PLoS ONE: En forbedret immunrespons af Mclk1 +/- Mutant Mus er forbundet med delvis beskyttelse fra fibrose, kræft og udvikling af biomarkører for Aging

Abstrakt

immunrespons er afgørende for overlevelse ved at ødelægge mikroorganismer og præ-kræftceller. Men inflammation, et aspekt af dette svar, kan resultere i kort- og langsigtede skadelige bivirkninger.

Mclk1

+/- mutant mus kan være langlivede trods vise en hår-trigger inflammatorisk respons og kronisk aktiverede makrofager som følge af høj mitokondrie ROS generation. Her spørger vi, om denne fænotype er gavnligt eller blot tolereret. Vi brugte modeller af infektion med

Salmonella

serotyper og oplevede, at

Mclk1

+/- mutanter montere en kraftigere immunrespons, kontrollere bakteriel spredning bedre, og er modstandsdygtige over for celler og væv skader som følge af reaktion, herunder fibrose og typer af oxidativ skade, som vurderes at være biomarkører for aldring. Desuden blev disse samme typer af vævsbeskadigelse fundet at være lav i ubehandlede 23 måneder gamle mutanter. Vi undersøgte også indledningen af ​​tumorvækst efter transplantation af mus LLC1 carcinom celler i

Mclk1

+/- mutanter, såvel som under spontan tumorigenese i

Mclk1

+ /-

Trp53

+/- dobbelte mutanter. Tumor latenstid blev forøget med

Mclk1

+/- genotype i begge modeller. Desuden brugte vi transplantation model til at vise, at milt CD8 + T-lymfocytter fra

Mclk1

+/- graft modtagere viser forbedret cytotoksicitet mod LLC1 celler in vitro.

Mclk1

+/- mutanter vise således en sammenslutning af en forbedret immunrespons med delvis beskyttelse mod aldersrelaterede afhængige processer og fra patologier der ligner dem, der er fundet med øget hyppighed under modningen. Dette antyder, at immun fænotype af disse mutanter kunne bidrage til deres levetid. Vi diskuterer, hvordan disse resultater tyder på en bredere opfattelse af, hvordan immunresponset kan påvirke modningen

Henvisning:. Wang D, Wang Y, Argyriou C, Carrière A, Malo D, Hekimi S (2012) En forbedret immunrespons af

Mclk1

+/- Mutant Mus er forbundet med delvis beskyttelse fra fibrose, kræft og udvikling af biomarkører for Aging. PLoS ONE 7 (11): e49606. doi: 10,1371 /journal.pone.0049606

Redaktør: Yann Herault, IGBMC /ICS, Frankrig

Modtaget: August 16, 2012; Accepteret: 11 oktober 2012; Udgivet: November 14, 2012 |

Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet er finansieret af en bevilling fra den canadiske Institutes of Health Research til SH (MOP-97.869) og McGill University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

immunsystemet er afgørende for øjeblikkelig overlevelse som reaktion på akutte udfordringer fra infektion og kræftceller. Men som det er tilfældet for andre organer, funktionen af ​​immunsystemet forringes under ældning på en måde, der kan være skadelige [1], [2], og markører for immunosenescence er omvendt forbundet med langsigtet overlevelse [3], [4]. Immunsystemet har også været impliceret i ældningsprocessen på en anden måde. Det er blevet foreslået, at aktiviteten af ​​immunsystemet kan faktisk forårsage del af fænotypen observeret i alderen individer [5]. Navnlig processen med inflammation, som er udløst af det medfødte immunsystem, har været impliceret i udløsning eller forværring af udviklingen af ​​kroniske sygdomme på ældning, herunder, type II diabetes [6], atherosclerose [7], tumorvækst [8] og alle de metaboliske konsekvenser af fedme [9]. Desuden kronisk inflammation fører til progressiv fibrose [10], en sårhelende reaktion, der involverer akkumulering af ekstracellulære matrixproteiner og krydsbinding af ekstracellulære collagen. Fibrose er kendetegnende for ældning i en række forskellige organer, herunder lever [11], og kan føre til unormale vævsstrukturer og medføre alvorlige organsvigt. Desuden er det blevet foreslået, at, i mennesker, episode af stærk betændelse i barndommen fører til langsigtede skadelige virkninger på grund af forbedrede inflammatoriske processer senere i livet [12]. Denne hypotese er baseret på den iagttagelse, at historisk set falder i dødeligheden alderdom blev Forud fald i dødeligheden tidlig alder på grund af færre episoder med alvorlig infektion og dermed inflammation.

