PLoS ONE: Inaktivering af DNA-afhængig proteinkinase Fremmer Heat-induceret apoptose Uafhængigt af Heat-Shock Protein Induktion i menneskelige kræftceller

Abstrakt

hæmning af DNA-skade responset pathway synes at være en attraktiv strategi for kræftbehandling. Det er tidligere rapporteret, at i gnaverceller udsættes for varmestress, blev cellevæksten fremmes ved aktiviteten af ​​DNA-afhængig proteinkinase (DNA-PK), et enzym involveret i DNA non-homolog ende sammenføjning (NHEJ), der kræves for dobbeltstrenget bryde reparation. Fraværet af en fungerende DNA-PK blev forbundet med nedregulering af varmechokprotein 70 (HSP70). Formålet med denne undersøgelse er således at undersøge den rolle, DNA-PK inhibering i varme-induceret apoptose i humane cellelinier. Inhibitorerne ifølge phosphorylering af DNA-PK katalytiske subunit (DNA-PKcs) på Ser2056, såsom NU7026 og NU7441, blev anvendt. Desuden banke ned af DNA-PKcs blev udført ved hjælp af små interfererende RNA (Sidna-PKcs). For varme eksponering blev cellerne anbragt i vandbad ved 44 ° C i 60 minutter. Apoptose blev vurderet efter 24 timers inkubation flow cytometrisk. Proteiner blev ekstraheret efter 24 timer og analyseret for HSP70 og Hsp40-ekspression ved Western blotting. Totalt RNA blev ekstraheret 6 timer efter behandling og analyseret ved hjælp af et GeneChip® microarray-system til at identificere og vælge de up-regulerede gener (≥1.5 gange). Resultaterne viste en forøgelse i varme-induceret apoptose i fravær af fungerende DNA-PKcs. Interessant nok blev ekspressionsniveauerne af HSP70 og Hsp40 forhøjet i fravær af DNA-PKcs under varmestress. Resultaterne af genetisk netværk analyse viste, at HSP’er og Jun gener var opreguleret uafhængigt af DNA-PKcs i udsatte forælder og knock out celler. I nærvær af fungerende DNA-PKcs, var der en observeret opregulering af anti-apoptotiske gener, såsom NR1D1, i mangel af DNA-PKcs de pro-apoptotiske gener, såsom EGR2, var fortrinsvis opreguleret. Fra disse resultater, konkluderede vi, at i humane celler, kan inaktivering af DNA-PKcs fremme varme-induceret apoptose uafhængigt af varmechok-proteiner

Henvisning:. Okazawa S, Furusawa Y, Kariya A, Hassan MA, Arai M, Hayashi R, et al. (2013) Inaktivering af DNA-afhængig proteinkinase Fremmer Heat-induceret apoptose Uafhængigt af Heat-Shock Protein Induktion i menneskelige kræftceller. PLoS ONE 8 (3): e58325. doi: 10,1371 /journal.pone.0058325

Redaktør: Michael Sherman, Boston University Medical School, USA

Modtaget: November 6, 2012; Accepteret: 1. februar, 2013; Udgivet: 11 Mar 2013

Copyright: © 2013 Okazawa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte til denne undersøgelse blev leveret af en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (B) (22.390.229), Japan Society for fremme af videnskab. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ondartede tumorer er stort problem i verden, at udbygning af effective lægemidler i den medicinske forskning field har altid været på toppen af ​​forskningsinteresser i årtier. Dette mål har varet i år på trods af de mange terapeutiske værktøjer til rådighed (såsom kirurgi, kemoterapi, strålebehandling, hypertermi [1], høj intensitet fokuseret ultralyd (HIFU) [2], immunterapi [3], etc.), og de mange forskellige deres strategiske kombinationer [1], [4], [5]. Dette er fordi ingen af ​​disse værktøjer har fungeret perfekt eller sikkert at udrydde kræft. Men for at sætte videnskabelige grundlag til opdagelser af nye metoder, en grundig forståelse af kræft molekylærbiologi bliver obligatorisk. For nylig, undersøgelserne vedrørende DNA-skade respons (DDR) veje gjort dette område som lovende i kræftbehandling. Kombinationen af ​​DNA-ødelæggende midler med molekylære målretning lægemidler mod de involveret i DNA-reparationsveje spillere kunne resultere en synergistisk virkning ved drab cancerceller [6]. Undersøgelserne vedrørende DDR afslørede en overflod af molekylære mål såsom Ataxia telangiectasia muteret (ATM), ataksi telangiectasia og Rad3-relateret (ATR), og DNA-afhængig proteinkinase (DNA-PK). Disse proteiner er medlemmer af phosphoinositol 3-kinase-lignende kinase (PIKK) familiefunktionen som transducere i DDR at aktivere flere proteiner involveret i cellulære respons på DNA beskadigelse [7] -. [9]

