PLoS ONE: thrombocytter korrelerer med lymfangiogenese i Human Esophageal Cancer og mægle Vækst af lymfatisk endotelceller i vitro

Abstrakt

De seneste data bevis for en vigtig rolle af thrombocytter i lymfangiogenese inden human malign sygdom. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge rollen af ​​thrombocytter i lymfangiogenese i human esophageal cancer. Perioperative perifert blod trombocyttal (PBPC) blev evalueret retrospektivt i 320 patienter med kræft i spiserøret, bestående 184 adenocarcinomer (AC), og 136 planocellulært karcinom (SCC). Data om lymfangiogenese vurderet af anti-podoplanin immunfarvning var til rådighed fra tidligere undersøgelser blev blodpladerne i tumorvæv vurderet af CD61 immunfarvning. For

in vitro

studier blev humane lymfatiske endotelceller (LEC) isoleres og co-dyrket med perifere blodplader. Stromale trombocytisk klynger (STC) var tydelige i 82 prøver (25,6%), og vaskulære trombocytisk klynger (VTC) i 56 (17,5%). STC og VTC var forbundet med en signifikant højere perifere stamceller ved undersøgelse af alle tilfælde. Tilstedeværelsen af ​​STC var forbundet med højere lymfatisk mikrokar densitet (p 0,001), blev PBPC og STC forbundet med lymphovascular invasion af tumorceller i en regressionsmodel. Tilstedeværelsen af ​​standardaftalevilkår var forbundet med kortere DFS af alle patienter (p = 0,036, Breslow test), og VTC med kortere DFS i i SCC (p = 0,025, Breslow test). I cellekulturer blev LEC proliferation forøget ved co-dyrkning med humane blodplader i en dosis- og tidsafhængig måde medieret af frigivelse af PDGF-BB og VEGF-C. Blodplader spiller en vigtig rolle i lymphangiogenese og lymphovascular invasion i kræft i spiserøret, påvirker prognosen. Så afbrydelse af signalveje mellem blodplader, tumorceller og lymfatisk endotel kunne være til gavn for patienterne

Henvisning:. Schoppmann SF, Alidzanovic L, Schultheis A, Perkmann T, Brostjan C, Birner P (2013) thrombocytter korrelerer med lymfangiogenese i human Esophageal Cancer og mægle vækst af lymfeendotelceller

In vitro

. PLoS ONE 8 (6): e66941. doi: 10,1371 /journal.pone.0066941

Redaktør: Claudia Daniela Andl, Vanderbilt University, USA

Modtaget: April 8, 2013; Accepteret: 13. maj 2013; Udgivet: 26 juni 2013

Copyright: © 2013 Schoppmann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Esophageal adenokarcinomer (AC) for gastroøsofageal krydset er. menes at være primært fremkaldt af gastroøsofageal reflux, mens planocellulært karcinom (SCC), hovedsageligt tilskrives alkohol og tobaksforbrug [1], [2]. I de seneste årtier, er forekomsten af ​​AC rejst dramatisk i de vestlige lande [3]. Trods multimodale terapeutiske strategier, overordnede resultat for patienter med gastroøsofageal kræft forbliver fattige. Så er der et presserende behov for nye terapeutiske koncepter, og indsigt i patofysiologien af ​​sygdommen er en forudsætning for deres udvikling. Ligesom mange andre carcinomer, esophageal kræftformer hovedsagelig spredes gennem lymfesystemet, og lymphovascular invasion af tumorceller er forbundet med nedsat prognose for patienter [4].

eksisterer i dag slående bevis for, at tumorer kan ikke alene fastlægge deres eget blod fartøjer levering, men kan også inducere dannelsen af ​​nye lymfekar (lymfangiogenese) og at migrere aktivt ind i denne nydannede fartøjer for at fremme deres spredning [5].