I modsætning hertil vores tidligere undersøgelse af langlivet

Mclk1

+/- mus mutanter støttede ikke den opfattelse, at betændelse udløser eller forværrer modningen [13].

Mclk1 Hotel (aka

Coq7

) koder et enzym involveret i ubiquinon (UQ) biosyntese [14], og tab af én kopi af

Mclk1 Hotel (i

Mclk1

+/- mutanter) resulterer i i) ændres UQ distribution i mitochondriemembraner [15], ii) ændret funktion af den mitokondriske respiratoriske kæde [16], iii) en stigning i dannelsen af ​​mitochondriale reaktive oxygenarter (mitROS) [16], iv) et fald i hastigheden for udvikling af oxidative biomarkører for aldring [17], og v) en øget levetid [17], [18]. I disse mutanter stigningen i mitROS fører til forøget ekspression af immun regulator HIF-1α i makrofager [13]. HIF-1α har vist sig at være nødvendig for forskellige aspekter af immunfunktion, herunder som en udløser af differentieringen af ​​makrofager langs den inflammatoriske pathway aktivering [19]. I overensstemmelse med disse iagttagelser fandt vi, at

Mclk1

+/- mutanter havde aktiverede makrofager, og at mutanterne omsættes med en meget stærkere øjeblikkelig forøgelse af cirkulerende inflammatoriske cytokiner ved behandling med meget lave niveauer af lipopolysaccharid (LPS ) [13]. Således i

Mclk1

+/- mutanter, i modsætning til forventning, blev en høj inflammatorisk reaktivitet fundet at være forbundet med en langsom udvikling af biomarkører for aldring og med en øget levetid. Et vigtigt spørgsmål er, om det ændrede immunrespons af

Mclk1

+/- mutanter kunne deltage i at gennemføre den langtidsholdbare fænotype.

For at løse dette spørgsmål, vi har spurgt, om den forbedrede immunrespons i

Mclk1

+/- mus er faktisk gavnligt for organismen i form af resistens over for bakteriel infektion, kræft og slags markører for skader, der anses for at være biomarkører for aldring. Salg

Resultater

Mclk1

+/- Mutanter Bedre kontrol Infektioner af

Salmonella

Typhimurium

Vi testede effektiviteten af

Mclk1

+/- mutanter i en model for infektion med

S

. Typhimurium. Vi brugte

Mclk1

+/- mutanter og søskende vilde kontrol typen på 129S6 /SvEvTac (129S6) genetiske baggrund. Mus med denne baggrund er vildtype på

Slc11a11

locus og kan overleve

S

. Typhimurium infektion, men kan ikke klare bakterierne fuldstændigt og således udvikle en kronisk infektion [20]. Vi injicerede mutanter og vildtypekontroller intravenøst ​​i en dosis på 1140 CFU pr mus og afsluttet leveren bakteriel belastning (CFU per gram væv) efter 40 dage. Mutanterne udviser en lille, men statistisk signifikant fald på -9%, indikerer en noget mere effektiv immunregulering af

S.

Typhimurium infektion (figur 1A).

A. Lever bakterielle belastninger blev evalueret 40 dage efter infektion i 3 måneder gamle mus og var lavere i

Mclk1

+/- mutanter. Tre uafhængige forsøg blev udført. I hvert forsøg var den gennemsnitlige CFU pr gram væv af hver mutant (