Det blev rapporteret at DNA-PK interagerer med varmechok-transkriptionsfaktoren (HSF1) [10]. I en undersøgelse, DNA-PKcs negative musecellelinie scva2 og en matchet DNA-PKcs positiv cellelinie sc (8) -10 afledt af scva2 ved indføring af et DNA-PKcs strukturelle gen, blev udsat for varmebehandling og omfanget af varme-induceret apoptose blev vurderet. De DNA-PKCS negative celler viste noget forsinket HSP70 induktion som nåede en lavere steady state niveau. Denne observation blev begrundet med HSF1 og DNA-PKcs interaktion [11]. Men som DDR aktivering ved hypertermi ikke blev anerkendt på det tidspunkt blev ikke rapporteret inddragelse af ATM-aktivering, p53 phosphorylering [12], og induktion af γH2AX [13] af varmestress. For nylig er phosphoryleringen af ​​p53 på Ser15 samt intracellulær signalering af den ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) blevet afsløret. Desuden flere andre scenarier for DNA-PK involvering i varme-stress respons, såsom celle overlevelse signal opregulering af Akt fosforylering gennem DNA-PK [14] og aktivering af NFKB p50 [15], også er blevet rapporteret. Desuden har vores gruppe vist, at inhibering af DNA-PK ved DNA-PK-inhibitorer og RNAi teknik fremmet ultralyd-induceret celledød uanset p53 fænotype [16].

I denne undersøgelse vil vi ligeledes undersøge rolle af DNA-PK i varme-induceret apoptose i forskellige humane cancercellelinier. Vi hypotesen, at DNA-PKcs inhibering kan forstærke hypertermi-induceret celledød. Detaljerne i de underliggende mekanismer vil også blive undersøgt.

Resultater og Diskussion

Heat-induceret apoptose blev Enhanced af DNA-PK Inhibitors

Kontrol og behandlede celler blev analyseret for omfanget af chromatinkondensering som indikator for apoptose induktion ved anvendelse af en nuklear-ID ™ grøn chromatinkondensering kit målte flow cytometrisk. Analysen blev udført 24 timer efter varme- eksponering i fravær eller nærvær af DNA-PK-inhibitorer. Som vist i figur 1A B, begge DNA-PK-hæmmere NU7026 og NU7441 forbedret apoptose betydeligt efter varmestress. Interessant NU7026 havde ingen virkning på celler under normale betingelser henviser NU7441 inducerede betydelig apoptose i HeLa-celler i fravær af varmestress. Dette var sandsynligvis på grund af højere styrke af den senere mod andre medlemmer af PIKK familie proteiner, såsom mammalian target of rapamycin (mTOR) og phosphatidylinositide-3-kinase (PI3K) [17]. Det skal her angivet, at DMSO blev bekræftet ikke at interferere med de opnåede resultater (data ikke vist).

chromatinkondensering i celler i nærvær af 10 uM af (a) NU7026, eller (b) NU7441. (C) inhibering af DNA-PKcs phosphorylering på Ser2056 med 10 uM NU7026 eller NU7441 6 timer efter udsættelse for varme stress. (D) Tidsafhængig Western blot-analyse af HeLa-celler (0-6 h) viser ændringerne i phosphorylering af DNA-PKcs i Ser2056 (DNA-PKcs-pS2056) og HSP’er; HSP70 og Hsp40, med 10 uM NU7026. Caspase-3-spaltning og HSP-ekspression ved Western blotting 24 timer efter behandling i fravær eller nærvær af 10 uM af (e) NU7026 eller (f) NU7441. NU7441 induceret svag caspase-3-aktivering uden varme eksponering i augmentation med chromatinkondensering data. Data er udtrykt som middelværdi ± SD (*, P 0,05, **, P 0,01; NS, ikke-signifikant).

