PLoS ONE: Den rolle Podoplanin i biologi differentieret skjoldbruskkirtelkræft

Abstrakt

Podoplanin (PDPN), er en mucin-typen transmembrane glycoprotein specifikke for lymfesystemet udtrykt i forskellige humane kræftformer, og betragtes som en faktor fremmer tumor progression. Formålet med denne undersøgelse var at belyse den molekylære rolle PDPN i biologi skjoldbruskkirtlen cancerceller. PDPN udtryk blev evalueret i primære skjoldbruskkirtlen carcinomer og thyreoideakarcinom cellelinier ved RT-qPCR, Western blotting, IF og IHC. For at undersøge, hvilken rolle podoplanin i fastlæggelsen en celles maligne potentiale (cellulære migration, invasion, spredning, vedhæftning, motilitet, apoptose), blev en kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinje med tavshed PDPN udtryk brugt. Vi observerede, at PDPN udelukkende blev udtrykt i kræftcellerne på 40% af papillær skjoldbruskkirtlen karcinom (PTC) væv. Desuden

PDPN

mRNA og protein var stærkt udtrykt i PTC-afledte TPC1 og BcPAP cellelinjer, men blev ikke påvist i follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen afledte cellelinier.

PDPN

knock-down faldt betydeligt cellulære invasion, og beskedent reduceret cellemigration, mens spredning og vedhæftning ikke blev ramt. Vores resultater viser, at PDPN formidler invasive egenskaber af celler fra papillary skjoldbruskkirtlen karcinomer, tyder på, at podoplanin kunne fremme PTC progression

Henvisning: Rudzińska M, GAWEL D, Sikorska J, Karpińska KM, Kiedrowski M, Stępień T. et al. (2014) Den rolle Podoplanin i biologi differentieret skjoldbruskkirtelkræft. PLoS ONE 9 (5): e96541. doi: 10,1371 /journal.pone.0096541

Redaktør: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, Frankrig

Modtaget: Januar 24, 2014 Accepteret: April 9, 2014; Udgivet: 5 maj 2014

Copyright: © 2014 Rudzińska et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud 2012/07 /B /NZ5 /02.444 fra The National Science center, Polen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Differentieret skjoldbruskkirtlen karcinom (DTC) er den mest almindelige menneskelige endokrine malignitet. Papillært (PTC) og follikulært (FTC) thyreoidea carcinomer er to store DTC varianter, med den tidligere repræsenterer den mest almindelige type (80% af alle DTC tilfælde) [1]. Den molekylære patogenese af cancer i skjoldbruskkirtlen involverer flere molekylære signalveje fortrinsvis ændret i PTC og FTC. PTC’er bære onkogene punktmutationer i

B-RAF

RAS

, og kromosomale rearrangementer resulterer i

RET

og

trkA

kimære gener, som alle kan aktivere mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) pathway [2]. Aktivering

BRAF

V600E punktmutation vises i, i gennemsnit 45%, mens

RET /PTC

omrokeringer og

RAS

mutationer i 10-20% PTC tilfælde [3] [4,]. I FTCs, foruden

RAS

mutation,

PAX8 /PPARy

omlejring og deregulering af PI3K /ATK /PTEN (phosphatidylinositol-3-kinase /ATK /phosphatase og tensin homolog slettet på kromosom 10) signaleringskaskade ofte opdages, der er forbundet med progression og dedifferentiation gennem aktivering af PI3K og AKT og inaktivering eller tab af

PTEN

suppressor genekspression [5], [6]. Selvom PTC anses for at være en indolente læsion med god prognose, udvikling af lymfeknudemetastaser påvirker op til 50% af PTC patienterne og videreudvikling af fjerne metastaser i nogle diagnosticerede cancere reducerer overlevelsesrater [7], [8]. Et fælles træk ved tumor ekspansion er udbredelsen af ​​primære kræftceller, som kan forekomme

via

en række ruter. Klinisk-patologiske data har vist, at papillære carcinomer er tilbøjelige til at metastasere til regionale lymfeknuder, hvilket antyder, at celler spredes

via

lymfesystemet [9], [10]. De molekylære mekanismer og genetiske faktorer involveret i udbredelsen af ​​PTC celler, som bestemmer metastatiske potentiale papillær kræft i skjoldbruskkirtlen, stort set ukendte.