Mclk1

+/-) og vildtype dyr (

Mclk1

+ /+) blev normaliseret til gennemsnittet af vildtype-gruppen i det eksperiment. I alt 35 vildtypedyr og 23 mutanter blev normaliseret på denne måde og resultaterne puljet. Middelværdien ± S.E.M. af puljen er vist. * Angiver p 0,05. B. Leverfibrose blev bestemt i inficerede og ikke-inficerede grupper på dag 40 efter infektion under anvendelse PicroSirius Red-farvning. Fraktionen af ​​området med sektioner, der farves for kollagen er vist. Middelværdien ± S.E.M. er vist. Der var 9-14 dyr i hver gruppe. C. og D. oxidative skader på proteiner blev vurderet ved Oxyblot assay. Alle prøver blev anvendt, var fra samme kuld par. Et repræsentativt resultat er vist i C. Intensiteten af ​​farvningen i hver bane blev kvantificeret og normaliseret ved den for vildtype i samme blot. Middelværdien ± S.E.M. af hver gruppe er vist på grafen og parret t-tests blev anvendt til sammenligninger. E. oxidative skader på DNA blev bestemt ved måling 8-OHdG niveauer under anvendelse af oprenset totalt lever-DNA. Kuldsøster par blev anvendt (

Mclk1

+/- vs.

Mclk1

+ /+): 5 par uden infektion og 6 par ofret 40 dage efter infektion. Middelværdien ± S.E.M. for hver gruppe er vist i grafen; parret t-test blev anvendt til sammenligninger. F. Plasma ALT-aktivitet blev målt 40 dage efter infektion. Der var 8-14 dyr i hver gruppe, og den gennemsnitlige ± S.E.M. af hver gruppe er vist. For B-F, forskellene mellem de mutante og vildtype grupper er signifikant med, men ikke uden, infektion ved p lt; 0,05. Alle forsøg i denne figur blev udført med hanner.

Mclk1

+/- Mutanter Sustain Mindre vævsbeskadigelse i Reaktion på

S.

Typhimurium infektion

Bakteriel infektion og immunreaktion mod det fører til vævsbeskadigelse, herunder oxidativ beskadigelse. I leverprøver af samme dyr som i figur 1A vi også testet fibrose (figur 1B), oxidative skader på proteiner, under anvendelse oxyblot (figur 1C og 1D), og oxidative skader på DNA, ved at måle niveauerne af 8-OHdG (figur 1E). I plasmaprøven fra disse dyr målte vi alanin amino-transferase (ALT), et mål for beskadigelse leverceller (figur 1F). Der var en stor stigning i alle fire foranstaltninger i inficerede dyr i forhold til ikke-inficerede kontroller. Imidlertid blev stigningen signifikant mindre markant i mutante dyr for alle fire foranstaltninger. Faktisk i tilfælde af fibrose var der ingen stigning overhovedet. Niveauerne af fibrose var meget lave, men forskellen mellem genotyper efter infektion er betydelig alligevel, og det er også i overensstemmelse med andre resultater vedrørende følsomhed over for fibrose i

Mclk1

+/- mutant mus (se nedenfor ). Bemærk, at i dette eksperiment kan vi ikke undersøge, om det lavere niveau af skaden skyldes den reducerede bakteriel belastning eller en ændring i niveauet af skader produceret af immunresponset selv.

Mclk1

+/- Mutanter Display en ændret immunreaktion til

S.

enteritidis Infektion

Vores oprindelige observationer, at immunsystemet er ramt af høj mitokondrie oxidativt stress i

Mclk1

+/- mutanter blev udført på C57BL /6J baggrund [13]. For eksempel er det på denne baggrund, at vi observeret, at mutanterne svarede til et lavt niveau af LPS behandling med en meget større forøgelse af cirkulerende plasma cytokiner. Men

S.

Typhimurium infektioner er dødelige på C57BL /6J baggrund, som bærer et tab af funktion mutation på

Slc11a11

locus [21]. I modsætning hertil eksperimentelle intravenøse infektioner med en anden serovar,

Salmonella

Enteritidis, kan helt ryddet fra leveren 40 dage efter infektion på C57BL /6J baggrund [22]. Hvis du vil linke resultater med eksperimentelle infektioner til vores tidligere arbejde på den baggrund, vi først testet, om den immunreaktion til

S.

Enteritidis var anderledes i mutanterne, som det var for LPS. Ved hjælp af en assay (Luminex), hvorved niveauet for 10 plasma cytokiner kan samtidig vurderes, vi bestemme cytokinniveauer 7 dage efter infektion med

S.