Så mulig hæmning af denne proces kan være til gavn for patienter, især da de seneste data tyder på, at processen med lymphangiogenese og lymfe fartøj invasion (LVI) ikke kun er begrænset til primære tumorer, men er også tydeligt i lymfeknudemetastaser, hvilket resulterer i yderligere spredning af tumorceller [6].

dannelsen af ​​tumorassocierede lymfekar er en kompleks proces og i øjeblikket kun delvist forstået. Under embryonisk angiogenese, blodplader synes at spille en central rolle i at separere blod og lymfe kar [7]. Men der er stigende tegn på, at blodplader kan interagere med den menneskelige lymfesystemet også i malign sygdom, og kunne lette lymfangiogenese og tumormetastaser [8], [9].

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge, hvilken rolle af blodplader med hensyn til lymfangiogenese i human kræft i spiserøret.

Materialer og metoder

patienter

Alle patienter, som gennemgik kirurgisk resektion af karcinomer i spiserøret eller gastroøsofageal krydset mellem 1992 og 2011 ved Institut for Kirurgi, Medical University of Vienna, blev inkluderet i denne undersøgelse, hvis tilstrækkeligt væv og præoperativ trombocytisk optælling var til rådighed. Tumorer af alle patienter blev revurderet i henhold til UICC 7. udgave TNM mellemstationer.

blev opnået Etik Statement

Institutional Review Board godkendelse (Institutional Review Board af det medicinske universitet i Wien, Østrig, EK 1122/2009). På grund af den tilbagevirkende kraft af denne undersøgelse, der kun bruger arkiverede væv, blev der ikke informerede samtykke patienter ønsket og opnået, som er godkendt af revisionen bord. De specifikke prøver, der anvendes i denne undersøgelse, er allerede blevet anvendt i tidligere publikationer [4], [10] – [15].

Analyse af perifert blodpladetal (PBPC)

PBPC af patienter blev bestemt rutinemæssigt før operation, og også før initiering af neoadjuverende kemoterapi, hvis det administreres.

Analyse af PBPC blev rutinemæssigt udført på standard automatiserede hæmatologianalysatorer ved Institut for Laboratory Medicine, Medical University of Vienna. I observationelle perioden fra 1992 til 2011 er anvendt følgende hæmatologianalysatorer: indtil 1995 Coulter STKS (Coulter, Hialeah, FL), 1995-2001 Sysmex NE-8000 (TOA Medical Electronics, Kobe, Japan), siden 2001 Sysmex XE- 2100 (Sysmex Corporation, Kobe, Japan).

Immunfarvning

Immunhistokemi (IHC) blev udført på paraffinindlejrede prøver er fastsat i 4% buffered formalin, ved hjælp af tre um tykke histologiske snit.

data om lymfekar vurderet af monoklonale muse-anti-podoplanin antistof D2-40 (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) var tilgængelige fra tidligere undersøgelser [4], [15].

til detektion af thrombocytter immunfarvning blev udført ved hjælp af et monoklonalt anti CD61 antistof (NCL-CD61-308, Leica Biosystems, Newcastle, UK) i en fortynding på 1:1600. En Benchmark Ultra immunostainer (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) blev anvendt til immunhistokemi

Analyse af anti-podoplanin immunfarvning blev udført som tidligere beskrevet [16]:.

Kort fortalt til bestemmelse af LMVD, området inden for eller direkte op til tumor formationer med det største antal tydeligt fremhævet mikrokar ( “hot spot”) blev valgt ved lav forstørrelse. LMVD blev derefter bestemt ved at tælle alle immunofarvede skibe til en samlet forstørrelse på x200 i en undersøgelse areal på 0,25 mm

2. Et tilfælde blev betragtet som positiv med hensyn til LVI når i scanning af hele immunfarvet glide en tumorcelle klynge var synlig i det podoplanin dekoreret vaskulære rum.

Til analyse af anti-CD61 immunfarvning, overfladisk, exulcerated eller blødning tumor områder blev udelukket fra analysen. En tumor blev scoret som positivt for trombocytisk klynger i skibe (VTC), hvis mindst to fartøjer sådanne klynger blev set (figur 1A).