I Western blotting, figur 1C viser, at begge hæmmere kunne med held undertrykke phosphorylering af DNA-PKcs i Ser2056 ved 6 h efter udsættelse for varme stress. Tidsafhængig analyse af celler viste, at phosphorylering af DNA-PKcs i Ser2056 øges gradvist med tiden op til 6 timer efter varmebehandling. På samme tidsforløb, der var en samtidig stigning i ekspressionen af ​​HSP70 og Hsp40. Slående, når DNA-PK hæmning, DNA-PKcs-pS2056 faldt mens HSP70 og Hsp40 udtryk bevaret sin tidsafhængig stigning (figur 1D). Fastholdelsen af ​​HSP’er stigning mønster i fravær af DNA-PK kommer i modsætning til den ledsagende reduktion rapporteret i museceller og kan således afspejle, at sensibilisering af humane celler for apoptose gennem DNA-PK-inhibering kan fungere uafhængigt af HSP’er. For at bevise denne specielle forskel, vi bekræftet, at 10 uM NU7441 behandling faldt ekspressionen af ​​HSP70 i kinesisk hamster ovarieceller, CHO-K1 (fig S1).

Celledød gennem apoptose induktion blev yderligere bekræftet ved caspase- 3 spaltning. I figur 1E F, caspase-3-spaltning blev påvist 24 timer efter opvarmning. Caspase-3-spaltning blev signifikant forøget i nærvær af inhibitorer især NU7441. NU7441 behandling induceret svag bånd i ikke-opvarmede celler i augmentation med chromatinkondensering data. Desuden data afslører, at stigningen i HSP70 og Hsp40 blev opretholdt op til 24 timer efter behandling med DNA-PK-hæmmer.

Heat-induceret apoptose blev Enhanced af DNA-PKcs Knockdown Brug Lille interferens RNA

for at bekræfte den rolle, DNA-PK i varme-induceret apoptose, udførte vi alternative forsøg på celler, der mangler et funktionelt DNA-PK gennem silencing proteinet ved en DNA-PKcs-målrettet siRNA (Sidna-PKcs). Procedurerne transfektionsforsøg blev først bekræftet ved Western blotting 48 og 72 timer efter transfektion. Figur 2A viser fraværet af endogene DNA-PKcs bånd ved alle koncentrationer af Sidna-PKcs. Yderligere forsøg blev således udført under anvendelse af celler transficeret ved 20 nM. Celler transficeret med luciferase siRNA (siLuc, 20 nM) under lignende betingelser blev taget som negative kontroller. Ved udsættelse for varme, celler, der mangler funktionel DNA-PK viste signifikant chromatinkondensering sammenlignet med celler transficeret med siLuc (figur 2B). Til støtte, den spaltede caspase-3 bands 24 timer efter behandling steget betydeligt i Sidna-PKcs-transfekterede celler. Disse resultater understøtter yderligere den rolle af DNA-PKcs i varme-induceret apoptose. Igen var der ingen indlysende forhold mellem HSP’er og DNA-PK silencing efter udsættelse for varmestress (figur 2C). Dette fund kommer i modsætning til rapporter om gnaver celler, der mangler funktionel DNA-PK viser, at ekspressionsniveauet af HSP70 under varmestress blev nedreguleret [11] (figur S2). For at bekræfte generalisering til andre humane celler, vi udført tilsvarende forsøg på to varianter af malignt gliom celler, nemlig; M059K celler med fungerende DNA-PK og DNA-PKcs defekt M059J variant. Som vist i figur S3, ekspressionen af ​​HSP70 og Hsp40 var ens i begge celler uanset DNA-PK status. Som sådan kan det konkluderes, at i humane celler, inhibering af DNA-PK forøger varme-induceret apoptose uafhængigt af HSP’er.

