460) humane NSCLC celler. Her, demonstrerede vi, at CCL21 /CCR7 bidraget til den tidsafhængige proliferation af humane NSCLC-celler ved at opregulere ekspressionen af ​​cyclin A, cyclin B1, og CDK1 via ERK-vejen. Information vundet fra denne undersøgelse giver indsigt i de mekanismer overlevelse CCR7-medieret cancerceller og har konsekvenser for behandlingsmål i NSCLC.

Resultater

CCL21 /CCR7 fremmer spredning af A549 og H460 celler . I en tidligere undersøgelse identificerede vi en højere CCR7 ekspressionsniveau i A549 og H460 humane NSCLC-cellelinjer sammenlignet med andre cellelinier [32]. For at undersøge den rolle, CCR7 i funktion A549 og H460 celler, blev CCR7 aktivering og inhibering induceret med eksogent CCL21 og med CCR7 lille interfererende RNA (siRNA), hhv. Efter transfektion med CCR7 siRNA (siCCR7) eller kontrol siRNA blev ekspressionen af ​​CCR7 evalueret under anvendelse af Western blot og revers transkriptase (RT) -PCR. Vi fandt, at siCCR7 betydeligt nedreguleret protein- og mRNA-niveauer af CCR7, sammenlignet med kontrol-siRNA (figur 1).

A549 (A) og H460 (B) celler blev transficeret med kontrol siRNA eller CCR7 siRNA (siCCR7) . Efter transfektion ekspressionen af ​​CCR7 protein (a) og mRNA (b) blev evalueret under anvendelse af Western blot (a) og RT-PCR (b) og sammenlignet med utransficerede A549 eller H460 celler. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. * P. 0,05 sammenlignet med kontrol celler

For at bestemme virkningen af ​​CCL21 /CCR7 på celleproliferation blev CCK-8 assay udført på A549 og H460 celler. Ifølge de offentliggjorte data [33], [34] og resultaterne af vores indledende forsøg, ved 100 ng /ml-koncentrationer CCL21 væsentligt fremmet celleproliferation, sammenlignet med 50 ng /mL koncentrationer, mens der var ingen signifikant forskel mellem 100 ng /ml og 200 ng /ml-koncentrationer (figur 2). Derfor ved 100 ng /ml-koncentrationer CCL21 blev anvendt i følgende forsøg. Den CCL21 /CCR7 interaktion fremmes signifikant celleproliferation, mens siCCR7 betydeligt ophævet virkningen af ​​CCL21 (figur 3). siCCR7 alene havde ingen signifikant virkning på celleproliferation, sammenlignet med kontrol- celler. Der blev observeret signifikante forskelle mellem hele tiden undersøgt punkt (alle p 0,01), hvilket indikerer en lineær stigning i proliferation med stigende eksponeringstider til CCL21 (alle p 0,01).

A549 (A) og H460 (B) celler blev behandlet med CCL21 (50, 100 eller 200 ng /ml) i 24, 48 eller 72 timer, og celle vitalitet blev estimeret under anvendelse af CCK-8 assay. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. ** P. 0,01, sammenlignet med celler behandlet med CCL21 (50 ng /mL)

A549 (A) og H460 (B) celler blev behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 , 48, eller 72 timer, og celle vitalitet blev estimeret under anvendelse af CCK-8 assay. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. ** P. 0,01 sammenlignet med kontrol celler

CCL21 /CCR7 øger andelen af ​​celler i G

2 /M. For at kontrollere, om virkningen af ​​CCL21 /CCR7 om spredning af A549 og H460 celler er forbundet med en ændring i cellecyklus distribution, blev cellecyklus analyse udført ved anvendelse af flowcytometri. Den CCL21 /CCR7 interaktion væsentligt forbedret andelen af ​​celler i G

2 /M fase, mens der ikke var nogen signifikant effekt af denne interaktion på andelen af ​​celler i G

0 /G

1 eller S-fase, sammenlignet med kontrolceller (tabel 1). siCCR7 betydeligt afskaffet denne effekt af CCL21, mens siCCR7 alene havde ingen signifikant effekt på cellecyklus distribution.