A:. Vaskulær trombocytisk klynge (VTC) i en esophageal kræft eksemplar (oprindelig forstørrelse x400). B: Stromal trombocytisk klynge (STC) i en esophageal cancer eksemplar vurderet af anti – CD61 immunfarvning (original forstørrelse x400). C: kræft i spiserøret prøve med høj lymfatisk mikrokar densitet (LMVD) vurderet ved anti podoplanin immunfarvning (oprindelig forstørrelse x200). D: Lymphovascular invasion af tumorceller vurderet af anti-podoplanin immunfarvning (original forstørrelse x200). E: Dobbelt farvning for lymfekar hjælp (rød, anti-podoplanin) og trombocytter (brun, anti CD61) (original forstørrelse x400). F-H: Fejlsøjler viser middelværdier ± 2 × standardfejl. Perifere blod blodplader (PBPC) var signifikant højere i prøver med VTC (F). PBPC (G) og LMVD (H) var signifikant højere i esophageal cancer prøver med STC.

En tumor blev betragtet som viser trombocytisk klynger inden for tumor stroma (STC), hvis mere end en utvetydig CD61 immunfarvet klynge var synlig i tumor stroma (fig. 1B).

Analyse af immunohistokemi blev udført af to uafhængige efterforskere (SFS, PB) blindet til kliniske data. Tilfælde med divergerende resultater blev evalueret sammen ved hjælp af en multiheaded mikroskop.

Statistisk analyse

T-test, Mann-Whitney test, Chi square test og lineær regression blev anvendt som passende. Alle angivne tal er middelværdier ± standardafvigelser, hvis ikke andet er angivet.

Samlet overlevelse (OS) blev defineret som tiden mellem primær kirurgi og patientens død, overlevelse indtil slutningen af ​​observationsperioden blev betragtet som censureret observation. Sygdomsfri overlevelse (DFS) blev defineret som tiden fra operationsdagen indtil første tegn på sygdom-progression. Univariate analyse af overlevelse blev udført under anvendelse Breslow test, multivariat analyse under anvendelse af Cox proportional- farer model. Patienter alder, radikalitet af resektion, tumor og lymfeknude etape (i henhold til den nuværende UICC klassifikation), tumor kvalitet og lymfeknude status blev inkluderet i Cox regression. En to-tailed p-værdi på ≤0.05 blev betragtet som signifikant, blev SPSS 19,0 bruges til alle beregninger.

isolering af endothelceller og Kultur

Primære endotelceller blev isoleret fra human forhud prøver ved proteolytisk fordøjelse, og oprenset under anvendelse af anti-CD31 antistof koblet magnetiske perler (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Isolater blev dyrket i mikrovaskulære endotel-vækstmedium EGM2-MV (Clonetics®, Lonza, Walkersville, MD) indeholdende 1 pg /ml fibronectin, 5% FCS og menneskelige vækstfaktorer uden tilskud af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF). For yderligere separation af lymfatisk og blod endotelceller (LEC og BECs), anti-podoplanin antistof koblet magnetiske perler blev anvendt. Alle isolater viste ≥98% renhed og levedygtighed.

Celler blev podet ved en tæthed på 1 x 10

5 i 30 mm brønde i 24 timer. Efter grundig vask med phosphatpufret saltvand, blev celler inkuberet med 10

5-10

7 gel filtrerede blodplader i EBM-2 basisk medium (Lonza) indeholdende 0,5% FCS. Til blokering eksperimenter blev følgende reagenser tilsat til co-kulturer: gede-anti-humant PDGFR-β neutraliserende IgG ved 1 ug /ml (R 0,05, t-test), blev perifere blodstamceller efter neoadjuverende kemoterapi (umiddelbart før kirurgi) anvendes ved disse patienter til analyse. STC var til stede i 82 prøver (25,6%, 36 AC, 46 SCC), VTC i 56 (17,5%, 22 AC, 34 SCC). Figur 1 giver prøver af immunfarvning. Generelt STC (p = 0,004, Chi Square test) og VTC (p = 0,002, Chi square test) var mere almindelige i SCC i forhold til AC. En signifikant sammenhæng mellem tilstedeværelsen VTC og Standardaftalevilkår blev set på undersøgelse af alle tilfælde og ved undersøgelse af AC og SCC separat. (P 0,001 henholdsvis Chi square test)