Enteritidis (figur 2A). Vi fandt, at begge proinflammatoriske Th1 cytokiner (IL-1p, IL-6, og IFN-y) og antiinflammatoriske Th2-cytokiner (IL-4 og IL-10) var forhøjet sammenlignet med kontroller. Desuden IL-2, IL-5 og GM-CSF viste en klar tendens mod en tilsvarende højde. Samlet set har disse resultater viser, at flere aspekter af immunsystemets reaktion på

S.

Enteritidis infektion i

Mclk1

+/- mutanter er mere udtalt end i den vilde type.

Tre måneder gamle kuld i begge genotyper blev inficeret intravenøst ​​med 1800 CFU’er per mus, deres plasma opsamlet efter 7 dage og vurderet for cytokinniveauer. For hver cytokin værdierne var normaliseret til middelværdien målt til

Mclk1

+ /+ kontrolgruppe. Prøven størrelse var 32-38 for hver genotype. Stjernerne repræsenterer p 0,05. B. Tre måneder gamle mus på C57BL /6L baggrund blev tildelt i 3 grupper af 9-12 mus for hver genotype. Hver mus blev inficeret intravenøst ​​med 10

3 CFU

S.

Enteritidis. Bakterielle belastninger i leveren blev målt på dag 7, 21 og 42 efter infektion. C. Plasma ALT-aktivitet blev målt på dag 7, 21 og dag 42 efter infektion. 5-13 mus i hver genotypiske gruppe på hvert tidspunkt blev anvendt, og den gennemsnitlige ± S.E.M. er vist. Alle forsøg i denne figur blev udført med lige numre af både hanner og hunner.

For at afgøre, om de forskellige reaktivitet til infektionen, som bevidnet af højere cytokinniveauer blev ændre clearance af bakterier fra lever vi bestemme den bakterielle belastning på 7, 21 og 42 dage efter infektion (figur 2B). Ingen signifikant forskel mellem mutant og vildtype bakteriel belastning blev observeret på ethvert tidspunkt efter infektion. Men på trods af lignende bakteriel belastning, skader på leveren, som målt via plasma ALAT, blev reduceret på dag 7 i

Mclk1

+/- mutanter og viste den samme tendens til reduktion af andre dage (Figur 2C).

Mclk1

+/- Mutanter Sustain en langsommere stigning af vævsbeskadigelse over tid og som svar på

S.

enteritidis Infektion

i en tidligere undersøgelse, vi observeret, at den gradvise udvikling af mitokondrie og oxidative biomarkører for aldring blev bremset i

Mclk1

+/- mutanter i forhold til søskende

Mclk1

+ /+ kontroller [17]. For at fortsætte vores studier i C57BL /6J baggrund vi først undersøgt, om nogle af de markører for skader, som vi havde observeret at være lavere efter

S.

Typhimurium infektion opførte sig som biomarkører for aldring i C57BL /6J mus . Til dette har vi først fastslået, at leveren fibrose, et mål for kumulativ vævsskade, og plasma alaninaminotransferase (ALT) aktivitet, et mål om løbende leverskader [23], steg med alderen i denne baggrund (figur 3A og 3B). Vi derefter målt fibrose og ALT i unge (3 måneder gammel) og gamle (23 måneder gammel) mutanter og kontroller på C57BL /6J baggrund (figur 3C og 3D). For begge mærker var der ingen forskel i unge dyr, men en markant reduktion i mutanterne sammenlignet med kontroller blev observeret i gamle dyr.

