PLoS ONE: miR-19, miR-345, miR-519c-5p serumniveauer Forudsige Adverse Patologi i prostatacancerpatienter Berettiget til Active Surveillance

Abstrakt

Serum microRNA’er holder meget lovende som lettilgængelige og målbare biomarkører for sygdom. I prostatakræft, har serum miRNA signaturer været forbundet med tilstedeværelsen af ​​sygdom samt korreleret med tidligere validerede risikomodeller. Men det er uklart, om miRNA kan give uafhængig prognostisk information ud over de nuværende risikomodeller. Her fokuserer vi på en gruppe af prostatakræft lav risiko patienter, der var berettiget til aktiv overvågning, men valgte kirurgi. Et vigtigt kriterium for den kategori lav risiko er en Gleason score på 6 eller lavere baseret på præ-kirurgisk biopsi. en tredjedel af disse patienter er imidlertid opgraderet til Gleason 7 på post kirurgisk patologisk analyse. Både i en opdagelse og en validering kohorte, finder vi, at pre-kirurgiske serumniveauer af miR-19, miR-345 og miR-519c-5p kan hjælpe med at identificere disse patienter uafhængigt af deres pre-kirurgiske alder, PSA, scene, og procent biopsi involvering. En kombination af de tre miRNA forøgede området under en modtager operatør egenskaber kurve 0,77-0,94 (

s

0,01). Også, når den kombineres med CAPRA risikomodellen miRNA signatur signifikant forøget forudsigelse af patienter med Gleason 7 sygdom. In-situ hybridiseringer af matchende tumorer viste miR-19 opregulering i transformerede versus normalt udseende tumor epitel, men uafhængig af tumor kvalitet tyder en alternativ kilde til stigningen i serum MIR-19a /b niveauer eller frigivelse af allerede eksisterende intracellulære miR -19a /b ved progression. Sammen disse data viser, at serum miRNA kan forudsige relativt små skridt i tumor progression forbedre evnen til at forudsige risiko for sygdom og dermed potentielt køre kliniske beslutninger i patienter med prostatacancer. Det vil være vigtigt at validere disse resultater i en større multi-institutionelle undersøgelse samt med uafhængige metoder

Henvisning:. Wang SY, Shiboski S, Belair CD, Cooperberg MR, Simko JP, Stöppler H, et al . (2014) miR-19, miR-345, miR-519c-5p serumniveauer Forudsige Adverse Patologi i prostatacancerpatienter Berettiget til Active Surveillance. PLoS ONE 9 (6): e98597. doi: 10,1371 /journal.pone.0098597

Redaktør: Fabio Martelli, IRCCS-Policlinico San Donato, Italien

Modtaget: August 12, 2013; Accepteret: 5 maj 2014; Udgivet: 3 juni 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af National Institutes of Health R21 CA161615 og en privat donation af John og Donna Shoemaker. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mens prostata specifikt antigen (PSA) -screening er faldet PCA dødelighed i USA, det har gjort det på bekostning af at opdage tidligt stadium /stilling PCa der måske ikke påvirke en patients liv, hvis ubehandlet (overdiagnostik) [1] – [4]. Behandling dem med sygdom resulterer lav risiko i unødvendige følgesygdomme forbundet med radikale indgreb såsom kirurgi eller strålebehandling (overbehandling) [5].

Aktiv overvågning (AS) er en strategi udviklet til at reducere behandlingen af ​​patienter med lav risiko PSA. Sådanne patienter overvåges med fysiske eksamener, selektiv billeddannelse, PSA vurderinger serielle og gentagne biopsier. Behandlingen derefter tilbydes til dem med tegn på progression. Kandidater til aktive overvågningssystemer protokoller omfatter dem med en biopsi Gleason karakteren 6 eller derunder (uden mønster 4 eller 5), PSA 10 ng /ml eller mindre, og scene T1 eller T2 sygdom [6]. Selvom beviser fra flere institutioner viser, at AS er en farbar vej for mænd med lav risiko PCa, er der betydelige misklassifikation satser, når identificere kandidater til AS [6], [7]. I en undersøgelse af patienter, der opfylder kriterierne for AS, men undergik øjeblikkelig radikal prostatektomi 28% viste sig at have en højere Gleason kvalitet og 21% viste sig at have T3 sygdom på kirurgisk patologi [8].