CCL21 /CCR7 opregulerer ekspression af cyklin A, cyklin B1, og CDK1. For at bestemme den mulige mekanisme, ved hvilken CCL21 /CCR7 påvirker G

2 /M fasefordeling i A549 og H460 celler, ekspressionen af ​​cycliner og cyclin-afhængig kinase 1 (CDK1) blev vurderet ved anvendelse af Western blot og real-time PCR . Sammenlignet med kontrolceller, den CCL21 /CCR7 interaktion opreguleres signifikant proteinet og mRNA-niveauer af cyclin A, cyclin B1, og CDK1, som er relateret til G

2 /M-fase progression (Figur 4). siCCR7 betydeligt ophævede virkningerne af CCL21, mens siCCR7 alene havde ingen signifikant effekt på cyklin eller CDK1 udtryk. CCL21 havde ingen signifikant effekt på niveauerne af cyclin D1 eller cyklin E, som er relateret til G

0 /G

1 og G

1 /S overgang.

A549 (A ) og H460 (b) celler blev behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer, og proteinet (a) og mRNA (b) niveauer af cycliner a, B1, D1 og E og CDK1 blev anslået under anvendelse af Western blot (a) og real-time PCR (b). Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05 eller ** p. 0,01 sammenlignet med kontrol celler

CCL21 /CCR7 opregulerer ekspression af P-ERK, men ikke P-Akt. Andre har rapporteret, at CCR7 kan øge phosphorylering af ERK, JNK eller Akt, der er relateret til celle overlevelse [16] – [20], [33], [35] – [42]. For at kontrollere, om CCL21 /CCR7 interaktion også kan øge ekspressionen af ​​MAPK familiemedlemmer og Akt i A549 og H460 celler, blev ekspressionen af ​​disse komponenter vurderet ved hjælp af Western blot. Den CCL21 /CCR7 interaktion opreguleres signifikant udtryk for P-ERK på 24 timer og 48 timer, mens der ikke var nogen væsentlig indflydelse på ekspressionen af ​​ERK (figur 5). CCL21 /CCR7 havde ingen signifikant indflydelse på udtryk eller fosforylering af JNK, p38, eller Akt. Fordi Akt er muligvis opstrøms for ERK [43], A549 og H460-celler blev behandlet med CCL21 i 24 timer efter en 1-h udsættelse for LY294002, en selektiv inhibitor af PI3K, som inhiberer aktiveringen af ​​den nedstrøms Akt pathway. Efter denne behandling CCL21 /CCR7 stadig betydeligt opreguleres ekspressionen af ​​P-ERK (figur 6).

A549 (A) og H460 (B) celler blev behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 12, 24, eller 48 timer, og normale og phosphorylerede (P-) ekspressionsniveauer blev estimeret ved Western blot. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05 eller ** p. 0,01, sammenlignet med kontrolceller

A549 (A) og H460 (B) celler blev behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer efter LY294002 , en selektiv inhibitor af PI3K, som følgelig forhindrer aktivering af nedstrøms Akt, blev påført i 1 time. Ekspressionen af ​​P-ERK blev estimeret ved anvendelse af Western-blot. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. ** P. 0,01 sammenlignet med kontrol celler

hæmning af P-ERK afskaffer de impellent virkninger af CCL21 /CCR7 om spredning og G

2 /M fase progression. For at kontrollere, om PD98059, en selektiv inhibitor af MEK, der forstyrrer aktivering af downstream ERK, kan ophæve virkningerne af CCL21 /CCR7 om spredning og G

2 /M fase progression af A549 og H460 celler, cellernes levedygtighed og cellecyklusfordeling assays blev udført under anvendelse af CCK-8 og flowcytometri hhv. PD98059 betydeligt ophævede virkningerne af CCL21 /CCR7 om celledeling og G

2 /M fase progression (figur 7 og tabel 2, henholdsvis). PD98059 afskaffet også indflydelse af CCL21 /CCR7 på ekspressionen af ​​P-ERK, cyclin A, cyclin B1, og CDK1 (figur 8). Desuden PD98059 alene havde en signifikant inhiberende virkning på celleproliferation, G

2 /M-fase progression og ekspressionen af ​​P-ERK, cyclin A, og cyclin B1 (figur 7, tabel 2, og figur 8, henholdsvis).