Metastase af kræftceller er en multi-trins proces og forskellige cellulære faktorer udtrykt i tumorer kan være involveret. Flere undersøgelser har fremhævet betydningen af ​​lymfangiogene faktorer i udviklingen af ​​forskellige tumorer og er blevet identificeret en række regulatoriske molekyler, der deltager i lymfangiogenese [11], [12], [13]. Et af de vigtigste lymfangiogene molekyler er podoplanin (PDPN). Human PDPN, også kendt som T1α -2, PA2.26, gp38 eller aggrus, er en 38-kDa type I mucin-lignende transmembrane sialoglycoprotein sammensat af et stærkt O-glycosyleret ekstracellulært domæne, en enkelt membranspændende region og en kort cytoplasmatisk tail [14]. I normale humane væv, er podoplanin udtrykt i nyre podocytterne, skeletmuskulatur, hjerte, placenta, lunge, og andre steder [15], [16], [17]. PDPN udtrykkes i lymfatiske endotelceller (LEC), men ikke i blod endotelceller (BEC), og repræsenterer således en specifik markør for lymfatisk endotel og lymfangiogenese [11]. På trods af den særlige sit udtryk i lymfatisk endotel har PDPN også blevet påvist i forskellige kræftformer [18], [19], [20]. Den biologiske funktion PDPN er ikke blevet fuldt ud defineret, men de foreliggende data tyder på, at det kan spille en vigtig rolle som formidler af tumor celle invasion [21]. Den detaljerede mekanisme bag udbredelsen af ​​differentierede skjoldbruskkirtel tumorceller og cancer progression, og især det bidrag pro-lymfangiogene molekyler til denne proces er dårligt forstået. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at karakterisere ekspressionen og funktionen af ​​podoplanin i skjoldbruskkirteltumorer biologi. PDPN ekspression blev undersøgt i primære tumorer og i et panel af kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer afledt papillær (TPC1 og BcPAP) og follikulært (FTC133 og CGTH-W-1) skjoldbruskkirtlen karcinomer. Vi undersøgte også den rolle PDPN i reguleringen kendetegnende for den maligne celle fænotype: spredning, vedhæftning, overlevelse rente motilitet, migration og invasion. For at bestemme funktionen af ​​dette transmembrane glycoprotein i den metastatiske adfærd papillary cancerceller, udførte vi RT-qPCR, immunfluorescens og immunhistokemi, samt Western-blot-analyser og undersøgt

PDPN

knock-down i dyrkede celler . De opnåede data antyder kraftigt, at PDPN kan betragtes som en pro-metastatisk faktor, der påvirker spredningen af ​​PTC.

Materialer og metoder

Etik Statement

Undersøgelsen blev godkendt af Etisk Udvalg of Human Studies ved Center for Postgraduate Medical Education. Vævsprøver blev opnået med tilladelse fra de respektive etiske komitéer (på Cancer Center og Institut for Onkologi ved Copernicus Memorial Hospital, og ved Center for Postgraduate Medical Education). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, der deltager i denne undersøgelse. Ingen industri gav støtte til denne undersøgelse.

Thyroid vævsprøver og cellelinier

For genekspression eksperimenter, friske frosne væv eksemplarer af papillær skjoldbruskkirtlen karcinom (T) og tilstødende normal skjoldbruskkirtel væv fra den kontralaterale lap (NT) blev indsamlet på Maria Skłodowska-Curie Memorial Cancer center og Institut for Onkologi, ved Institut for Almen og Endokrinologisk Kirurgi, Copernicus Memorial Hospital (Warszawa og Łódź, Polen). For immunhistokemisk (IHC) analyse, arkiveret formalinfikserede, paraffinindlejrede væv (forskellige fra dem, der anvendes i RT-qPCR) fra patienter, som havde gennemgået alt thyreoidektomi blev brugt

Den række af 173 arkiverede væv omfattede.: 112 papillary skjoldbruskkirtlen karcinomer (94 klassisk PTC med papillær eller blandet papillære-follikelvækst mønster og 18 follikulært papillær carcinom variants- FvPTC), 27 follikulært skjoldbruskkirtlen karcinomer (FTC), 24 follikulære adenomer (FA) og 10 normale skjoldbruskkirtlen væv (NT). Vævsprøver blev opnået med tilladelse fra de respektive etiske komitéer (på Cancer Center og Institut for Onkologi ved Copernicus Memorial Hospital, og ved Center for Postgraduate Medical Education).