Flere risikomodeller beregnet at forudsige post-kirurgisk patologi hos patienter med lav risiko ved hjælp af kliniske karakteristika såsom alder, PSA, scene, omfanget af tumor inddragelse i biopsier er blevet udviklet. Men de demonstrerer en nøjagtighed på kun 61-79% komplicerer beslutningsprocessen [9]. På grund af de begrænsninger af PSA som et surrogat for sygdomsprogression og betydelige legitime bekymringer om biopsi fejl prøveudtagning, både patienter og klinikere bekymre sig, at forsinket behandling kompromiser evnen til at helbrede sygdomme [10]. Nye markører, der pålideligt skelner mellem lav risiko versus mellemliggende /høj risiko for sygdom ville være en løsning til at optimere AS protokoller.

Voksende tyder mikroRNA (miRNA) som potentielt lovende markører for forskellige maligniteter [11]. Disse små, enkeltstrengede, ikke-kodende RNA-molekyler er involveret i post-transkriptionel genregulering og har en ændret ekspression profil i PCa væv [12] – [14]. Derudover har miRNA detekteret i serum blevet anvendt til at identificere patienter med PCa, hvilket antyder deres potentiale som en del af et panel af serumbaserede markører [15], [16]. Tidligere brugte vi en mikrofluid-baserede multipleks kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion (QRT-PCR) metode til at identificere serum miRNA signaturer hos mænd med PCa der forbinder med den validerede Kræft i prostata Risikovurdering (Capra) score for risikovurdering [17 ]. Men dette tidligere undersøgelse ikke afgøre, om nogen af ​​disse miRNA kunne give uafhængig prognostisk værdi. Derfor her sigter vi til at identificere et serum miRNA signatur, kunne underkoder pre-kirurgiske patienter med vurdering scoringer lav risiko i dem med større eller mindre risiko for progression. På grund af den lange opfølgning kræves for at identificere patienter, der er klinisk fremskridt og relativt kort periode, hvor AS har i praksis været, evaluerede vi postkirurgisk patologi som en surrogatmarkør. Vi fandt en tre miRNA signatur, kunne forudsige værre patologisk sygdom end antaget baseret på præ-kirurgisk biopsi. Vi foreslår, at en sådan signatur har potentiale til at identificere et stort antal patienter, som næppe vil drage fordel af øjeblikkelig operation (dvs. lav klinisk score kombineret med et fravær af en positiv miRNA signatur), selv om en sådan konklusion venter et større tværinstitutionelt studie med langsigtet opfølgning.

Materialer og metoder

Etik Statement

Serum og vævsprøver samt kliniske data blev indsamlet mellem 2002 og 2012. Alle patienter forudsat skriftligt samtykke til at have deres prøver og forbundne kliniske data opsparede for kliniske og basale forskningsformål. Det UCSF Udvalget om menneskelige Forskning godkendt samtykke processen. Til denne undersøgelse blev alle prøver og data de-identificeret, og derfor ikke kræver nogen yderligere IRB godkendelse.

Study Design

Undersøgelsen design fulgt princippet om potentielle prøveindsamling og retrospektiv blindet evaluering (probe) design [18] og rapporteret efter bemærkningen retningslinjer [19]. Alle serumprøver blev indsamlet rutinemæssigt på tidspunktet for kirurgi efter induktion af anæstesi, men før nogen processuel intervention og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Formalin-fikseret, paraffin-indstøbt (FFPE) radikal prostatektomi væv blokke blev arkiveret og tilgængelige for analyse.