Selvom ingen association af tilstedeværelse af STC med tumor iscenesættelse og histologiske sortering blev set i alle tilfælde og AC, i SCC mere avanceret lymfeknude status blev set i tumorer med STC (median på PN1 i begge tilfælde, p = 0,024, Mann Whitney test).

tilstedeværelsen af ​​VTC var forbundet med mere avanceret tumor stadie i alle tilfælde (median på pT3 i begge tilfælde med en tendens til højere iscenesættelse hos patienter med VTC, p = 0,036, Mann Whitney-test), men denne forening blev ikke set når undersøger AC og SCC separat.

PBPC var højere i tilfælde med VTC på undersøgelse af alle tilfælde (275 ± 83 vs. 250 ± 79 g /l, p = 0,001, t-test) (fig. 1 F ), men denne forening blev set ved separat undersøgelse af tumortyper kun i SCC (282 ± 75 vs. 243 ± 81 g /l; p = 0,007, t-test), men ikke i AC (p = 0,077, t-test) . Ingen sammenslutning af VTC med LMVD blev set i alle tilfælde og AC og SCC separat. (P 0,05, t-test).

Tilstedeværelsen af ​​STC blev forbundet med en højere PBPC på undersøgelse af alle tilfælde sammenlignet med patienter uden STC (279 ± 88 G /l vs. 246 ± 76 G /l; p = 0,001, t-test) (figur 1G).. Ved undersøgelse af tumortyper Separat blev en sådan sammenslutning findes kun i SCC (282 ± 75 g /l vs. 243 ± 82 g /l, p = 0,007, t-test), men savnede betydning i AC (274 ± 101 G /l vs. 247 ± 73 g /l, p = 0,077, t-test). Tilstedeværelsen af ​​STC var forbundet med højere LMVD i alle tilfælde (16 ± 7 vs. 12 ± 5 mikrokar /område; p 0,001, t-test) (. Figur 1 H) og også i AC (16 ± 6 vs 12 ± 5 mikrokar /felt, s 0.001, t-test) og SCC (17 ± 7 vs. 13 ± 6, p = 0,002, t-test) separat

Ingen direkte sammenslutning af STC eller VTC med LVI. blev set (p 0,05, Chi square test)., men i en lineær regressionsmodel med LVI som afhængig variabel og med PBPC, STC og VTC viste, at PBPC (p = 0,035, koefficienten regression 0,001) og VTC (p = 0,018, blev koefficient på regression 0175) i forbindelse med LVI.

i en anden lineær regressionsmodel hjælp LMVD som afhængig variabel, herunder de samme uafhængige variable, igen PBPC (p = 0,034, koefficienten regression -0,009) og STC. (p 0,001, koefficient på regression 5,415) påvirket LMVD

Survival Analysis

Mean observationstid var 50 ± 3 (standard fejl) måneder, i løbet af denne observationsperiode, 154 patienter (48,1 %) udviklede tilbagevendende sygdom, og 131 (40,9%) døde.

tilstedeværelsen af ​​STC var forbundet med kortere DFS af alle tilfælde i univariat analyse (p = 0,036, Breslow test, fig. 2A). Ved undersøgelse af tumortyper Separat blev ingen sådan indflydelse fundet i AC, men ved analyse af SCC (p = 0,037, Breslow test, fig. 2B). STC var forbundet med kortere DFS i multivariat analyse af AC (p = 0,022, Cox regression, tabel 2, figur 2C.)