For funktionelle studier brugte vi skjoldbruskkirtlen karcinom cellelinjer afledt papillær (TPC1 og BcPAP) og follikulært (FTC133 og CGTH-W-1) skjoldbruskkirtlen karcinomer og SV40-udødeliggjort human skjoldbruskkirtel epitelial line Nthy-ori 3-1 (i det følgende benævnt os som NTHY) til at repræsentere normal skjoldbruskkirtel celler. Cellelinjer blev opnået fra den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (BcPAP og CGTH-W-1), og fra European Collection of Cell Cultures (FTC 133 og Nthy-ori 3-1). Den TPC1 cellelinje [22] blev venligst stillet til rådighed af Dr. M. Santoro (The University of Napoli Federico II, Italien) [23]. Cellerne blev dyrket i komplet RPMI-1640 medium suppleret med 10% (vol /vol) FBS (Roche, Schweiz), med undtagelse af FTC133 celler, som blev dyrket i komplet DMEM /F-12 suppleret med 10% FBS (Life teknologier, Invitrogen, USA). Alle celler blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære.

RNA-isolering og real-time (RT) -qPCR

Totalt RNA blev isoleret fra human skjoldbruskkirtel prøver og kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer bruger en RNA Mini Kit (A A bioteknologi, Polen) i henhold til den anbefalede protokol, og RNA integritet blev verificeret ved agarosegelelektroforese. Totalt RNA (1 ug) blev anvendt til cDNA-syntese med en høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Applied Biosystems, USA). Ekspression af det humane

PDPN

og

18S rRNA

gener blev kvantificeret ved RT-qPCR hjælp af cDNA’er som template i reaktioner indeholdende den dobbeltstrengede DNA-farvestof SYBR Green I og Maxima Fluorescein RT -qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Canada), og specifikke oligonucleotidprimere (anført nedenfor), som tidligere beskrevet [24].

PDPN Hotel (NM_006474)

Forward : 5′-CGAAGATGATGTGGTGACTC-3 ‘

Omvendt: 5′-CGATGCGAATGCCTGTTAC-3′

18S rRNA Hotel (NM_02255)

Fremad: 5 ‘ -CCAGTAAGTGCGGGGTCATAAG-3 ‘

Omvendt: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′.

Forstærkning, dataopsamling og dataanalyse blev udført ved hjælp af iQ5 Real-Time PCR Detection System og software (Bio- Rad, USA).

PDPN tavshed med små interfererende RNA (siRNA)

TPC1 celler blev transficeret med siRNA (slutkoncentration 30 nM) målrettet menneske

PDPN

, (siPDPN , 5′-CGAAGACCGCUAUAAGUCUTT-3 ‘; Life Technologies, Ambion, USA) og en universel negativ kontrol siRNA (Sigma-Aldrich, USA) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Invitrogen, USA) i Opti-MEM (Roche, Schweiz) medium ifølge de anbefalede protokoller. Effektiviteten af ​​

PDPN

gen inhibering blev evalueret 48 timer efter transfektion ved RT-qPCR, Western blotting og immunofluorescens. Forsøget blev gentaget fire gange.

Western blotting

Høstede celler blev vasket to gange med iskold phosphatbufret saltvand (PBS) og resuspenderet i 1% NP-40 lysispuffer (150 mM natriumchlorid; 1,0% NP-40; 0,5% natriumdeoxycholat; 0,1% SDS; 50 mM Tris, pH 8,0) suppleret med 1% protease-inhibitor og 1% phosphataseinhibitor cocktails (Roche, Schweiz). Proteiner i cellelysaterne blev kvantificeret, og prøver på 30 ug blev opløst på 8% SDS-PAGE-geler og derefter elektro-overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, USA). Membranerne blev blokeret ved inkubering med 5% fedtfri mælk i TBS (0,1% Tween-20) i 1 time ved stuetemperatur, derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med primære anti-podoplanin monoklonalt museantistof (D2-40, fortyndet 1:1000, ABD Serotec, USA). Efter intensiv vask blev membranerne inkuberet med HRP-konjugeret affinitetsoprenset gede-anti-muse-sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA). Signaler fra reaktive bånd blev visualiseret ved forøget kemiluminescens-detektion (SuperSignal