Patienter inkluderet i undersøgelsen var der vælger øjeblikkelig radikal prostatektomi, som opfyldte UCSF lav risiko for AS herunder biopsi Gleason 2-6 (intet mønster 4 eller 5), PSA mindre end 10 ng /ml, under 34% af biopsi kerner involveret, mindre end 50% andel i en enkelt kerne, og klinisk T1-T2 stadie sygdom. En patologisk Gleason score på 7 af højere er forbundet med en øget risiko for PCa dødelighed [20], og derfor blev anvendt til at definere negative patologi. Opdagelsen kohorte bestod af 48 patienter med en post-kirurgisk patologiske Gleason score på 7 eller højere (case gruppe) og 48 patienter med patologisk Gleason score på 6 (kontrolgruppe). En validering kohorte bestod af 25 tilfælde og 35 kontroller. Patienterne blev udvalgt fra tilgængelige prøver opretholdt i en UCSF vævsbank. Patienter montering ovennævnte kriterier blev udvalgt fra den tilgængelige pulje baseret på et tilfældigt heltal generator. En skematisk af undersøgelsen design er afbildet i figur 1.

Mikrofluidik baseret multiplex QRT-PCR profilering af miRNA

Mikrofluidapparat-baserede multipleks QRT-PCR-fremgangsmåden blev anvendt til at detektere miRNA som tidligere beskrevet [17]. Biblioteker for 672 hårnåle-primere, fremadrettede primere og Taqman-prober repræsenterer mest kendte humane miRNA sekvenser (sekvenser ved https://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols/miRNAqPCRsequences.txt) blev anvendt. Hver mikrofluid vifte evalueret udtryk for 96 miRNA i 96 prøver. I alt 7 arrays blev udført på opdagelsen kohorten (672 miRNA assays). En række blev udført på validering kohorten kun at fokusere på disse miRNA fundne (se nedenfor) i opdagelsen kohorte.

Amplification plots og tærskel cyklus (Ct) værdier, et mål for antallet af PCR-cykler for at nå en tærskel linje sæt inden den eksponentielle fase af forstærkning, blev opnået fra proprietær software på BioMark systemet (Fluidigm). En højere Ct afspejler lavere input af den målte miRNA. Ct-værdier blev bekræftet gennem kvalitet analyse af amplifikationsprodukter plots. MiRNA med en høj Ct-værdi (Ct 30) i 70% af prøverne blev anset uopdaget og udelukket fra analysen. Normalisering blev udført midterplan Ct værdien af ​​alle detekterede miRNA inden et array for hver enkelt patient, hvilket resulterer i en ACt-værdi (tabel S1-2). Normalisering blev udført for at redegøre for systematiske variationer i miRNA ekspressionsniveauerne tværs enkeltpersoner og arrays, så biologiske forskelle kan være mere let at skelne [21]. Men analyse af ikke-normaliserede data, der kontrolleres for mængden af ​​input serum førte til analoge resultater. Identiteten af ​​prøverne blev maskeret indtil ACt værdier blev opnået.

Statistisk analyse

De første analyser sammenlignet fordelinger af normaliserede ACt værdier fra miRNA mellem tilfælde og kontroller i opdagelsen prøve ved hjælp af grafiske oversigter og Wilcoxon rank-sum test for at vurdere signifikans. Logistik regressionsmodeller blev derefter monteret på kandidat miRNA enkeltvis, korrigeret for alder, PSA, scene, og graden af ​​biopsi involvering herunder procent kerner tumor positive og procent af samlet længde kerner involveret. Kandidat miRNA indgik i modeller både som løbende foranstaltninger, og som binære kategoriske variable. Cut-off værdier for sidstnævnte blev bestemt ved hjælp af separate klassifikation træ modeller eller medianen for hver miRNA. Begge cut-offs gav lignende resultater.

Forudsigelse udførelsen af ​​modeller blev skelnes ved hjælp af receiveren opererer karakteristik (ROC) areal under kurven (AUC) værdier. En separat analyse baseret på en tilfældig skov klassifikation model [22] blev også udført herunder alle påviselige miRNA samt alder, PSA, scene og graden af ​​biopsi engagement som prædiktorer. Resultaterne af denne analyse blev brugt til at give en uafhængig vurdering af variabel betydning, og for bekræftelse af resultaterne fra de enklere logistiske modeller