2A:. Tilstedeværelse af stromale trombocytisk klynger (STC) var associeret med kortere DFS i alle tilfælde. Ved undersøgelse af tumortyper Separat blev STC associeret med kortere DFS i pladecellekræft (SCC) (fig. 2B) samt i adenocarcinom (AC) (fig. 2C). Fig. 2D: Tilstedeværelse af vaskulære trombocytisk klynger (VTC) var associeret med kortere DFS i SCC. Fig. 2E: Overraskende VTC var forbundet med signifikant længere DFS i AC i multivariat analyse. Ikke desto mindre bemærke, at kun relativt få hændelser ses i VTC + kurve, og kurver krydser hinanden over, at kvalificere dette fund. Fig. 2F: VTC var forbundet med kortere OS i SCC

Ingen indflydelse af STC blev set på OS på undersøgelse af alle tilfælde, samt ved undersøgelse af AC og SCC separat (p 0,05. , Breslow test eller Cox regression, henholdsvis;. tabel 2)

Ingen relevansen af ​​VTC på DFS blev set på undersøgelse af alle tilfælde. Ved undersøgelse af AC og SCC separat, blev VTC forbundet med kortere DFS i univariat analyse i SCC (p = 0,025, Breslow test, median DFS 506 ± 82 vs. 794 ± 139 dage;. Figur 2D), men er forbundet med længere DFS i multivariat analyse af AC (p = 0,008, Cox regression, median DFS 2928 ± 990 vs 700 ± 141 dage, figur 2E). Tilstedeværelse af VTC var også forbundet med væsentligt kortere OS i SCC (p = 0,049, Breslow test, Fig 2F.)

PBPC var ikke forbundet med DFS eller OS i uni-eller multivariat analyse (p . 0,05, uni- eller multivariat Cox regression, henholdsvis).

Cell Culture

LEC blev podet ved 1 × 10∧5 per 30 mm godt, og efter 24 timer isolerede blodplader blev sat på 3 × 10 ∧7, 10∧6 eller 10∧5 per brønd og cellerne blev dyrket i yderligere 48 timer. Som vist i figur 3A-E, tælle LEC celle forøges med antallet af tilsatte isolerede blodplader, hvilket indikerer, at LEC proliferation forøges ved co-dyrkning med humane blodplader i en dosisafhængig måde

A:. LEC proliferation forstærkes af co-kultur med humane blodplader i en dosisafhængig måde. LEC blev podet med 1 × 10∧5 pr 30 mm brønd. Efter 24 timer isolerede blodplader blev tilsat ved 3 × 10∧7, 10∧6 eller 10∧5 per brønd og cellerne blev dyrket i yderligere 48 timer. For kvantificering af celleproliferation, blev LEC tæller bestemt (sorte bjælker, lige akse) og metabolisk aktivitet blev målt ved tetrazolium reduktion assay (hvide søjler, venstre skala). B-E: Svarende mikroskopiske billeder til A: B: Kontrol; C: EF + Px10∧7, D: EF + Px10∧6, E: EF + Px10∧5. F: LEC proliferation forøges ved co-dyrkning med humane blodplader i en tidsafhængig måde. LEC blev podet med 1 × 10∧5 pr 30 mm brønd. 24 timer derefter isoleret blodplader blev tilsat ved 1 × 10∧7 per brønd og cellerne blev dyrket i yderligere 24, 48 og 72 timer. Celletællinger blev bestemt for LEC-blodplade co-kulturer (fuldt optrukket linie) sammenlignet med LEC uden blodplade tilsætning (stiplet linie). G + H: Vækst faktor frigivelse i løbet af co-dyrkning af LEC og humane blodplader. LEC blev podet med 1 × 10∧5 pr 30 mm brønd. Efter 24 timer isolerede blodplader blev tilsat ved 7 × 10∧7, 10∧6 eller 10∧5 per brønd og cellerne blev dyrket i yderligere 48 timer. Kultursupernatant blev høstet, centrifugeret (for at fjerne cellulære komponenter) og derefter analyseret for koncentrationen af ​​PDGF-BB (G) og VEGF-C (H) ved enzymkoblet immunosorbentassay. I: Blodplade-induceret LEC proliferation medieres af PDGFRβ, VEGFR-2 og -3. LEC blev podet med 1 × 10∧5 pr 30 mm brønd. Efter 24 timer isolerede blodplader blev tilsat ved 7 × 10∧7 per brønd med eller uden blokerende reagenser mod PDGFRß, VEGFR-2 og /eller VEGFR-3. Celler blev dyrket i yderligere 48 timer før bestemmelse LEC tællinger.