A. Niveauet af liver fibrose i vildtype C57BL /6J mus af forskellig alder blev bestemt. Sample størrelser var 5-16 og midlerne ± S.E.M. af hver aldersgruppe vises. Stjernerne angiver statistisk signifikans sammenlignet med den umiddelbart yngre aldersgruppe ved en t-test. * Står for P 0,05, ** P 0,01 og *** for P 0,001. B. Plasma ALT aktivitet af vildtype C57BL /6J mus blev målt, og middelværdien ± S.E.M. af hver aldersgruppe vises. Sample størrelser var fra 5 til 14. C. Niveauet af liver fibrose i unge og gamle

Mclk1

+/- mutanter på C57BL /6J baggrund og deres

Mclk1

+ /+ søskende blev bestemt. Prøve størrelse var 5 for 3 måneder gamle kohorte og den 17.-20 for 23 måneder gamle kohorte. D. ALT aktivitet i

Mclk1

+/- mutanter og

Mclk1

+ /+ søskende på C57BL /6J baggrund blev målt til 3 måneder og 23 måneder . Der var 5 mus for hver genotype i 3 måneder gamle kohorte, og fra 15 til 16 mus i 23 måneder gamle kohorte. blev bestemt E. Niveauet af liver fibrose efter 3 runder af

S.

Enteritidis infektion. Der var 11-16 mus i hver gruppe; middelværdien ± S.E.M. af hver gruppe er vist. Stjernerne angiver statistisk signifikans sammenlignet med vildtype-gruppe ved en t-test. * Står for P 0,05. Alle forsøg i denne figur blev udført med lige numre af både hanner og hunner.

En hypotese for at forklare den lave skader i gamle

Mclk1

+/- mutanter er at det skyldes en levetid på mindre skadelige immunreaktioner på infektioner og andre inflammatoriske processer (som foreslået af eksperimenterne med

S.

Typhimurium). For yderligere at teste denne idé tog vi fordel af, at

S.

Enteritidis er fuldt ryddes fra leveren på mindre end to måneder i C57BL /6J baggrund [22]. Vi har derfor gennemført en gentagen infektion undersøgelse, hvor mus blev inficeret 3 gange i 2-måneders interval starter ved 3 måneders alderen, og plasma ALT samt leverfibrose blev målt en måned efter den sidste infektion. Som vist i figur 3E, blev leverfibrose i vildtype dramatisk forhøjet sammenlignet med aldersmatchede ikke-inficerede kontroller. Niveauet af observerede skader var i området der er observeret i ikke-inficerede, men ældre, 13 måneder gamle mus (figur 3A), hvilket bekræfter, at leverfibrose er en kumulativ skade markør, der er accelereret ved infektion. I modsætning til vildtype situationen,

Mclk1

+/- mutanter var upåvirket af de 3 runder af infektion (figur 3E), styrke vores fortolkning, at det lavere niveau af fibrose hos ikke-inficerede gamle

Mclk1

+/- mutanter (figur 3C) kunne være resultatet af en levetid på mindre skadelige immunreaktioner, som til gengæld kunne være en del af, hvad der giver mulighed for mutanterne ‘levetid. Fremtidige undersøgelser for at forstå den lave fibrotisk respons i

Mclk1

+/- mutanter bør omfatte studiet af signalering gennem TGF-β, et molekyle, der er ofte forbundet med reguleringen af ​​fibrose.

I modsætning til fibrose, ALT-niveauer var fuldstændig upåvirket efter tre runder af infektion (ikke vist). Dette er i overensstemmelse med det, vi havde observeret efter en enkelt runde af infektion med

S.

Enteritidis (Figur 2C), når ALAT, som var lavere i

Mclk1

+/- mutanter umiddelbart efter infektionen var tilbage til normal 40 dage senere. Dette er i modsætning til det, vi observeret med

S.

Typhimurium infektion, som ikke er ryddet, men forbliver kronisk, og hvor ALT-niveauer stadig stærkt forhøjet efter 40 dage (figur 1F). Dette bekræfter, at ALT er ikke et mål for at akkumulere tab, men snarere løbende skader. Disse resultater tyder også på, at de høje ALT-niveauer observeret i gamle vildtype dyr (figur 3D) er et mål for igangværende patologiske processer.

Mitochondriel Oxidative Stress i sig selv ikke at stimulere immunresponset Nor Reducer Fibrotiske Skader

mutanter heterozygote for en knockout af mitokondrie superoxiddismutase gen

Sod2,

som er fuldt levedygtige, viser forhøjet mitokondrie oxidativt stress som

Mclk1

+/- mutanter [17 ], [24], [25]. Vi undersøgte, om effekten af ​​

Mclk1

+/- mutation på immunforsvar og skader også blev induceret i

Sod2

+/- mutanter.