For validering kohorte, kun de miRNA, der blev fundet i . 30% af prøverne i opdagelsen kohorten blev målt. Normalisering til alle registrerede miRNA kører på et enkelt array ændret bredden ofΔCt værdier for en given miRNA, ofte forbedre forskelle mellem sager og kontroller. Analytiske fremgangsmåder beskrevet ovenfor for opdagelse blev ligeledes anvendt i valideringen kohorte. Afsluttende analyser fokuseret på miRNA detekteres som signifikante prædiktorer i opdagelsen kohorte, der også var betydelige i valideringen sæt. Kun markører med justeres

s

-værdier (baseret på falske opdagelse sats metoder) på højst 0,1 i discovery analyser blev overvejet. Disse blev modelleret enkeltvis og i fællesskab i logistiske regressionsmodeller også kontrollerer for de samme karakteristika betragtes i analyser for opdagelsen kohorte. Derudover undersøgte vi brug af udvalgte miRNA at supplere velvalideret CAPRA score [23] som et indeks risiko for sygdom som beskrevet mere detaljeret i resultaterne.

Yderligere beskrivende analyser blev udført for at sammenligne valgte patient egenskaber mellem opdagelse og validering kohorter. Formel test var baseret på Fishers eksakte test (for kategoriske egenskaber) og Wilcoxon rank-sum test (for kvantitative egenskaber).

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af R (version 3.02) og Stata (version 13.1). Salg

In-situ hybridiseringer

Slides med afsnit (5 um) i FFPE tumor prøver fra patienten kohorte blev afparaffinerede i xylen og hydreret gennem faldende ethanolkoncentrationer i PBS. Objektglassene blev derefter behandlet med 300 pi proteinase-K (15 ug /ml i PK buffer, 5 mM Tris-HCI pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCI) ved 37 ° C i en Hybridizer’en (Dako) i 10 minutter . Efter to gange vask med PBS, blev sektionerne dehydreret gennem stigende ethanolkoncentrationer og lufttørret i 15 minutter. Dobbelt DIG-mærkede låste-nukleinsyre (LNA) prober (Exiqon) for individuelle miRNA blev denatureret ved opvarmning ved 90 ° C i 4 minutter og derefter fortyndet til 40 nm ved anvendelse af in situ hybridisering buffer (Enzo Life Sciences). Snittene blev hybridiseret med 50 pi fortyndet probe ved 54 ° C natten over, derefter vasket i aftagende SSC koncentrationer ved hybridiseringstemperatur. Efter en 5 minutters inkubering i 0,2 x SSC ved stuetemperatur, blev objektglassene vasket i PBS og blokeret med 2% blokerende opløsning (Roche) i 15 minutter. Snittene blev derefter behandlet med alkalisk phosphatase (AP) -konjugeret anti-DIG (Roche) fortyndet 1:800 i blokerende opløsning indeholdende 2% fåreserum i 60 minutter. Efter to vaske i AP puffer (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCI2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20, 2 mM levamisol), blev sektionerne inkuberet i BM Purple AP-substrat (Roche) i mørke ved 4 ° C natten over. Objektglassene blev derefter vasket to gange i PBS indeholdende 0,1% Tween-20 og vasket to gange i vand. Efter en 30 sekunders behandling med Nuclear-Fast Red (Vector), dias var dehydreret selvom stigende ethanolkoncentrationer derefter monteret. De farvede objektglas blev evalueret og sorteres blindt.

Resultater

miRNA i Discovery Kohorte

Vi havde til formål at afgøre, om miRNA fra pre-kirurgiske serumprøver kunne forudse post-kirurgisk patologisk opgradering. Kliniske karakteristika for patienter i vores opdagelse kohorte er opsummeret i tabel 1. Sag (postkirurgisk Gleason 7) og kontrol (postoperativ Gleason 6) grupper havde lignende fordelinger af race og kliniske karakteristika. Sager var væsentligt ældre end kontroller (

s

= 0,005). PSA niveauer også var noget højere i de tilfælde (

s

= 0,07). Af de 672 miRNA testede, 36 havde Ct 30 i mindst 30% af patienterne, som vi etableret som en cutoff for afsløring (tabel 2). Der findes mange miRNA som klynger, hvor to eller flere miRNA er fremstillet af en enkelt udskrift. Ni af de 36 miRNA er medlemmer af en enkelt klynge, den miR17-92 klyngen. MiRNA er også grupperet i familier baseret på en fælles sekvens på deres 5 ‘enden kaldes frø sekvens, som i vid udstrækning definerer deres downstream mål [24]. MIR-17, MIR-20a, MIR-92a, og MIR-106a, for eksempel, er alle del af én familie. Derfor tværs af alle disse PCA patienter, der var en tilsyneladende berigelse for specifikke klynger og familier af miRNA.