A549 (a) og H460 (B) celler blev behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24, 48, eller 72 timer efter PD98059, en selektiv inhibitor af MEK som afbryder aktiveringen af ​​nedstrøms ERK, blev anvendt i 1 time. Celle vitalitet blev estimeret under anvendelse af CCK-8 assay. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05 eller ** p. 0,01, sammenlignet med kontrolceller

A549 (A) og H460 (B) celler blev behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer efter PD98059 , en selektiv inhibitor af MEK, der forstyrrer aktivering af downstream ERK, blev anvendt i 1 time. Ekspressionsniveauerne for disse komponenter blev estimeret ved anvendelse af Western blot. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05 eller ** p. 0,01 sammenlignet med kontrol celler

P-ERK, fremkaldt af CCL21 /CCR7, interagerer med cyklin A, cyklin B1, og CDK1. For yderligere at identificere, om der er et samspil mellem P-ERK og cyklin A, cyklin B1, eller CDK1 blev co-immunpræcipitationseksperimenter udført. A549 og H460 celler i fravær eller nærvær af CCL21 i 24 timer blev udsat for immunfældning med antistoffer mod P-ERK eller IgG, efterfulgt af Western blotting for cyclin A, cyclin B1, og CDK1. En udtalt, specifik interaktion mellem P-ERK og cyclin A, cyclin B1, eller CDK1 blev observeret, især når cellerne blev behandlet med CCL21 i 24 timer (figur 9A). Gensidig immunfældning med antistoffer mod cyclin A, cyclin B1, CDK1, eller IgG blev bedømt ved Western blotting for P-ERK, og igen, samspillet mellem P-ERK og cyclin A, cyclin B1, eller CDK1 var fremtrædende, specielt i nærvær af CCL21 (figur 9b). A549 og H460 celler i fravær eller nærvær af PD98059 i 1 time blev underkastet immunpræcipitation med antistoffer mod P-ERK eller IgG, efterfulgt af Western blotting for cyclin A, cyclin B1, og CDK1. Samspillet mellem P-ERK og cyklin A, cyklin B1, eller CDK1 blev svækket reaktion på PD98059 eksponering (figur 9c).

A549 (A) og H460 (B) celler i fravær eller tilstedeværelse af CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer blev udsat for immunfældning med antistoffer mod P-ERK eller IgG, efterfulgt af Western blotting for cyclin a, cyclin B1, og CDK1 (a). Gensidig immunfældning med antistoffer mod cyclin A, cyclin B1, CDK1, eller IgG blev analyseret ved Western blotting for P-ERK (b). A549 og H460 celler i fravær eller nærvær af PD98059 i 1 time blev underkastet immunpræcipitation med P-ERK eller IgG-antistoffer efterfulgt af Western blotting for cyclin A, cyclin B1, og CDK1 (c).

Discussion

Flere undersøgelser har dokumenteret, at aktiveringen af ​​CCR7 er ansvarlig for at mediere overlevelse af visse cancercellelinier ved at fremme migration og proliferation eller ved at inhibere apoptose [33], [35] – [42]. Imidlertid rolle CCR7 i proliferationen af ​​humane NSCLC-celler ikke er blevet veldokumenteret. I den foreliggende undersøgelse, bekræftede vi, at CCL21 /CCR7 interaktion øger markant human NSCLC celleproliferation i en tidsafhængig måde, involverer opregulering af cyclin A, cyclin B1, og CDK1, eventuelt via ERK, men ikke den Akt, sti.

i overensstemmelse med tidligere undersøgelser ved hjælp af forskellige celle-modeller [16], [37], [40], aktivering af CCR7 med CCL21 forfremmet celleproliferation. I modsætning til vores nuværende resultater, en forudgående undersøgelse foreslået, at murine CCL21 havde ingen signifikant virkning på spredning af A549 celler [44]. En mulig forklaring på uoverensstemmelsen vil være, at musen CCL21 kan interagere med CXCR3 men ikke CCR7, hvorimod menneskelig CCL21 kan binde CCR7 men ikke CXCR3 [45]. Dette antyder, at aktivering af CXCR3 ikke påvirker proliferation af A549-celler