® West Dura, Pierce Chemical, USA) som tidligere beskrevet [25]. Som loading kontrol, blev membranerne inkuberet med monoklonalt anti-β-actin-antistof (fortyndet 1:5000; Sigma-Aldrich, USA) på identisk måde Salg

immunfluorescensfarvning

Celler dyrkes. på glas dækglas blev fikseret med iskold methanol, blokeret med 2% gedeserum /2% BSA og derefter inkuberet med primære anti-podoplanin monoklonalt D2-40 museantistof (1:50; ABD Serotec, USA). Efter adskillige vaske blev cellerne inkuberet med DyLight

TM549-konjugeret anti-muse-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA). Cellerne blev modfarvet med nuklear farvestof DAPI og visualiseret med et fluorescensmikroskop (AxioObserver D1, Zeiss, Tyskland) ved anvendelse af en 100x olieimmersionsobjektiv linse.

Immunhistokemi (IHC)

Immunohistokemisk farvning analyse blev udført på 4-um tykke sektioner af arkiverede formalinfikserede, paraffinindstøbte skjoldbruskkirtlen væv: PTC (112 sager), FTC (27 tilfælde), FA (24 tilfælde), og NT (10 tilfælde). Snit blev deparaffinised og varmeinduceret antigen hentning blev udført i Target Retrieval Solution (TRS, pH 9,0, DAKO, Danmark), opvarmning i 20 minutter i en trykkoger. Objektglassene blev derefter inkuberet med anti-podoplanin D2-40 antistof i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask blev Envision + antistofreagens anvendt (DAKO, Danmark). Reaktioner blev udviklet ved anvendelse diaminobenzidin (DAB) som det chromogene substrat. Snittene blev modfarvet med hæmatoxylin, monteret og undersøgt under et lysmikroskop. Negative kontroller blev fremstillet ved at følge den samme fremgangsmåde, men under udeladelse af inkubation med primært antistof. IHC farvning blev evalueret af to uafhængige observatører (MK og BC) og scoret som “negativ” eller “positiv”, ifølge den relative intensitet af PDPN farvning. De immunhistokemiske data blev udsat for statistisk analyse.

Cell migration og invasion analyser

Cell migration og invasion aktivitet blev bestemt ved hjælp af en Boyden indsætte kammer (8-um porestørrelse, BD Falcon ™ Cell Culture Indsætter, USA) og BD BioCoat Matrigel invasion Afdeling 8-um (BD Bioscience, USA), hhv. Celler blev høstet og resuspenderet i serum-frit medium, derefter talt med en EVA Automatic Cell tæller (Nano Entek, Korea). I alt 2 x 105 celler resuspenderet i RPMI 1640-medium (for både migration og invasion-assays) sattes til kamrene og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 atmosfære. RPMI-medium suppleret med 10% FBS blev anvendt som kemoattraktant. Celler, der var migreret eller invaderet gennem membranen blev fikseret og farvet under anvendelse af et Diff-Quik Kit (Medion Diagnostics, Schweiz), afbildet ved 40x forstørrelse med et Olympus BX41 mikroskop, og talt. Hvert forsøg blev udført tredobbelt og gentaget tre gange.

In vitro

sårheling motilitet assay

Ridser af tilsvarende dimensioner blev foretaget på sammenflydende cellemonolag (dyrket i 6- brønds plader) med en steril 200 gl pipettespids. Monolagene blev derefter vasket med PBS for at fjerne løsnede celler og cellerester, og derefter fyldes med vækstmedium og inkuberet ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Pladerne blev observeret og fotograferet under et lysmikroskop (10x, AxioObserver D1, Zeiss, og 20x Nikon Diaphot 300) hver 3 timer for at bestemme hastigheden af ​​sårlukning. Bredden af ​​sårene på hvert tidspunkt blev målt i 5 uafhængige felter ved brug ImageJ software (www.rsbweb.nih.gov). Afstanden cellemigration blev bestemt ved måling af bredden af ​​såret divideret med to og ved at trække denne værdi fra den oprindelige halve sår bredde [26]. Afstand blev kvantificeret som følger: med 10x linse, 1 pixel = 1,026 um; med 20x objektivet, 1pixel = 0,43 um.