Vi næste sammenlignede serumniveauer af 36 detekterede miRNA mellem sagen og kontrolgrupperne af opdagelsen kohorte. Fire af de fundne miRNA viste forskelle i serum niveauer mellem de sager og kontroller. MIR-19a og miR-19b viste lavere ACt værdier i tilfælde gruppen sammenlignet med kontroller (figur 2a,

p

= 0,06 og

s

= 0,07 henholdsvis), i overensstemmelse med højere serumniveauer i tilfælde. Omvendt miR-345 og miR-519c-5p havde signifikant højere ACt værdier i case gruppe sammenlignet med kontrollerne (figur 2a,

s

= 0,04 og

s

= 0,02 henholdsvis) overensstemmelse med lavere serumniveauer i behandlingsgruppen. Logistik regressionsmodeller til forudsigelse case /kontrol status baseret på enkelte miRNA repræsenteret som binære indikatorer (med afskæringsværdier udvalgte hjælp klassificering træer) viste alle fire miRNA som meget væsentlige prædiktorer for udfaldet status (odds ratio), selv når de kontrollerer for alder, PSA , kliniske stadium, og graden af ​​biopsi involvering (tabel 3). Resultater ikke var følsomme over for, om miRNA indgik i forudsigelsesmodeller som kontinuerlige variabler eller som binære indikatorer baseret på median påviselige niveauer (data ikke vist). En parametrisk tilfældig skov klassificeringen herunder alle påviselige miRNA (repræsenteret løbende foranstaltninger) samt alder, PSA, scene og biopsi involvering rangeret følgende prediktorvariabler som de seks vigtigste (i prioriteret rækkefølge): alder, miR-519c-5p , miR_19b, miR-345, PSA og miR_19a (figur 3). Ingen af ​​de andre målte miRNA var signifikant forbundet med udfaldet status.

Delta Ct repræsenterer forskellen mellem Ct enkelte miRNA og median Ct værdi blandt fundne miRNA inden for hver patient. Vandrette bjælker repræsenterer middelværdien +/- SEM.

Medfølgende variabler er noteret på den lodrette akse, med tilsvarende variabel betydning for hver på den vandrette akse, er Vigtigheden bestemmes ved hjælp af “betinget permutation nøjagtighed”, beregnet som en den gennemsnitlige forskel i model nøjagtighed mellem den model, og alternative versioner opnået via tilfældige permutationer af de variable værdier. Variabler som væsentlige prædiktorer i tilfældig skov, hvis deres variable betydning værdi over den absolutte værdi af den laveste negative-scoring variabel [43].

Validering af miRNA signatur i selvstændig kohorte

for at bekræfte vores miRNA foreninger, udførte vi en valideringsundersøgelse kun at fokusere på de miRNA, der var foranstaltning mindst 30% af patienternes serumprøver (tabel 2). De patientkarakteristika for validering kohorten er sammenfattet i tabel 1. I lighed med opdagelsen kohorte, var der ingen statistisk signifikante forskelle i løb, eller klinisk fase mellem cases og kontroller, mens forskelle i alder og PSA var signifikant (

p

= 0,002 og 0,04 henholdsvis). Som det ses i opdagelsen kohorte, miR-19b og miR-19a viste signifikant lavere ACt værdier i tilfælde sammenlignet med kontrollerne (figur 2B). Faktisk var forskellene endnu mere slående i valideringen kohorten (

s

0,001 for begge), sandsynligvis på grund af normaliseringen baseret på alle registrerede miRNA på en enkelt array (versus spredt på tværs af flere arrays i discovery kohorte) . I modsætning til miR-19b og miR-19a, forskellene i ACt-værdier for miR-345 og miR-519c-5p mellem cases og kontroller var ikke statistisk signifikant (figur 2b,

s

= 0,333 og

s

= 0,154, henholdsvis). Men i modeller justering for alder og PSA, miR-345 og miR-519c-5p fortsat betydelig, når inkluderet som binære prædiktorer (se nedenfor). Resultaterne for analyser, herunder miR-519c-5p var baseret på 55 patienter (24 sager og 31 kontroller) på grund af manglende værdier for denne variabel som følge af mislykkede PCR reaktioner hos 5 patienter.