Traditionelt er cellecyklussen adskilt i fire faser:. DNA-replikation forekommer under S-fasen, og kromosom segregering forekommer under M-fasen. S- og M-faser er adskilt af de såkaldte gap faser, G1 (før DNA-replikation) og G2 (før mitose). Vi viste, at CCL21 /CCR7 væsentligt ændret cellecyklusfordeling således at flere celler befolkede G

2 /M-fasen. Ingen signifikante forskelle blev observeret vedrørende fordelingen af ​​celler i G

0 /G

1 og S faser.

cellecyklus reguleres af cycliner og CDK’er. D-type cycliner betragtes som vigtige regulatorer af G

1 progression [46]. Cyclin E er nødvendig for G

1 /S overgang [47], [48] og cyclin A er afgørende for progression gennem S-fasen [49], [50]. Både cyclin A og B-type cycliner forbinder med CDK1 at fremme indrejse i mitose [51], [52]. I denne undersøgelse blev både protein og mRNA-niveauer af cyclin A, cyclin B1, og CDK1 signifikant opreguleret når celler blev behandlet med CCL21 i 24 timer. Dette indikerer, at CCL21 /CCR7 accelererer G

2 /M fase progression til fremme celleproliferation. Ingen signifikante forskelle i cyclin D1 eller cyklin E-ekspressionsniveauer blev målt, hvilket indikerer, at CCL21 /CCR7 har ingen væsentlig effekt på G

0 /G

1 fase eller G

1 /S overgang. Dette fund viser for første gang, at CCL21 /CCR7 har en impellent effekt på cellecyklusprogression involverer G

2 /M-fasen.

Flere undersøgelser ved hjælp af andre celletyper har vist, at aktivering af CCR7 er forbundet med forbedret overlevelse celle via øget phosphorylering af ERK, JNK eller Akt [16] – [20], [33], [35] – [42]. Vi undersøgte, om CCL21 /CCR7 kan forøge ekspressionen af ​​MAPK komponenter og Akt i A549 og H460 celler. Vores resultater antydede, at CCL21 /CCR7 forøgede phosphorylering af ERK men ikke JNK, p38, eller Akt. Disse resultater er i modstrid med tidligere publicerede rapporter, der foreslog en befordrende effekt af CCR7 på Akt, men ikke Erk, sti [16], [19]. En separat undersøgelse viste, at Akt er muligvis opstrøms af ERK [43]. Vi fandt, at CCL21 /CCR7 kunne stadig betydeligt opregulere ekspressionen af ​​P-ERK efter at cellerne blev behandlet med LY294002 i 1 time. Fordi LY294002 hæmmer selektivt PI3K at forhindre nedstrøms aktivering af Akt, vores resultater tyder på, at Akt ikke spiller en afgørende rolle i samspillet mellem CCL21 /CCR7 og ERK. Dette er i konkordans med en tidligere rapport [53]. Årsagen til disse forskelle er fortsat uklar.

Da CCL21 /CCR7 var i stand til at øge ekspressionen af ​​P-ERK, vi søgte at afgøre, om der er et samspil mellem P-ERK og cyklin A, cyklin B1, eller CDK1. Co-immunpræcipitationseksperimenter og gensidige immunopræcipitationsforsøg resultater kraftigt antydet en vekselvirkning mellem P-ERK og cyklin A, cyklin B1, eller CDK1, især ved tilstedeværelse af CCL21. Dette samspil kan blive svækket ved at hæmme ERK med PD98059. Desuden PD98059 afskaffet virkningen af ​​CCL21 /CCR7 på A549 og H460 celleproliferation og G

2 /M-fase progression, samt nedregulering af ekspressionen af ​​P-ERK, cyclin A, cyclin B1, og CDK1. Disse resultater viser, at virkningen af ​​CCL21 /CCR7 på celleproliferation og opregulering af cyclin A, cyclin B1, og CDK1 kan forekomme via ERK-vejen i humane NSCLC-celler.