Cellelevedygtighed assay

At evaluere celleproliferation, antallet af levedygtige celler efter 24 og 48 timer efter transfektion med siRNA blev bestemt under anvendelse af en 2, 3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilid (XTT) tetrazolium-celleproliferation kit (EZ4U, Biomedica GmbH, Austria). Kort beskrevet blev brøndene af plader med 96 brønde podet med 8 × 10

3 celler (5 gentagelser). Derefter blev 25 pi XTT reagensblandingen tilsat til hver brønd, og absorbans ved testen bølgelængde (450 nm til måling formazanproduktion) og henvisningen bølgelængde (620 nm) blev målt på forskellige tidspunkter under anvendelse af en Labsystems Multiscan RC mikropladelæser (Thermo Fisher Scientific, USA).

Apoptose assay

Apoptose blev vurderet ved anvendelse af en Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Abcam, UK) ved at følge den anbefalede protokol. Kort fortalt blev høstede celler vasket med PBS, inkuberet med FITC-Annexin V og propidiumiodid i 5 minutter ved stuetemperatur og derefter undersøgt ved hjælp af flowcytometri (FACSCantoII, BD Biosciences, USA). Eksperimentet blev udført tre gange.

Dataanalyse

Alle forsøg blev udført mindst tre gange. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af ikke-parametriske Mann-Whitney U test og parret t-test (GraphPad, Prizm, USA). En

P

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Multivariat logistisk regressionsmodel blev brugt til at undersøge sammenhængen mellem uafhængige kovarianter og podoplanin tumorform udtryk.

Resultater

PDPN proteinekspression og cellulær lokalisering

udtryk for podoplanin blev først vurderet i arkiverede skjoldbruskkirtlen tumor vævsprøver. Immunhistokemisk analyse blev udført på en serie af 173 paraffinindlejrede væv (112 PTC, 27 FTC, 24 FA og 10 NT) under anvendelse af anti-podoplanin monoklonalt antistof D2-40. I normal thyreoideavæv PDPN farvning var fraværende i follikulære celler og anti-PDPN antistof mærket udelukkende og stærkt kun lymfeendotelceller i de mange lymfekar, der tjente som en god intern kontrol (figur 1A a). Alle analyserede FTC og FA prøver var negative for PDPN immunreaktivitet (figur 1A;. B, c). Flertal af de undersøgte PTC’er var også negative for PDPN mærkning (figur 1A d.). Men 40% (45 af 112) af PTC viste positiv immunfarvning for podoplanin (figur 1A;. E-l). Forskellige intensitet PDPN mærkning (fra moderat til stærk) blev observeret i cytoplasmaet af tumorceller og i de fleste tilfælde blev farvning fordelt ensartet over kræft. I modsætning hertil peritumorale væv celler (betragtes som “normal thyreoideavæv”) var helt PDPN negative (se figur 1A,. E, j, k, l). I disse tumor-fri normale skjoldbruskkirtlen væv margener, D2-40 antistof mærket udelukkende og stærkt lymfekar i forskellige størrelser og former. Associeringen af ​​PDPN ekspression i tumor- vævsprøver med klinisk-patologisk data blev vurderet ved multivariat logistisk regressionsmodel og opsummeret i tabel 1. Cytoplasmisk PDPN ekspression ikke var statistisk signifikant forskellig mellem patienter med større eller mindre tumorstørrelse (PT) eller histologiske (FvPTC

vs

klassiske PTC) undertype. Selv om der var en højeste antal sager (9 positive tumorer blandt 17 testede) med induceret podoplanin cytoplasmatisk udtryk i pT3 gruppen og intensiteten af ​​farvningen var stærk i alle positive tumorer, antallet af sager i gruppen var for lille til at være analyseret statistisk. Imidlertid blev podoplanin proteinekspression signifikant korreleret med patientens alder. Ældre PTC patienter (≥45) viste oftere (69%

vs

31%) PDPN neoexpression derefter yngre ( 45), (justeret odds ratio 4, 95% konfidensinterval 1,76 til 9,2,