Mclk1

+/- mutanter reagerer på meget lave niveauer af LPS (0,01 mg /kg) med en dramatisk forhøjelse af serum cytokinniveauer, især TNF-α, som blev observeret af multiple-cytokin Luminex test samt ved en TNF-α-specifikt ELISA [13]. Vi testede 3 måneder gammel

Sod2

+/- mutanter for reaktivitet overfor meget lavt niveau af LPS og fandt ingen stigning af plasma-TNF-α i forhold til vildtype kontroller (figur 4A). Vi testede også niveauet af leverfibrose i alderen mutanter (16 måneder gamle) (figur 4B). Der var noget fald i fibrose hos mutanterne, men en stærk tendens til, en dramatisk stigning i fibrose. Disse resultater er i overensstemmelse med den hypotese, at reduktionen i alders- og infektion-afhængige skade navnlig fibrose, observeret i

Mclk1

+/- mutanter skyldes deres forbedrede immunrespons, snarere end fra andre fysiologiske ændringer, der kan induceres af forhøjet mitokondrie oxidativ stress.

A. TNF-α-niveauer i plasma på 3 måneder gammel

Sod2

+/- mutanter og styrer to timer efter IP injektion af 0,01 mg /kg LPS, målt ved ELISA. En t-test ikke indikerer nogen forskel i TNF-α-niveauer mellem

Sod2

+/-

mutanter og kontroller (n = 15-17; fejl søjler repræsenterer S.E.M.). B. Niveauet af liver fibrose i

Sod2

+/- mutant hanner og kontrol ved 16 måneders alderen blev bestemt. Der var 6 og 11 mus i

Sod2

+/- og

Sod2

+ /+ grupper, hhv. Alle forsøg i denne figur blev udført med hanner alene.

Indirekte Bevis for forsinket Tumor Indledning og /eller vækst i

Mclk1

+/- Mutanter

Evaluering nogen effekt af

Mclk1

+/- mutant genotype på kræft er interessant af to grunde:

i

) kræft er helt klart en aldersafhængig sygdom og

ii

) kræft sats menes at blive holdt lav ved mekanismer immun overvågning. For at teste den mulighed, at fænotype af

Mclk1

+/- mutanter påvirker udviklingen af ​​kræft vi konstrueret en

Mclk1

+/-

Trp53

+/- dobbelt mutant stamme på C57BL /6J baggrund.

Trp53

+/- mutanter spontant udvikler tumorer, især sarkomer, efter ca. et år [26]. Vi producerede grupper af

Trp53

+/- (n = 20) og

Mclk1

+/-

Trp53

+/- ( n = 37) kvinder ved at krydse

Trp53

– /- hanner til

Trp53

+/-

Mclk1

+/- hunner. Vi undersøgte overlevelsen af ​​disse dyr og målt størrelsen af ​​synlige sarkomer på dødstidspunktet. Den gennemsnitlige og maksimale levetid de dobbelte mutanter blev øget i forhold til

Trp53

+/- dyr (figur 5A), der tyder på en langsommere initiering eller væksten af ​​tumorer. Men den generelle forekomst af sarkom udvikling var sammenlignelig mellem de to genotyper (ikke vist) og vægten af ​​sarkomer, der kunne identificeres ved obduktion viste kun en tendens til mindre tumorer i de dobbelte mutanter (Figur 5B). Dog kan disse resultater stadig pege på langsommere tumor initiering eller vækst, fordi tumorer blev scoret ved obduktion og dobbelt mutanter overlevede længere, hvilket indebærer, at dyrene havde mere tid til at udvikle tumorer tilstrækkeligt store til at score.