Denne undersøgelse antyder, at aktivering af CCR7 med CCL21 kan væsentligt fremme proliferation af NSCLC-celler i en tidsafhængig måde involverer cyclin a, cyclin B1, og CDK1, eventuelt via ERK, men ikke den Akt, pathway. Denne information kan bidrage til at afklare de mekanismer i kræft celle overlevelse og identificere potentielle mål for behandling af NSCLC.

Materialer og metoder

Cell kultur og reagenser

A549 og H460-cellelinjer fra vores tidligere offentliggjorte dokument [32] blev dyrket i RPMI-1640 eller DMEM-F12 suppleret med 10% HyClone føtalt bovint serum (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, USA) i en atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C. Celler blev dyrket i 75 cm

2 dyrkningskolber og høstes i en opløsning af trypsin-EDTA ved den logaritmiske vækstfase.

cyclin A, cyclin B1, cyclin D1, cyclin E, CDK1, P-ERK , ERK, P-JNK, JNK, P-p38, p38, P-Akt, Akt, IgG, og p-actin mus eller kanin monoklonale antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Rekombinant human CCL21 blev indkøbt fra Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, USA). siCCR7 og Lipofectamine 2000, blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Celletælling Kit-8 (CCK-8) blev indkøbt fra Dojindo Laboratories (Beijing, Kina). PD98059 og LY294002 blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO, USA) og anvendt ved 50 uM eller 100 uM (slutkoncentrationer), henholdsvis i overensstemmelse med tidligere rapporter [40], [54]. Protein A /G-perler blev opnået fra Beyotime (Haimen, Kina).

siRNA behandling af celler

A549 og H460-celler blev udpladet på 6 cm

2 celle dyrkningsskåle og dyrket til 30-50% konfluens før transfektion med Lipofectamine 2000 som tidligere beskrevet [55]. Transfektionseffektiviteten blev bedømt ved flowcytometri. Virkningsgrader siCCR7 og ikke-dæmpende kontrol siRNA blev testet ved anvendelse af Western blot og RT-PCR. Sekvenserne af siCCR7 og kontrol siRNA var: CCR7, 5′-GCGUCAACCCUUUCUUGUATT-3 ‘og 3′-UACAAGAAAGGGUUGACGCAG-5′; kontrol, 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘og 3′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5’.

Cell proliferation assay

Celleproliferative aktiviteter blev undersøgt ved hjælp af CCK-8. A549 og H460 celler podedes på plader med 96 brønde (1000 celler /brønd) og behandlet med CCL21 i 0, 24, 48, eller 72 timer. Efter behandling blev CCK-8 tilsættes til hver brønd i overensstemmelse med producentens anvisninger og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. Den optiske densitet (OD) værdi af hver brønd blev målt med en mikropladelæser (Spectra Thermo, Männedorf, Schweiz) med en test bølgelængde på 450 nm.

Cell cyklus analyse

Efter behandling med CCL21 i 24 timer blev cellerne høstet og vasket to gange med kold phosphatpufret saltopløsning (PBS) og fikseret i 75% ethanol i 2 timer ved 4 ° C. De fikserede celler blev vasket to gange med 500 pi kold PBS. Celler blev derefter farvet med 500 pi propidiumiodid (PI) farveopløsning (50 ug /ml PI, 0,1% Triton X-100, 200 ug /ml DNase-fri RNase i PBS) i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Ti tusind hændelser per prøve blev erhvervet under anvendelse af en FACS-scanning flowcytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), og procentdelen af ​​celler i G

0 /G

1, S og G

2 /M-faser af cellecyklus blev bestemt under anvendelse Modfit LT 3.0 (Becton-Dickinson).