P

. 0,001)

A. Immunhistokemi påvisning af podoplanin blev udført på paraffinindlejrede vævssnit. Repræsentative Immunofarvning resultater opnået med anti-PDPN monoklonalt antistof D2-40. (A) eksklusiv og stærk farvning af lymfekar i normal thyreoideavæv; (B) follikulær adenom (FA) væv negative for podoplanin; (C) follikulært skjoldbruskkirtlen carcinom (FTC) væv negativ for podoplanin; (D) papillær skjoldbruskkirtlen carcinom (PTC) tilfælde negativ for podoplanin; (E-l) intens cytoplasmatisk farvning af PDPN i PTC-celler. I e, j og jeg intens farvning af PDPN i tumorceller, med peritumoral margin negative for podoplanin og stærk farvning af lymfekar som en intern positiv kontrol. Oprindelig forstørrelse: a-100x, a-inset -100x; b-200x, b-inset -100x; c-200x; d-200x, e-100x, f-100x, g-200x; h-200x, i-100x, j-200x, k-200x, l-400X. Af 112 PTC tilfælde, 45 (40%), der vises ektopisk podoplanin udtryk i kræftcellerne. B. Relativ PDPN mRNA-ekspression i 21 PTC’er (t) og parrede normale væv (NT) analyseret ved RT-qPCR. PDPN og 18S rRNA transkriptniveauer blev kvantificeret og podoplanin udtryk normaliseret mod denne af husholdning genet (18S rRNA). Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SEM, **

P

. 0,001

Vores analyse blev udvidet med en undersøgelse af

PDPN

gen ekspression i serie af kirurgisk fjernet PTC /NT parrede væv anvendelse af RT-qPCR. I 14 af de 21 analyserede PTC /NT tilfælde, en signifikant højere (

P

0,001) niveau af

PDPN

afskrift blev påvist i PTC prøver sammenlignet med de tilsvarende normale skjoldbruskkirtlen væv (Fig . 1B). I de resterende 7 PTC /NT parvis niveauet af

PDPN

mRNA i PTC væv var lig med eller endog lavere end i de parrede normale væv.

Ekspression og cellulær lokalisering af PDPN i kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer

for at undersøge den funktionelle rolle podoplanin i skjoldbruskkirtlen cellebiologi vi undersøgt en normal skjoldbruskkirtel cellelinje (NTHY), og et panel af papillær (TPC1 og BcPAP) og follikulært (FTC133 og CGTH- W-1) thyreoideacancer-afledte cellelinier. Niveauet af

PDPN

mRNA var meget lav i de immortaliserede NTHY celler (Fig. 2A). I skjoldbruskkirtlen carcinomceller, bemærkelsesværdige forskelle i den relative blev observeret

PDPN

udskrift niveau mellem celler stammer fra PTC og FTC. TPC1 og BcPAP celler udviste det højeste niveau af

PDPN

mRNA-ekspression blandt alle de testede thyroid carcinoma cellelinier. I modsætning hertil

PDPN

transkript blev ikke påvist i FTC133 og CGTH-W-1 follikulære karcinom-afledt cellelinjer (fig. 2A). I gennemsnit niveauet af

PDPN

mRNA i PTC-cellelinier var mere end 3 gange højere end den i NTHY kontrolceller.

A. PDPN mRNA-ekspression i human kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer. RT-qPCR blev anvendt til at evaluere niveauet af transkriptet kodende podoplanin i total RNA fremstillet fra NTHY kontrolceller, PTC-afledte TPC1 og BcPAP cellelinier og FTC-afledte FTC133 og CGTH-W-1 cellelinier. Data fra fire uafhængige forsøg udført tredobbelt udtrykkes som middelværdien ± SEM, **

P

0,001. B. Podoplanin protein niveauer i human kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer. Proteinekstrakter (30 ug) blev underkastet Western blot-analyse med anti-PDPN monoklonalt antistof D2-40 og β-actin antistof som en loading kontrol. C. Immunofluorescensanalyse af podoplanin udtryk i TPC1, BcPAP, FTC133 og CGTH-W-1 thyreoidea cancer cellelinjer. PDPN blev visualiseret ved farvning under anvendelse af anti-PDPN monoklonalt antistof D2-40 efterfulgt af DyLight549-konjugeret sekundært antistof (rød), og kerner blev modfarvet med DAPI (blå). Forstørrelse 1000x.

