PLoS ONE: Effekter af Blood Collection Betingelser for kræft i æggestokkene Serum Markers

Abstrakt

Baggrund

Evaluering diagnostiske og tidlig påvisning biomarkører kræver sammenligne serum proteinkoncentrationer blandt biosamples konstateret fra personer med og uden kræft . Indsatsen er generelt lavet til at standardisere blod forarbejdning og opbevaringsbetingelser for sager og kontroller, men betingelser blodprøve indsamling kan ikke fuldstændig kontrolleret. For eksempel er blodprøver fra sager ofte opnået fra personer opmærksomme på deres diagnoser, og opsamlet efter faste eller kirurgi, mens der kan fås blodprøver fra nogle kontroller i forskellige forhold, såsom en klinik besøg. Ved at måle effekten af ​​forskelle i indsamling forhold på tre forskellige markører, vi undersøgte potentialet af disse virkninger til skævhed valideringsundersøgelser.

Metode og Princip Resultater

Vi analyserede serumkoncentrationer af tre tidligere undersøgte formodede æggestokkene kræft serum biomarkører-CA 125, prolaktin og MIF-hos raske kvinder, kvinder med kræft i æggestokkene gennemgår gynækologisk kirurgi, kvinder, der gennemgår operation for godartet æggestok patologi, og kvinder, der gennemgår kirurgi med patologisk normale æggestokke. For kvinder, der gennemgår kirurgi, blev en blodprøve indsamles enten i klinikken 1 til 39 dage før indgrebet, eller på operationsdagen efter anæstesi blev administreret, men før den kirurgiske procedure, eller begge dele. Vi fandt, at en markør, prolactin, blev dramatisk påvirket af indsamling betingelser, mens CA 125 og MIF var upåvirket. Prolaktinniveauet var ikke forskellig mellem case og kontrolgrupper efter tegner sig for betingelserne for prøvetagning, tyder på, at prøve konstatering kan forklare nogle af eller alle de tidligere rapporterede resultater om sit potentiale som biomarkør for kræft i æggestokkene.

Konklusioner

Biomarker valideringsundersøgelser bør anvende standardiserede betingelser indsamling, bruge flere kontrolgrupper, og /eller indsamle prøver fra de tilfælde, forud for påvirkning af diagnose når det er muligt at spore og korrigere for potentielle bias forbundet med prøvetagning.

Henvisning: Thorpe JD, Duan X, Forrest R, Lowe K, Brown L, Segal E, et al. (2007) Virkninger af Blood Collection Betingelser for kræft i æggestokkene Serum Markers. PLoS ONE 2 (12): e1281. doi: 10,1371 /journal.pone.0001281

Academic Redaktør: Alice Rumbold, Menzies School of Health Research, Australien

Modtaget: Oktober 17, 2007; Accepteret: November 9, 2007; Udgivet: December 5, 2007

Copyright: © 2007 Thorpe et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Vi er taknemmelig for generøs støtte fra Pacific æggestokkene Cancer Research Consortium (POCRC) /SPORE i kræft i æggestokkene (P50 CA83636, NU), Department of Defense /CDMRP (DAMD17-02-1-0691, NU), og de Kanariske Foundation.

Konkurrerende interesser: Elliot Segal er præsident og CEO for Onco detektorer International LLC, der fremstiller MIF ELISA-assay anvendes i denne undersøgelse. Der findes ingen andre konkurrerende interesser.

Introduktion

Vi hypotesen, at selv med identisk prøve behandling og opbevaring protokoller miljøet og betingelserne for prøvetagning kan påvirke niveauet af biomarkører, og at disse potentielle bias bør forventes i biomarkør valideringsundersøgelse design. Konkret miljøet omkring diagnose og indsamling af prøver fra tilfælde, såsom kirurgisk forberedelse, kan påvirke blodets kemi på en måde, introducerer systematiske ændringer, der kan være fejlagtigt tilskrives sygdomstilstanden. Vi demonstrerer disse effekter ved at vurdere betingelserne for blodtapning i en etableret og to nye æggestokkræft serum markører: CA 125, prolaktin, og makrofag Migration faktor (MIF). Vi viser, at CA 125 og MIF opføre sig som tidligere rapporteret, men at prolactin præstation er stærkt påvirket af bias i prøve konstatering.