Western blot-analyse

efter behandling med CCL21 i 24 timer blev celler ekstraheret med lysis puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 2 ug /ml aprotinin og 1 mM PMSF) i 30 minutter ved 4 ° C. Ekstrakter blev centrifugeret ved 12.000 x

g

i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanter indeholdende totalt protein derefter høstet. Portioner, hver indeholdende 50 ug protein, blev adskilt ved 10% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner ved 55 V (cyclin A, cyclin B1, P-Akt, Akt) eller 40 V (de andre) i 2,5 timer ved lav temperatur . Membranerne blev blokeret i 5% skummetmælk i 2 timer, og proteiner blev påvist under anvendelse af monoklonale antistoffer ved 1:1000 (P-JNK, JNK, P-p38, p38 og β-actin) eller 1:200 (de andre) fortynding natten over ved 4 ° C. Proteiner blev visualiseret under anvendelse af anti-muse eller anti-kanin-IgG konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP) ved 1:6000 eller 1:8000 fortynding i 2 timer ved stuetemperatur, henholdsvis. Bånd blev afbildet med en EC3 Imaging System (UVP LLC, Upland, CA, USA), og OD blev målt ved anvendelse ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). OD Forskellen mellem testede proteiner og β-actin af den samme prøve blev beregnet som relative indhold og udtrykt grafisk.

RT-PCR og real-time PCR

Totalt RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af TRIzol (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. p-actin blev anvendt som en intern kontrol. For at bestemme effektiviteten af ​​siCCR7 og kontrol siRNA, var semi-kvantitativ RT-PCR udført på en G-STORM termiske cycler (GRI Ltd, Byfleet, UK) ved hjælp af TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (Takara, Dalian, Kina). PCR-primere var som følger: CCR7 F: 5′-GAGGCTATTGTCCCCTAAACC-3 ‘, R: 5′-TGGAGGACAGTGAAGAAAACG-3’. Den CCR7 amplicon længde var 305 bp. β-actin F: 5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3 ‘, R: 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’. Den β-actin amplicon længde var 513 bp. De varme cykling var som følger: 30 cykler af 40 s hver, herunder denaturering ved 95 ° C, annealing ved 53 ° C og forlængelse ved 72 ° C

Real-time PCR blev udført på en ABI. Prism 7900HT Hurtig System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) under anvendelse SYBR Premix Ex Taq II (Takara). Amplifikationer blev udført i et totalt volumen på 20 pi og cykluser 40 gange efter den første denaturering (95 ° C i 30 s) med følgende parametre: 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 s. β-actin F: 5′-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3 ‘, R: 5′-ACATGCCGGAGCCGTTGT-3’. Den β-actin amplicon længde var 107 bp. Andre primersekvenser er blevet offentliggjort i en anden undersøgelse [56]. Pålideligheden af ​​PCR-resultater blev understøttet ved at analysere dissociationskurven. Real-time PCR-data blev beregnet ved anvendelse af 2

-ΔΔCT metode på SDS 2.4 softwarepakke (Applied Biosystems) [57].

co-immunpræcipitationseksperimenter

Efter behandling med CCL21 i 24 timer blev celler ekstraheret med lysispuffer (10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 10 mM HEPES [pH 7,9], 1 mM PMSF, 1 mM DTT) og homogeniseres i 30 minutter ved 4 ° C. Ekstrakterne blev centrifugeret ved 12.000 x

g

i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatanterne indeholdende totalt protein blev høstet. Lige store mængder protein blev udsat for antistoffer mod P-ERK, IgG, cyclin A, cyclin B1, eller CDK1, som blev immobiliseret på protein A /G-perler. Efter 3 timers inkubation ved 4 ° C under forsigtig rotation, blev perlerne vasket grundigt fem gange med lyseringsbuffer, kogt, og mikrocentrifugeret. Proteiner blev påvist med antistoffer mod P-ERK, cyclin A, cyclin B1, eller CDK1 ved Western blot.

Statistisk analyse

Data blev analyseret under anvendelse af SPSS 16.0 software. Envejs variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til at vurdere forskellene mellem grupper med forskellige behandlinger, og den mindste signifikante forskel (LSD) -test eller Dunnett T3 test blev anvendt til post hoc analyse. Polynomial kontrast blev brugt til trendanalyse. Alle data er præsenteret som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. Resultater blev betragtet som statistisk signifikant for p 0,05. N-fold værdier for genekspression skifte op til 0,5 og under 2 blev taget som ikke er væsentlige i overensstemmelse med værdierne opnået fra negative kontroldyr gener [57], [58].