(a) HeLa-celler transficeret med forskellige doser af små interfererende RNA mod DNA-PKcs (Sidna-PK) og luciferase (siLuc); (B) DNA-PKcs- Knockdown celler udsat for varmestress viste højere procentdel af chromatinkondensering; (C) knockdown af DNA-PKcs forbedret caspase-3-aktivering efter varmestress uafhængigt af HSP70 og Hsp40 ekspression 24 timer efter behandling; (D) HSF1 aktiv form bånd blev forøget i fravær af DNA-PKcs 1 time efter udsættelse for varme stress. Data er udtrykt som middelværdi ± SD (**, P 0,01, NS, ikke-signifikant).

Ekspressionen af ​​HSF1 aktive form blev analyseret i HeLa-celler ved 1 h efter varme eksponering ( 44 ° C i 60 minutter). HSF1 aktive form blev opreguleret i fravær af DNA-PKcs (figur 2D). Dette fund afspejler, at HSF1 aktivering ikke kræver DNA-PKcs.

Gene Expression Analysis

Figur 3A viser, at varmestress kunne opregulere 403 probe sæt ved ≥1.5 gange i både siLuc- og Sidna-PKcs-transficerede celler (gruppe 1). Yderligere 160 probe sæt var opreguleret under varme stress ved ≥1.5 fold i siLuc-transfekterede celler kun (gruppe 2) mens 179 probe sæt blev opreguleret af ≥1.5 fold i Sidna-PKcs-transfekterede celler (gruppe 3). Den genetiske netværk, der omfatter gruppe 1-gener viste, at HSP’er, såsom HSP70 (HSPA6) og Hsp40 (DNAJB1), blev højt udtrykt (figur 3B). Pro-apoptotiske gener som juni proto-onkogen (juni) og FBJ murine osteosarkom viral onkogen homolog B (fosB) blev også identificeret som op-regulerede gener. Den opregulering af gruppe 1-gener i begge celle varianter tyder på, at disse gener reagerer på varmestress uafhængigt af DNA-PK status, de ting, der yderligere understøtter Western blot data. Svarende til HeLa-celler, viste vores tidligere undersøgelser, at ekspressionen af ​​basic-region leucin-zipper (bzip) transkriptionsfaktorer jun, ATF3 og FOS blev også forøget i humane lymfom U937-celler viser apoptose efter eksponering for varmestress ved 44 ° C i 15 min [18]

(a) Illustrative Venn-diagram på op-regulerede gener i siLuc- og Sidna-PKcs-transficerede celler efter udsættelse for varme stress.; (B) Fælles opreguleret gener i både siLuc- og Sidna-PKcs-transficerede celler udsat for varmestress (gruppe 1); den genetiske netværk vises grafisk som knudepunkter (gener) og kanter (de biologiske forhold mellem gener). Knudepunktet farve angiver ekspressionsniveauet af det respektive gen. Knuder og kanter vises i forskellige former og etiketter, der repræsenterer de funktionelle klasser af gener og arten af ​​forholdet mellem knudepunkter, henholdsvis. Dette netværk viser, at HSP gener ikke var forbundet med DNA-PK status og at Jun beslægtede gener blev opreguleret som respons på varmefremkaldt cellebeskadigelse.

Ekspressionsprofilen af ​​nogle udvalgte gener, nemlig; HSPA6, DNAJB1, DNAJA4 og Jun, blev bestemt ved hjælp af real-time qPCR (figur 4A-D). Resultaterne viste, at mRNA-niveauer af disse gener blev forøget signifikant med varmestress.