prognostiske værdi af tre-miRNA signatur

for at vurdere evnen af ​​de bekræftede miRNA at diskriminere patienter med negativ patologi i valideringen sæt, blev de medtaget i logistiske regressionsmodeller også justering for alder, scene, PSA, og omfanget af biopsi engagement. Når betragtes individuelt, viste alle fire miRNA stærke foreninger med tilfælde status, med odds ratio på 9,22, 12,67, 0,03 og 0,06 (

s

værdier 0,01) (tabel 3), men på grund af den relativt lille stikprøve størrelse, konfidensintervaller for estimerede odds ratio viste lav præcision. Disse miRNA individuelt også viste forbedret diskriminerende evner med AUC for 0,85, 0,86, 0,84, og 0,83 i forhold til en AUC på 0,77 for en model kun indbefatter alder, PSA, stadium, og biopsi involvering (tabel 3). Disse forbedringer nåede ikke signifikans på 5% niveau (selvom resultater for MIR-19b og MIR-345 var signifikant på 10% niveau). Næste vi evaluerede modeller under anvendelse af forskellige kombinationer af miRNA (tabel 4). Især MIR-19a og MIR-19b syntes at være co-afhængig, stemmer overens med, at de udtrykkes fra en fælles transkript, MIR-17-92. Modeller, der består af en kombination enten MIR-19a eller MIR-19b sammen med MIR-345 og MIR-519c-5p viste en AUC på 0,94 og nåede høj signifikans (

s

= 0,02 og 0,017 henholdsvis) (tabel 4 og figur 4a).

A) ROC kurver til alder, PSA, og scene plus /minus individuelle miRNA eller en kombination af alle 3 miRNA. B) Procentdel af patienter med enten Gleason 6 (lysegrå) eller Gleason 7 (mørkegrå) post-kirurgi i forhold til at pre-kirurgi CAPRA score. C) Samme som B, men med tilsætning af miRNA. En værdi på 1 er givet for hver positiv miRNA og tilføjet til CAPRA score. CAPRA nomogram kombinerer følgende variabler: Alder ved diagnose, PSA på diagnose, Gleason score på præ-kirurgisk biopsi, Klinisk fase, og Procent af involverede biopsier

For at identificere en scoring. mekanisme tilgængelig for læger og deres patienter, vi vurderet nytten af ​​at tilføje miRNA værdier til en etableret risiko modellen, CAPRA score [23]. Især vores kohorte havde lave CAPRA scores (lige 0-2 ud af 10), som forventes for AS-egnede patienter. Ved at tilføje et punkt til scoren for hver af de tre miRNA (miR-19a eller 19b, miR-345, og miR-519c-5p), der blev observeret at overstige den binære cutoff værdi, kunne patienterne adskilles i dem tilbøjelige til at have Gleason 7-og dermed mellemliggende risiko-sygdom versus dem, der ikke gjorde (figur 4b-c). Den lineære tendens var stærkt signifikant (

s

0,001). Faktisk 100% af patienter med en score på 4 eller 5 havde Gleason 7 sygdom post-kirurgisk versus 7 ud af 24 patienter med snesevis af 1 eller 2.

oprindelse serum miRNA

udækkede serum miRNA kan opstå direkte fra tumoren eller fra kroppens reaktion på tumoren. For at afgøre, om de prædiktive miRNA er til stede i prostata tumorer, vi udført in situ hybridisering med prober for miR-19b på FFPE tumor prøver fra patienter i vores kohorte (

n

= 10). Vi fokuserede på miR-19b, som det nåede signifikans i både forsknings- og validering sæt. Bemærk, at MIR-19b probe er usandsynligt at diskriminere mellem MIR-19a og MIR-19b på grund af deres meget lignende sekvenser. Farvning for miR-19b var stærk i områder med høj kvalitet PIN, Gleason mønster 3, og Gleason mønster 4, men fraværende i normalt udseende epitel (figur 5). Der var imidlertid ingen indlysende forskel i intensiteten af ​​farvning med stigende grad fra pinkode til Gleason mønster 4. Derfor, mens MIR-19 cellulære niveauer klart øget med transformation, var det uklart, om der var nogen yderligere stigning i cellerne med patologisk progression.