Cancer tidlig påvisning biomarkør valideringsundersøgelser er designet til at bestemme, hvilke proteiner kan skelne mellem raske og personer med kræft. Derimod kan et diagnostisk markør til hensigt at skelne mellem mennesker med kræft og dem med benigne tilstande. Til potentielt dødeligheden af ​​kræft effekt en markør skal vise unormale niveauer i blodet af sager i forhold til deres passende kontroller, og til afsløring formål tidlige de skal ophøje tidligt nok i sygdomsforløbet at identificere sygdommen på et tidligt og mere behandles tilstand [1] . Evaluering et protein i prækliniske prøver indsamlet godt før mistanke eller diagnose af kræft ville være ideelt for afsløring studier tidlige, mens prøver opnået ved klinisk præsentation af sygdom er mest relevante for diagnostiske markører. Men fordi præ-kliniske prøver er sjældent tilgængelige, især for sjældne sygdomme, første fase tidlig påvisning valideringsundersøgelser ofte søger at afgøre, hvorvidt en markør kan skelne personer med symptomatisk sygdom fra raske kontroller forud for yderligere investeringer [2].

den primære hensigt med vores biomarkør validering undersøgelse er at fastslå, i hvilket omfang klassificering udførelsen af ​​en biomarkør kan henføres til sygdom forbundet reaktion snarere end at konstateringen skævheder i prøvetagning. Det er almindeligt at konstruere case og kontrolgrupper, der er matchet på prøve indsamling protokoller, opbevaring varighed, emne alder og andre epidemiologiske oplysninger, for at reducere potentielle bias relateret til disse faktorer. er der lagt mindre vægt på at bruge flere kilder til kontrol- eller case grupper for at afsløre potentielle bias eller på ved hjælp af procedurer, der kan justere for skævheder, såsom betingelser for prøvetagning. I dette manuskript demonstrerer vi den potentielle værdi i at udføre biomarkør valideringsundersøgelser ved hjælp af flere kilder til godt kommenterede case og kontrolgrupper. Vi viser, at prolactin er meget følsom over for betingelserne for indsamling: efter justering for betingelserne for indsamling markøren er ikke længere betragtes som en levedygtig kandidat. CA 125 og MIF er vist ikke være meget modtagelige for disse betingelser.

Vi valgte tre markører-CA 125, prolaktin og MIF-at evaluere i et stærkt kommenteret sæt af case og kontrol prøver.

CA 125 er en mucin-lignende glycoprotein, som har vist sig at være forhøjet i de fleste kvinder med OC sammenlignet med en sund befolkning [3]. CA 125 er også blevet evalueret i prækliniske serumprøver, og hver undersøgelse tyder på, at CA 125 er en prædiktiv markør, der bliver mere og mere kraftfuld med nærhed til diagnose [4] – [6]. Imidlertid er CA 125 også forhøjet i flere benigne tilstande og kan også være en markør for inflammation [7]. På grund af utilstrækkelig følsomhed og specificitet, er CA125 ikke anvendes klinisk som et stand alone screeningtest. Falling CA 125 niveauer efter behandling er anvendt til at bekræfte reaktion på specifikke behandlinger [8] og opløftende CA 125 niveauer signal gentagelse [9]. CA 125 er en ligand af Mesothelin [10], som kan spille en rolle i metastasen af ​​OC til peritoneum [11].

MIF er et proinflammatorisk cytokin, der er blevet identificeret som en kandidat tidlig påvisning markør for OC [12], selv om analyse af dets præstationer som biomarkør for tidligt ovariecancer foreslog, at det ikke udviser højere følsomhed eller specificitet end CA 125 [13]. Inhibering af den anti-inflammatoriske egenskaber af glucocorticoider er en vigtig virkning af MIF [14], [15]. MIF kan også mediere nogle af de stimulerende virkninger af inflammation på cancer progression. Bevis for MIF rolle i reguleringen af ​​tumor-suppressor gener såsom p53 [16], [17] og angiogenese [18], [19] peger på en potentiel sammenhæng mellem kronisk inflammation og udvikling af kræft.

Prolaktin er blevet identificeret som en kandidat tidlig påvisning markør for kræft i æggestokkene med rapporter om imponerende høj følsomhed ( 90%) og specificitet ( 98%) [12]. Forhøjede niveauer af cirkulerende prolactin (hyperprolaktinæmi) har længe været forbundet med hypofysetumorer [20], men mere nylig prolactin er blevet rapporteret i forbindelse med en række yderligere cancerformer, såsom bryst- [21] – [23], prostata [24], og colon carcinom [25].