A. Kaplan-Meier overlevelseskurverne for

Mclk1

+ /+

Trp53

+/- (n = 20) og

Mclk1

+ /-

Trp53

+/- (n = 37) mus. Betydningen af ​​forskellen var P 0,05 ved log-rank (Mandel-Cox) test med GraphPad Prism version 5.00 til Windows (GraphPad Software, San Diego). B. Lodder af spontan sarkom scorede ved obduktion af dyrene i A., og udtrykt som procent af kropsvægten;

Mclk1

+ /+

Trp53

+/- (n = 9) og

Mclk1

+/-

Trp53

+/- (n = 19). C. Legemsvægte over tid af dyrene i A. D.-F. En kohorte adskiller sig fra dyrene i A. blev analyseret for tegn på kakeksi;

Mclk1

+ /+

Trp53

+/- (n = 12) og

Mclk1

+/-

Trp53

+/- (n = 8). Alle mus blev aflivet på human vis ved 54 ugers alderen. Bagben muskel vægt blev målt og udtrykt som forhold til legemsvægt (D). MRNA ekspressionsniveauer af to muskelgrupper specifikke E3 ubiquitin ligaser, Atrogin-1 og MuRF1, blev målt ved RT-PCR, der er vist i (E) og (F) hhv. Betydning for den aldrende kurverne blev etableret af en log-rank test. De signifikansniveauer for dataene i B. og D.-F. blev testet ved t-test, med stjernerne står for p 0,05. Alle forsøg i denne figur blev udført med kun kvinder.

Trp53

+/- mutanter brat begyndte at tabe efter 54 uger, formentlig på grund af tumor-induceret kakeksi , men denne virkning var langt mindre alvorlig i de dobbelte mutanter (Figur 5C). For at undersøge dette spørgsmål yderligere vi producerede to yderligere grupper af

Trp53

+/- (n = 12) og

Mclk1

+/-

Trp53

+/- (n = 8) dobbelt mutanter. Ved 54 ugers alderen, umiddelbart før den observerede begyndelsen af ​​vægttab i den indledende eksperiment undersøgte vi parametre associeret med kakeksi, såsom muskel vægt og ekspressionen af ​​cachexia-associerede gener i muskler, såsom de der koder for muskel-specifikke ubiquitin ligaser MuRF1 (

Trim63

) [27] og Atrogin-1 (

Fbxo32

) [28] (Figur 5E-F). Muscle vægt var højere i de dobbelte mutanter, og

MuRF1

Atrogin-1

genekspression var lavere. Bemærk, at den langsommere udvikling af kakeksi er i overensstemmelse med begrebet en langsommere initiering og vækst af tumorer.

Direkte Beviser for forsinket tumor Initiation i

Mclk1

+/- Mutants

for at få mere direkte bevis for en effekt af

Mclk1

+/- på tumor initiering og vækst, vi brugte en model [29], hvor 10

4 Lewis lungecarcinomceller ( LLC1 celler, aka 3LL celler) podet subkutant i 3 måneder gamle mutanter og kontroller (figur 6A). Med denne model fandt vi, at tumor initiering blev betydeligt forsinket i

Mclk1

+/- mutanter (figur 6B). En tendens mod lavere tumorincidensen blev også observeret, men var ikke signifikant (ikke vist). Imidlertid havde engang en synlig tumor optrådte tumor vækst ikke var forskellig i de to genotyper (figur 6C).

A. LLC1 mus lunge kræftceller blev injiceret subkutant i den rigtige overnationale skulderblad areal på 10 uger gamle

Mclk1

+/- mutanter (n = 19) og søskende kontroller (n = 18) i C57BL /6J baggrund i en dosis på 10

4 celler /mus. Tidspunktet for første forekomst af synlige tumorer blev registreret, og deres vækst efterfølgende fulgt. Panelet illustrerer tumorstørrelser på dag 28 efter inokulering. B. Gennemsnitlig dag tumor udseende efter podning på begge genotyper. Stjernerne viser signifikans ved p 0,01 ved en t-test. C. Tumor vækstkurver afslører igen forskellen i latency, men viser også lignende vækstrater, når tumorer er dukket. Data efter dag 28 er ikke tilgængelige for tumorer på vild type dyr, fordi disse dyr måtte humant aflives på grund af tumorstørrelse. D. To kohorter af 8-12 mus for hver genotype blev anvendt til måling milten lymfocyt cytotoksicitet over LLC1 celler in vitro efter 15 og 20 dage efter inokulering. Middelværdien ± S.E.M. af hver gruppe er vist. Stjernerne viser signifikans ved p 0,05 ved en t-test. Alle forsøg i denne figur blev udført med lige numre af både hanner og hunner.