Podoplanin proteinekspression og cellulære lokalisering i skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer

For at bekræfte de RT-qPCR resultater, vi udført Western blotting og immunfluorescence analyser at evaluere PDPN proteinekspression og bestemme dets cellulære lokalisering i skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer. De podoplanin protein niveauer anslået af immunoblotting var i fuld overensstemmelse med RT-qPCR resultater. PDPN protein blev stærkt induceret i TPC1 og BcPAP cellelinjer, men det ikke blev påvist i celler FTC-oprindelse (Fig. 2B). Immunofluorescens analyse bekræftede de høje niveauer af PDPN i TPC1 og BcPAP celler. Proteinet blev lokaliseret hovedsageligt på cellemembranerne og i det cytoplasmatiske rum af PTC-oprindelse cellelinjer (fig. 2C). De FTC133 og CGTH-W-1 linjer var negative for PDPN immunfarvning, igen validering af RT-qPCR data.

Effekt af PDPN på den maligne celle fænotype

I lyset af sin pro-invasiv egenskaber rapporteret i andre typer af humane tumorer og de høje niveauer påvist i PTC prøver vi næste undersøgt, om PDPN er involveret i migration og invasion af skjoldbruskkirtlen tumorceller. TPC1 celler blev transficeret med siRNA rettet mod

PDPN

(TPC1 /siPDPN) og med en kontrol universel negativ siRNA (TPC1 /siNEG). Enhver efterfølgende nedregulering af podoplanin blev evalueret ved hjælp af RT-qPCR, Western blotting og immunofluorescens metoder. Kun -15% af den oprindelige

PDPN

transkript niveau blev påvist i TPC1 /siPDPN celler 48 timer efter transfektion, hvilket bekræfter, at den specifikke siRNA producerede effektiv lyddæmpning af

PDPN

(fig. 3A). Western blotting og immunfluorescence assays demonstrerede knock-down af podoplanin genekspression i disse celler. Som vist i fig. 3B og 3C, PDPN protein blev påvist først i TPC1 celler transficeret med den negative kontrol siRNA. Celleproliferation, adhæsion og overlevelse blev derefter vurderet for de TPC1 celler transficeret med de

PDPN

-specifikke og kontrol siRNA’er. Ingen stigning i proliferationshastigheden af ​​celler med lyddæmpede

PDPN

fandtes sammenlignet med kontrolcellerne (fig. 3D, venstre panel). Vi også ikke observere nogen forskelle i vedhæftning af

PDPN

-silenced og kontrol celler (Fig.3E). Endvidere var der ikke forskel i antallet af levedygtige ( 90%), apoptotiske og nekrotiske celler mellem specifikke og ikke-specifikke siRNA-behandlede TPC1 celler (. Figur 3D, højre panel), hvilket tyder på, at ekspressionen af ​​PDPN ikke gør øge tilbøjeligheden af ​​disse celler til apoptose.

A. RT-qPCR analyse af PDPN mRNA-niveauer i TPC1 thyreoideacancerceller 48 timer efter transfektion med 30 nM siRNA specifik for PDPN (siPDPN) eller en negativ kontrol siRNA (siNEG). Resultaterne blev normaliseret til 18S rRNA-niveau og bjælker repræsenterer den gennemsnitlige gange ændring i PDPN transkript overflod i celler transficeret med siPDPN sammenlignet med celler transficeret med siNEG. Resultaterne er repræsentative for fire uafhængige forsøg. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM, **