Metoder

Undersøgelse befolkning og serum prøvetagning

Serumprøver blev indsamlet af Pacific æggestokkene Cancer Research Consortium til brug i biomarkør validering eksperimenter. Prøverne anvendt i denne undersøgelse blev indsamlet ved Swedish Medical Center eller Virginia Mason Hospital (Seattle, WA, USA) mellem den 1. juli, 2004 og 30. juni blev der 2006. Deltagere rekrutteret fra følgende populationer: tilsyneladende raske kvinder deltager regelmæssig screening for brystkræft eksamener (sunde kontroller), kvinder der gennemgår gynækologisk kirurgi for en række betingelser, men med normal ovarie patologi (kirurgiske kontroller), kvinder uden malignitet, men med godartet ovariesyndrom (godartede kontroller), og kvinder diagnosticeret med kræft i æggestokkene, æggeleder kræft, eller primær peritoneal invasiv cancer. Identiske prøvebehandling protokoller blev anvendt for alle grupper.

En prøve af fag fra hver af disse betingelser blev udvalgt til biomarkør valideringsundersøgelser. Patienter med forudgående ooforektomi eller diagnose af kræft i æggestokkene blev udelukket fra undersøgelsen befolkning. Tilfælde omfattede 50 konsekutivt rekrutterede patienter med ovariecancer (n = 45), æggeleder (n = 1), og peritoneal cancer (n = 4). Kontrolgrupperne omfattede raske kontroller (n = 36), kirurgiske kontroller (n = 14), og benigne kontroller (n = 30). Valideringen Undersøgelsen blev drevet til at detektere en markør med 30% sensitivitet på 95% specificitet, eller bedre. Demografi patienterne i denne undersøgelse er beskrevet i supplerende tabeller S1 og S2.

De sunde, kirurgiske og godartede kontrol anvendt i denne undersøgelse blev udvalgt fra større kontrol populationer (n = 346, 63, og 38 henholdsvis ) til at matche de sager om alder, race, familie historie æggestokkene og brystkræft [26], og blodprøvetagning dato. Vi brugte tilbøjelighed score matching til at balancere den overordnede fordeling af grupperne [27]. Kort fortalt blev en tilbøjelighed score estimeret ved at forudsige tilfælde status ved hjælp af logistisk regression på hver af de variabler af interesse. Efter først at vælge case gruppe blev individuelle kontroller udvalgt, der bedst matchede et tilfældigt identificeret medlem af sagen gruppe på den tildelte tilbøjelighed score indtil præ-specificerede tal for hver kontrolgruppen var blevet udvalgt.

Deltagere i kirurgisk kontrol, godartet kontrol- og case populationer doneret serumprøver enten til en på forhånd kirurgisk aftale 1 til 39 dage før kirurgi eller på operationsdagen efter administrering af anæstesi, men før kirurgisk behandling eller kemoterapi. For at maksimere magt til at detektere forskelle i markør niveauer på grund af betingelserne for indsamling, vi medtaget prøver indsamlet både på dagen for kirurgi og i pre-kirurgiske ansættelse fra den samme patient (n = 30), når det er muligt. Deltagere i den sunde kontrol befolkning donorblod på en regelmæssig mammografiscreening udnævnelsen.

Laboratorium metoder

prolaktin og MIF Analyser.

Serum niveauer af prolaktin og MIF blev målt ved ELISA hjælp kits erhvervet fra Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX) og Onco Detektorer International LLC (Bethesda, MD) hhv. Assays blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger. Koncentrationerne af menneskelig prolactin og MIF blev bestemt ved hjælp af en lineær standardkurve, der blev bygget ved at plotte den gennemsnitlige absorbans mod den kendte koncentration for hver referencestandard. Se tekst S1 for detaljer.

CA 125-analysen.

Serum niveauer af CA 125 blev målt ved perle-baserede immunanalyser som tidligere beskrevet [28] ved hjælp af anti-CA 125 mus monoklonalt antistoffer × 306 (capture) og × 52 (påvisning) erhvervet fra Research Diagnostics, Inc. (RDI, Flandern, NJ). Oplæsning fra immunoassay blev normaliseret og derefter z-scores blev beregnet ved centrering og skalering bemærkninger, så raske kontrolpersoner har middelværdi 0 og varians 1. Se Tekst S1 for detaljer.

Prøver blev randomiseret på to plader med 80 prøver hver, og laboratoriepersonale blev blindet til sag status på alle tidspunkter.