Som andet eksperiment undersøgte vi, hvis LEC proliferation forstærkes af humane blodplader i en tidsafhængig måde. Til dette formål blev blodpladerne på 1 × 10∧7 per brønd tilsat til isolerede LEC (1 × 10∧5 per 30 mm brønd) og celler blev dyrket i yderligere 24, 48 og 72 timer. Fig. 3F viser, at LEC proliferation forøges ved co-dyrkning med humane blodplader i en tidsafhængig måde sammenlignet med LEC uden blodplade tilsætning.

Som næste skridt, undersøgte vi, om pro-lymfangiogene faktorer frigives i løbet af co-dyrkning af LEC og blodplader. Isolerede blodplader på 7 × 10∧7, 10∧6 eller 10∧5 per brønd sættes til LEC (1 × 10∧5 per 30 mm brønd) efter 24 timer, og cellerne blev dyrket i yderligere 48 timer. Kultursupernatant blev høstet, centrifugeret til fjernelse cellulære komponenter og derefter analyseret for koncentrationen af ​​PDGF-BB og VEGF-C ved enzymkoblet immunosorbentassay.

Figur 3G og 3H viser, at ved en blodplade koncentration på 10∧ 6, blev PDGFR-β og VEGF-C frigivet, og denne udgivelse af vækstfaktorer var stærkt forøget ved en trombocyt koncentration på 10∧7

Som et sidste trin, blev udført blokerende eksperimenter:.

LEC blev podet ved 1 × 10∧5 pr 30 mm brønd. Efter 24 timer isolerede blodplader blev tilsat ved 7 × 10∧7 per brønd med eller uden blokerende reagenser mod PDGFRß, VEGFR-2 og /eller VEGFR-3. Celler blev dyrket i yderligere 48 timer før bestemmelse LEC tæller. Fig. 3I viser, at LEC celleproliferation blev delvist reduceret ved tilsætningen af ​​de individuelle forbindelser i sammenligning med LEC /blodplade co-kultur uden at blokere stoffer. Inhibering af VEGFR-3 (blokering VEGF-C signalering) var mest potente og faldt blodplade-medieret LEC proliferation med 90%. Denne effekt kunne ikke blive yderligere forstærket af kombination med anti-PDGFRß og ​​anti-VEGFR-2 antistoffer

Diskussion

Blodplader spiller en vigtig rolle i human malign sygdom:. Så det er blevet vist i mange undersøgelser, der præoperative forhøjet perifer blodpladetal forudsiger dårlig prognose i en række forskellige humane cancere [17] deriblandt også gastrisk cancer [18].

i esophageal cancer (SCC og AC), en stigning i trombocyttallet efter en bloc resektion er blevet rapporteret at være forbundet med bedre prognose i en undersøgelse [19], og i en undersøgelse fra Pakistan, var lave præoperative blodpladetal forbundet med dårlig prognose [20]. I modsætning hertil en anden undersøgelse viste, at præoperativ thrombocytose angivet dårlig prognose i esophageal SCC [20].

Alligevel er det ikke helt klart, om forhøjede blodpladetal induceres af en mere aggressiv fænotype af tumorer, eller bidrage sig til klinisk opførsel af tumorer. Sandsynligvis tumorer kan inducere thrombopoesis direkte fx via faktor ligesom IL-6 [21].

Blodplader synes også at fremme metastase, men de nøjagtige mekanismer er stadig uklart, [22], [23].

Blodplader spiller også en rolle i tumorangiogenese efter aktivering, fx som reaktion på endotel skade [24]. Denne virkning synes at blive induceret ikke blot af blodpladefaktor sekretion, men også ved direkte stimulering af angiogenese [25].