P

0,001. B. Western blot-analyse af podoplanin og p-actin proteiner i TPC1 celler før (0 timer) og 48 timer efter transfektion med siPDPN og styre siNEG. C. Immunofluorescens farvning af podoplanin protein i TPC1 celler transficeret med siPDPN og styre siNEG. Celler blev farvet med anti-PDPN monoklonalt antistof D2-40 efterfulgt af DyLight549-konjugeret sekundært antistof (rød), og modfarvet med DAPI (blå). 1000 x forstørrelse. D. Virkning af PDPN på cellelevedygtighed. D, venstre panel. Proliferation blev målt ved 24 og 48 timer efter transfektion af celler med TPC1 siPDPN eller kontrol siNEG. Celler podet i plader med 96 brønde blev behandlet med XTT reagensblandingen og formazan-dannelse blev målt ved 450 nm for at bestemme antallet af levedygtige celler. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg udført i fem eksemplarer. D, højre panel. Apoptose blev målt ved 48 timer efter transfektion af celler med TPC1 siPDPN eller kontrol siNEG. Celler blev opsamlet og farvet med FITC Annexin V og propidiumiodid efterfulgt af flowcytometri. Repræsentative målinger af procentandelen af ​​Annexin V + celler er vist. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg udført firdobbelt. E. funktion podoplanin i celleadhæsion. TPC1 celler transficeret med siPDPN display vedhæftning kapacitet sammenlignelige med dem for siNEG-transficerede celler. Kort fortalt blev 8000 transfekterede celler podet i brøndene af plader med 96 brønde. Efter inkubation i 24 eller 48 timer blev cellemonolagene vasket, fikseret med 4% formaldehyd i 15 minutter og farvet med krystalviolet (Merck, USA). De farvede celler blev lyseret ved behandling med 2% SDS, derefter intensiteten af ​​det frigivne pletten blev kvantificeret ved spektrofotometri ved 550 nm under anvendelse af en Labsystems Multiscan RC mikropladelæser (Thermo Fisher Scientific, Canada). Dataene repræsenterer tre separate eksperimenter.

Migration og invasion

For at analysere, hvordan reduceret PDPN udtryk påvirker migrative potentiale TPC1 celler, vi udførte en

in vitro

scratch sårheling assay med celler transficeret med siPDPN eller med kontrol siNEG. En ridse blev lavet i monolag af podede celler og eventuelle forskelle i sårheling blev overvåget. I tre uafhængige forsøg, blev helbredelse ved øget celle motilitet sig at være hurtigere til kontrol celler end for

PDPN

-silenced celler (fig. 4A). Motiliteten af ​​transficerede celler blev derefter vurderet under anvendelse af et kammer migration assay. Som forventet, migration af celler med reduceret

PDPN

klart ændret (fig. 4B, venstre panel), at være på gennemsnitligt 2 gange lavere end for kontrol celler. Derefter undersøgte vi virkningen af ​​

PDPN

knock-down på den invasive potentiale af celler ved anvendelse af Matrigel invasion assay. Silencing af

PDPN

gen dybt svækket den invasive kapacitet TPC1 celler (fig. 4B, højre panel). I hver udførte eksperimentelle replikat, observerede vi en konsekvent og stærk reduktion i invasiv af

PDPN

-silenced celler sammenlignet med de kontroller eller de parentale TPC1 celler (data ikke vist).

EN. Scratch sårheling assay. Repræsentative lys mikroskop billeder viser heling af sår i monolag af TPC1 celler transficeret med siPDPN eller kontrollere siNEG ved 0 og 24% FBS som en kemoattraktant og efter 24 timer, celler, der var migreret gennem 8-um porestørrelse membran blev farvet og fotograferet ved 40x forstørrelse. Andelen af ​​migrerende celler er vist i grafisk form. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM af mindst tre separate forsøg, **

P

0,001. B, højre panel. Den invasionsevne af TPC1 celler transficeret med siPDPN eller kontrol siNEG blev analyseret ved at tilsætte celler til en BD BioCoat Matrigel Invasion Afdeling, 8-um. Den nedre reservoir blev fyldt med 10% FBS som en kemoattraktant og efter 24 timer blev celler, der var flyttet gennem Matrigel til den nedre overflade af membranen fikseret, farvet og fotograferet ved 40x forstørrelse. Andelen af ​​invasive celler er præsenteret i grafisk form. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM af mindst tre separate forsøg, ***

P

. 0,0001

Samlet set viser disse data, at podoplanin fungerer som en proinvasive