Statistisk analyse

Receiver Operating kurver (ROC) blev anvendt til at bestemme, om serum markør koncentrationer diskriminerede mellem tilfælde og raske kontrolpersoner [29 ]. Arealet under hver ROC-kurven (AUC) blev beregnet og betydning for markør diskrimination (AUC forskellig fra 0,5) blev bestemt ved anvendelse af Mann-Whittney U statistik. ROC-kurver for sund kontrolprøver og case udtaget enten før kirurgi eller på operationsdagen for hver markør blev sammenlignet ved hjælp af metoden beskrevet af Metz et al [30].

For at vurdere, om markør niveauer afveg mellem case og kontrolgrupper efter justering for betingelser for blodtapning, vi monteret flere lineære regressionsmodeller til hver markør som den afhængige variabel med indikator variabler for hver sag /kontrol befolkning og en indikator variabel for betingelser for blodprøvetagning (klinik besøg eller i kirurgi ) som uafhængige variable. Den regressionsmodel for

jeg

th kvinde på tid

t

var:

Referencegruppen i hver model er den raske kontrolgruppe. Denne model kan potentielt adskille komponenterne i varians skyldes betingelser for prøvetagning og tilstedeværelsen af ​​malignitet. Især for markører, der løfter på grund af tilstedeværelsen af ​​kræft i æggestokkene og også berørt af betingelserne for blodtapning, hver effekt kan estimeres ud fra modellens parametre. Regressioner blev udført ved hjælp af Generaliseret Estimering ligningerne (GEE) metoder til at undgå bias i estimater af standardfejl fordi markør niveauer blev målt to gange for 30 kvinder i undersøgelsen.

P-værdier for forskelle mellem delvist korrelerede ROC kurver blev beregnet med ROCKIT softwarepakken [31] ved hjælp af den bivariate test. Alle andre beregninger blev udført ved hjælp af sproget R statistisk programmering [32].

Resultater

Marker niveauer fra hvert tilfælde /kontrolgruppe indsamlet i kirurgi og i pre-kirurgiske klinik besøg er vist i Figur 1 og opsummeret i tabel 1. ROC-analyse viste, at CA 125 og MIF koncentrationer skelne mellem raske kontrolpersoner og sager indsamlet enten på kirurgi eller en til 39 dage før operationen (figur 2a, b; p 0,05 for hver markør og tilstand) . Desuden AUC var ikke signifikant forskellig mellem de to indsamling betingelser (figur 2a, b, p = 0,297 og 0,416 henholdsvis)

Stiplede linjer forbinde kirurgiske og pre-kirurgiske markør, der måles inden for de samme kvinder under begge. kirurgiske og ikke-kirurgiske tilstande

Case prøver blev opnået enten ved kirurgi (kirurgisk sammenligning, stiplet linie) eller 1 til 39 dage før operationen (præ-kirurgisk sammenligning, optrukket linie). Den præ-kirurgisk sammenligning viser, at prolactin niveauer ikke diskriminerer mellem kvinder med og uden kræft i indstillingen klinik. * Angiver AUC forskellig fra 0,5 ved alpha = 0,05 signifikansniveauet (Mann Whitney U test)

Prolaktinniveauer var stærkt forhøjet i sagen prøver indsamlet ved kirurgi (figur 1c) og prolaktinniveauet diskrimineret mellem case prøver indsamlet ved kirurgi og raske kontrolpersoner med høj følsomhed og specificitet (figur 2c, stiplet linje). Men denne forskel forsvandt, da vi sammenlignet case prøver indsamlet 1 til 39 dage før indgrebet til de raske kontroller (figur 2c, fast linje). AUC til at skelne mellem tilfælde og kontroller var signifikant lavere i prøver indsamlet på kort interval inden kirurgi end for prøverne opnået ved kirurgi (figur 2c, p

forskel i AUC 0,0005). Desuden gjorde serumprolaktinniveauer ikke diskriminere mellem raske kontrolpersoner og tilfælde prøver indsamlet 1 til 39 dage før indgrebet (figur 2c, line AUC solid = 0,497).

Vi brugte flere lineære regressionsmodeller at undersøge, om forskellene i markør niveauer blev forbundet med sagen status og /eller med betingelserne for blodprøvetagning. I regressionsmodeller blev CA 125 og MIF koncentrationer ikke væsentligt påvirket af betingelserne for blodtapning (tabel 2, p = 0,60 og 0,71 henholdsvis) og blev forhøjet i de tilfælde, i forhold til de raske kontroller (tabel 2, s 0,005 for hver markør). Prolaktinniveauet blev dog øget væsentligt i serumprøver indsamlet på kirurgi (tabel 2, s 0,005), og efter justering for betingelser for blodprøvetagning blev prolactin ikke forhøjet i tilfælde i forhold til raske kontrolpersoner (tabel 2, p = 0,69). Disse data tyder på, at de observerede med prolactin forskelle kan tilskrives udelukkende til blodprøvetagning betingelser, uden resterende signal forbundet med malignitet.