Forbedret immunreaktion mod tumorceller i

Mclk1

+/- Mutanter

Vi søgte at afgøre, om immunforsvar spillet en rolle i tumoren latenstid fænotype af

Mclk1

+/- mutanter observeret i podning model. Cytotoksiske CD8 + T-celler antages at deltage i den immunreaktion mod kræftceller [30], [31]. Således har vi ekstraheret miltlymfocytter fra graft værter, isolerede CD8 + T-celler ved magnetisk perle separation og testet deres cytotoksicitet over LLC1 celler in vitro [29], [32]. Efter både 15 og 20 dage efter podning af cytotoksicitet af lymfocytter fra

Mclk1

+/- var større end for kontrollerne (figur 6D). På dag 15 og dag 20 var der ingen eller kun meget små tumorer på disse dyr (i lighed med det, vi observerede i kohorten vist i figur 6C). Dette tyder på, at forskellen i immunsystemet reaktivitet mod de podede celler, hvilket fører til mere eller mere aktive, cytotoksiske effektorceller kunne være ansvarlig for forsinkelsen i tumor initiering.

Diskussion

Vi har tidligere vist, at

Mclk1

+/- mutanter opretholde høje mitokondriel oxidativ stress som unge dyr [16], [17]. Det var en overraskelse, fordi

Mclk1

+/- mutanter alder langsomt, som vurderet af biomarkører for aldring, og kan være langlivet, mens mitROS generelt er blevet anset for at være skadelig og muligvis en årsag til aldrende. I lyset af de mange fund, som ROS er signalmolekyler, og at dyr som nøgne muldvarp-rotter kan være langlivede trods forhøjet oxidativt stress [33], [34], vi har fortolket vores resultater til at betyde, at mitROS ikke forårsager aldrende men kunne i stedet være forbundet med aldring, fordi de fungerer som signalmolekyler, som tændes beskyttelsesmekanismer som reaktion på aldersbetinget molekylære skader [35], [36]. I vores efterfølgende søgen efter mitROS-afhængige beskyttende mekanismer afsløret vi, at immunsystemet af

Mclk1

+/- mutanter blev aktiveret, og meget reaktive, eventuelt via stabilisering af HIF-1α af mitROS i lever og i makrofager og muligvis i andre væv [13].

Den høje mitokondrie oxidativt stress i

Mclk1

+/- mutanter kan ikke i sig selv være ansvarlige for deres gunstige fænotype, som sænker oxidative stress i mitokondrierne kan producere gavnlige fænotyper [37], og som

Sod2

+/- mutanter, som har en mitokondrie fænotype meget lig den af ​​

Mclk1

+ /- mutanter [17], viser ikke den samme langsomme udvikling af biomarkører for aldring [17]. Her viser vi desuden, at

Sod2

+/- mutanter, i modsætning til

Mclk1

+/- mutanter, viser ikke en overdreven stigning af plasma-TNF-α som reaktion på LPS, eller lav fibrose (figur 4). Forskellen mellem de virkninger, høj mitokondriel oxidativ stress har i

Mclk1

+/- og

Sod2

+/- mutanter kan være forbundet med den rolle, MCLK1 i UQ biologi. Faktisk har vi for nylig fundet, at

Mclk1

+/- mutanter har lave UQ niveauer i den indre mitokondrielle membran, som sandsynligvis er ansvarlig for den mitokondriske fænotype, men også viser forhøjede UQ niveauer i den ydre mitokondriemembran , som kunne ændre, hvordan mitROS signal til resten af ​​cellen [15].

Her har vi spurgt, om det ændrede immunrespons i

Mclk1

+/- mutanter er i virkeligheden beskyttende og dermed kunne deltage i at fremme levealderen. I vores tidligere undersøgelse [13] vi hovedsagelig udforsket inflammation. For eksempel testede vi virkningen af ​​LPS på cirkulerende cytokiner to timer efter behandlingen.