Det er velkendt, at perifere humane blodplader kan secernere pro-lymfangiogene faktorer som VEGF-C og PDGFR-B, som frigives under blodpladeaktivering [26]. Desuden blodplader spiller en vigtig rolle i den embryoniske udvikling af lymfesystemet [7]. Så de er blevet rapporteret at inhibere proliferation og migrering af lymfatiske endotelceller under embryonisk udvikling ved aktivering ved interaktion af CLEC2 og podoplanin, som udtrykkes på lymfatiske endotelceller [27].

I malign sygdom, samspillet mellem blodplader og podoplanin via CLEC-2 inducerer en række veje er involveret i tumor celle migration og vækst [28].

overraskende til vores viden findes ingen data om rolle af blodplader i lymfangiogenese i human malign sygdom, så langt.

i vores nuværende studie undersøgte vi i en stor serie af esophageal kræft foreningens af PBPC med blodplader i tumor fartøjer, inden for tumor stroma og med lymfangiogenese.

Perioperative PBPC var forbundet med tilstedeværelsen af ​​blodplader inden tumorvæv og blodplader i tumorvævet var forbundet med øget lymfangiogenese. Mens ingen direkte sammenslutning af STC eller VTC med LVI af tumorceller blev set, PBPC og VTC påvirket LVI i regression analysis.This viser, at et komplekst samspil mellem PBPC, VTC og STC fremmer LVI af tumorceller.

Til undersøge vores resultater i detaljer

in vitro

udførte vi celledyrkningsforsøg, viser, at blodplader fremme væksten af ​​LEC på en dosis- og tidsafhængig måde. Denne induktion af LEC vækst synes at blive induceret af sekretion af pro-lymfangiogene faktorer som VEGF-C og PDGF-BB.

Så vores resultater kan være en mulig forklaring på, hvorfor øget præoperativ PBPC er forbundet med nedsat prognosen hos en række humane cancere, selv om dette var ikke tydeligt i vores undersøgelse. Selvom podoplanin interagerer med blodplader under udvikling, en interaktion mellem lymfatiske endothelceller og blodplader er ikke tidligere beskrevet. Dette kan forklares ved det forhold, at thrombocytter ikke er fundet inden det lymfatiske karsystem. Alligevel blodplader lette ekstravasation ved frigivelse af matrixmetalloproteinaser og ved stimulering af tumor og endotelceller [28]. Som tydeligt i vores undersøgelse, kan blodplade klynger genfindes ikke kun inden blodkar, men også inde i tumoren stroma, hvilket indikerer utætte fartøjer. Da vaskulære og stromal blodplade klynger korreleret, migration af blodplader ud af fartøjerne synes at blive induceret af vaskulære klynger. De lymfangiogene faktorer der udskilles i stroma af ekstravaserede blodplader kan fremkalde vækst af lymfatisk endotel, hvilket understøtter dannelsen af ​​nydannede lymfekar.

Et vist i vores cellekultur eksperimenter, denne stimulering af spredning af LEC af blodplader synes at blive induceret på en tids- og dosisafhængig måde hovedsageligt ved VEGF-C og PDGF-BB, som udskilles af blodplader. Blokerende forsøg viser en dominerende rolle af VEGF-C i denne proces.

Som rapporteret i forskellige undersøgelser, at stigningen i lymfekar korrelerer med sandsynligheden for at udvikle LVI og efterfølgende lymfeknudemetastaser. [29] – [34]. Det faktum, at blodplader fremmer ekstravasation af tumorceller er velkendt [17], men baseret på vores data forekommer det meget sandsynligt, at blodplader i tumorstroma også fremme invasion af tumorceller i den lymphovascular systemet

sammenfattende viser vi for første gang i store serier af patienter menneskelige kræft og også

in vitro

at blodplader perifere spiller en vigtig rolle i kræft i spiserøret lymfangiogenese og LVI, hvilket påvirker prognosen for patienter. Så afbrydelse af signalveje mellem blodplader, tumorceller og lymfatisk endotel kunne være til gavn for patienterne.