Diskussion

Tilgangen af ​​anvendelse af kommercielt tilgængelige assays til validere kandidat biomarkører er meget lovende. Resultaterne kan dog være misvisende, hvis betingelserne i blodprøven kollektion til sager og kontroller ikke er standardiseret eller på anden måde tegnede sig for. Vi viser her, at serumprolaktinniveauer er stærkt påvirket af betingelserne for blodtapning og at prolaktin ikke diskriminerer mellem kræft og ikke-kræftpatienter i serumprøver indsamlet på samme måde i en klinik indstilling. I modsætning hertil blev der CA 125 og MIF ikke påvirket af betingelserne for blodtapning; begge mærker diskrimineret mellem cases og kontroller, uanset om serumprøver blev indsamlet ved kirurgi eller i et kort interval før operation.

Dette fund er i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at prolaktinniveauet ophøje under operationen og postoperativt i kvindelige patienter, der gennemgår kirurgi med halothan (generelt) anæstesi [33]. Prolactin-niveauer er også forhøjet i rotter, der gennemgår generel anæstesi med pentobarbital, uanset kirurgi [34]. I vores undersøgelse blev prøver indsamlet på dagen for operationen opnået efter generel anæstesi blev administreret, men før eventuelle indsnit blev foretaget. Serum prolaktinniveauet på kirurgi kan have været påvirket af bedøvelse eller andre betingelser for kirurgi såsom stress [20].

I flere lineære regressionsmodeller, blev forskelle i CA125 og multilaterale interbankgebyrer i forbindelse med sagen status, men ikke ved betingelserne for prøven konstatering. For prolactin, det omvendte var tilfældet tyder på, at prolactin-niveauer påvirkes af betingelserne for kirurgi og kan ikke være en markør for ovariecancer. Disse multivariate analyser suppleret ROC-analyser ved at justere for betingelserne for blodtapning, hvilket giver mulighed for, at en markør signaler malignitet trods bliver påvirket af betingelserne for blodtapning. Regulering for indsamling forhold i analysen er nyttig mere generelt, når blodprøver under identiske betingelser er ikke tilgængelige fra hver deltager i en undersøgelse.

Brugen af ​​flere kilder til kontrol prøver indsamlet under forskellige betingelser kan advare forskere til potentielle bias. Vi har vist, at tillade indsamling betingelser for at variere i tilfælde og kontrol, men ved hjælp af korrekte anmærkninger kan advare forskere til potentielle problemer. Når det ikke er muligt at opnå flere samlinger fra tilfælde (både inden for og uden for kirurgi) anvendelsen af ​​kirurgiske kontroller kan bruges som en skærm til de mulige virkninger af indsamlingen tilstand. For eksempel kan det ses i figur 1 C Den prolaktinniveauet er højere i kontrolgrupperne, hvor prøver blev indsamlet ved kirurgi end hos raske kontroller, hvilket igen antyder, at forhøjede prolactinniveauer ikke kan være specifikke for malignitet.

begrænset tilgængelighed af præ-kliniske prøver fra patienter med ovariecancer præsenterer en stor udfordring for forskerne forsøger at opdage eller validere nye biomarkører til tidlig påvisning. De fleste prøver fra kræftpatienter, der er til rådighed for forskning, ikke indsamles fra kvinder eller læger som er blinde for deres forestående diagnose. Vores resultater viser, at fordomme mellem tilfælde og kontrol populationer kan føre til falske positive forsøgsresultater, og at kontrollere for betingelserne for blodtapning kan reducere falsk opdagelse og falsk validering i biomarkør eksperimenter. Det er vigtigt at opdage, og når det er muligt at korrigere for, skævheder i betingelserne for blodtapning, når de forsøger at opdage og validere nye biomarkører.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Oversigt over patientdemografi til sag status

doi: 10,1371 /journal.pone.0001281.s001

(0,03 MB DOC)

tabel S2.

Oversigt over ovariecancer ved scenen og histologi

doi: 10,1371 /journal.pone.0001281.s002

(0,03 MB DOC)

Text S1. Salg Detaljerede beskrivelser af Assay Procedurer

doi: 10,1371 /journal.pone.0001281.s003

(0,03 MB DOC)