billederne viser in situ hybridisering farvning for miR-19b (venstre og center paneler) og negative kontrol, miR-295 (højre paneler). Top paneler viser område prostata intraepitelialneoplasi (PIN). Middle paneler viser område Gleason 3. Bottom paneler viser område Gleason 4. Områder med PIN-kode, Gleason 3, og Gleason 4 alle pletten stærkt for miR-19b sonde (blåfarvning). Bemærk hvert panel har området normalt udseende epitel, mest tydeligt ses på venstre side af hvert center panel. Disse områder viser meget lavere farvning. Højre og venstre paneler, 100 × forstørrelse. Center-paneler, 400 × forstørrelse. Center-paneler repræsenterer boxed områder i venstre paneler.

Diskussion

Som post-transkriptionelle regulatorer af genekspression, miRNA fungerer som både onkogener og tumor undertrykkere [25], [26]. Afvigende miRNA signatur er blevet påvist i prostata tumorprøver og er blevet påvist i serum hos mænd med PCa [12] – [16], [27], [28]. Vi har tidligere identificeret en miRNA signatur i forbindelse med patientens risiko beregnet ved CAPRA scoringer, der forudsiger metastaser, PCa dødelighed og dødelighed [17]. Men ingen af ​​disse tidligere undersøgelser rettet om miRNA kunne give yderligere oplysninger ud over, hvad der kan forudsiges af nuværende parametre, herunder PSA, billedbehandling, og biopsi. Her har vi opdaget og valideret fire serum miRNA, miR-19a, miR-19b, miR-345, og miR-519c-5p som i kombination og når de tilsættes til de aktuelle parametre, væsentligt forbedret forudsigelse af uønskede patologi i prostata. Individuelt, kun miR-19a /b nåede signifikans i både forsknings- og validering sæt.

En prædiktiv model herunder alder, PSA, scene, og biopsi involvering viste en AUC-værdi på 0,77 i at identificere uønskede patologi i post- kirurgiske prøver, tilsætning af 3 miRNA (mIR-19a eller mIR-19b plus mIR-345 og mIR-519c-5p) demonstrerede en AUC-værdi på 0,94. Desuden inddragelse af miRNA signatur i et aktuelt anvendte score risiko (CAPRA) forbedret forudsigelse af post-kirurgisk opgradering støtter dens kliniske anvendelighed. Disse forbedringer er den første demonstration til vores viden om den uafhængige prædiktiv værdi for serum miRNA over tiden tilgængelige klinisk-patologiske foranstaltninger i et yderst relevant scenario. Mens næsten 50% af nydiagnosticerede patienter nu opfylder kriterierne for lavrisiko-til AS-protokoller, kun 10% af disse patienter undergår AS [29], [30]. Under yderligere markører, der yderligere kan adskille patienter vil være afgørende for at forbedre disse numre.

Serum-baserede markører er fordelagtig, da sådanne tests er relativt ikke-invasiv og kan nemt anvendes til at overvåge patienter. Markers opnået fra serum undgå bekymringer biopsi sampling fejl, hvilket er en væsentlig begrænsning af væv assays [31], [32]. Oprindelsen af ​​miRNA i human serum stort set uklar. In situ hybridisering på prostata prøver fra patienter i vores kohorte viste tilstedeværelsen af ​​miR-19b i alle områder af transformeret epitel fra høj kvalitet PIN til Gleason 4 mønster. I modsætning lidt til ingen farvning sås i stroma eller normalt udseende epitel. Tilstedeværelsen af ​​MIR-19b inden det lavkvalitets tumorvæv, men formindskede niveauer i tilsvarende serum rejser spørgsmålet om kilden til miRNA i serum fra patienter med højere kvalitet tumorer. En spændende mulighed er, at MIR-19b kun udskilles ved progression, selvom det udtrykkes i de transformerede celler tidligt i tumorudvikling. Alternativt kan cellerne behøver at bryde strukturelle elementer i vævet for MIR-19b at nå blodet. Endelig kan miRNA stammer fra kroppens reaktion på tumoren (fx immunrespons). Sammenfattende de cellulære oprindelse til ændringerne i miRNA niveauer i serum med patologiske progression er endnu ikke fastslået.

MIR-19 er en del af gruppen af ​​miRNA forarbejdet fra en enkelt afskrift, miR-17-92 klynge [9]. Denne klynge giver seks modne miRNA (MIR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b, MIR-92) og er placeret på 13q31.3, en region forstærket i flere hæmatopoietisk og solide tumorer maligniteter [ ,,,0],33] – [35]. I en B-celle lymfom modellen, overekspression af

MIR-17-92

på

c-myc

fremmer tumordannelse, hvilket viser den onkogene aktivitet af klyngen [35]. MIR-19 synes at være en væsentlig onkogen bestanddel af

MIR-17-92

ved at målrette tumor suppressor,

PTEN

, hvilket resulterer i aktivering af Akt-mTOR pathway [36], [ ,,,0],37]. I betragtning af den veldokumenterede rolle

PTEN

i prostatakræft, og at ændringen er fundet i 30-70% af patienterne på tidspunktet for diagnosen, forekommer det meget sandsynligt, at forhøjelse af miR-19a MIR-19b set i vævet er funktionelt associeret med tumorudvikling [38] – [40]

Andre serum miRNA, der afviger fra dem udækkede her har vist sig at være forhøjet hos patienter med prostatacancer.. Et særligt spændende eksempel er Mir-141, som har vist sig at være forhøjet hos patienter med prostatacancer med fremskreden sygdom, såsom hos patienter med lymfeknude eller knoglemetastaser [15], [27], [28]. I vores undersøgelse blev miR-141 ikke påvist i patienter, der opfylder kriterierne for lavrisiko til AS. Skønt miR-141 kan være en potentiel markør for patienter med mere fremskreden PCa, er det usandsynligt, at have værdi for kandidater af AS beslutter, om at gennemgå radikal behandling. Foruden sygdomstilstanden, kan modstridende resultater blandt undersøgelser også skyldes variationer mellem metoderne for serum miRNA profilering. Individuelle QRT-PCR-baserede protokoller og microarray assays kan give forskellige miRNA signaturer. Selv om der i øjeblikket ikke er gold standard for serum miRNA detektion, har vi tidligere vist, at vores multiplex QRT-PCR-metode er nøjagtig ved at måle miRNA niveauer i knockout-systemer mangler kanonisk eller begge kanoniske og ikke-kanoniske miRNA [17].

i denne undersøgelse blev negativ patologi defineret som en Gleason score på 7 på efter-kirurgiske prøve. En Gleason score på 7 er forbundet med en øget risiko for sygdomsspecifikke dødelighed og stadig den bedste enkelt indikator for opførsel af sygdom [20]. Men en Gleason score på 7 er ikke en garanti for fremtidig klinisk progression. Nylige undersøgelser tyder på, at selv mellemliggende risiko patienter med Gleason score på 7 demonstrerer fremragende overlevelse på AS med kort til mellemliggende opfølgning [41]. Som flere patienter tilmelde AS og data fra igangværende forsøg modne, vil undersøgelser skal udføres for at afgøre, om miRNA forudsige fremtidig metastase eller sygdomsspecifikke dødelighed. Desuden vil prospektive forsøg være nødvendige for at afgøre, om de er værdifulde værktøjer til overvågning af patienter, mens de gennemgår AS.

Som konklusion, denne undersøgelse identificerer en serum miRNA signatur, der kan fungere som en uafhængig prognostisk markør i PSA. Det fremgår endvidere, hvordan serum miRNA kan anvendes til at identificere relativt små skridt i tumorprogression tillader stigende klinisk forfining af sygdomsstatus. Fremtidige undersøgelser vil være forpligtet til at validere disse markører i en stor kohorte på tværs af institutioner, samt at associere med langsigtede resultater, især patient sygelighed og dødelighed.