HeLa-celler blev behandlet ved 44 ° C i 60 minutter og derefter inkuberet ved 37 ° C i 6 timer. MRNA ekspressionsniveauer af (a) DNAJB1 (Hsp40), (b) HSPA6 (HSP70), (c) DNAJA4, (d) jul, (e) NR1D1, (f) AHR, (g) BIRC3, (h) JUND , (i) EGR2 og (j) KLF4 normaliseret til GAPDH ekspressionsniveau. Data er udtrykt som gennemsnit ± SD (*, P 0,05, **, P 0,01; NS, ikke-signifikant)

Næste, vi afbildet den mulige genetiske netværk, som vil omfatte den. up-regulerede gener i siLuc-transficerede celler (gruppe 2) (figur 5A). Generne identificeret indgår pro-apoptotiske gener, som fungerer gennem TNFa-relaterede veje såsom TLR4 [19], [20], og TNFRSF10B, også kendt som DR5, som kan aktiveres af tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand [21 RIPK2 ]. De tumornekrosefaktorreceptor-associerede faktorer, såsom TRAF2 og TRAF6, blev også påvist. TRAF2 mediere signalering fra TNF-R superfamilien for aktiveringen af ​​JNK (c-Jun N-terminal kinase) eller NFKB [22]. TRAF6 deltager også i signalvejen fra TLR superfamilien og inducerer apoptose via en caspase-afhængige vej og forøger NFKB-aktivering [23]. TRAF3IPs interagerer med TRAF familie proteiner og enten I-KB-kinase eller MAP kinase [24]. IRF1 gen inducerer celledød i nærvær af INFy og TNFa [25]. På den anden side, blev også identificeret nogle celle overlevelse gener. Den opregulering af overlevelse gener blev igen bekræftet af qPCR assay. Figur 4E viser, at mRNA-niveauet af NR1D1 blev opreguleret i siLuc-transficerede celler, mens nedreguleret i DNA-PKcs knockdown celler. NR1D1 er afbildet i netværket som det gen, der kan have indflydelse TLR4. NR1D1 blev rapporteret at være en LXR målgen i humane makrofager og undertrykker LXR-induceret-TLR-4-ekspression [26]. Interessant NR1D1 er en af ​​de intranukleære receptorer og anses for at bidrage til circadian system er dog den biologiske tilstand af dens virkningsmekanisme er ukendt. En nylig rapport foreslår NR1D1 kan virke på fedtstofskiftet enzymaktivitet i human epidermal vækstfaktor receptor 2 (ERBB2) -positiv brystkræft, og til at fungere i celleoverlevelse [27], [28]. Således kunne det være, at NR1D1 induceres under varmestress ved DNA-PK at fremme cellestofskiftet for overlevelse. Tilsvarende Figur 4F G viser den differentielle ekspression af AHR og BIRC3 i begge celle varianter. AHR har mange funktioner i ATM signalering, ben differentiering, Th17 lymfocytdifferentieringen, P450 udtryk og reguleringen af ​​NFKB vej [29], [30]. Desuden AHR forbedrer cytoprotektion-relateret gen SERPINE1 [31], der også blev identificeret som en opreguleret gen i vores tidligere undersøgelser [32], [33]. BIRC3 (cellulær inhibitor af apoptose protein 2, cIAP2) er en af ​​de inhibitorer til apoptose familie proteiner. BIRC3 induceres af TNFa via NFKB pathway, og kan induceres af andre veje, herunder PI3K [34]. På dette tidspunkt, var det vigtigt at bekræfte rolle disse overlevelses gener med at redde celler efter varmestress eksponering. Til dette har vi udført Knockdown eksperimenter mod NR1D1 og BIRC3 i HeLa celler efterfulgt af varmebehandling. Effektiviteten af ​​knock down blev verificeret ved qPCR analyse 24 timer efter transfektion (fig S4). Transficerede celler blev udsat for varmestress 24 timer efter transfektion. Western blot analyse viste, at de spaltede caspase-3 niveauer steg svagt i siNR1D1- og siBIRC3-transficerede celler 24 timer efter behandling (fig S5). Celler, der mangler NR1D1 viste signifikant stigning i chromatinkondensering sammenlignet med celler transficeret med siLuc, hvorimod knockdown af BIRC3 lidt, men ikke signifikant, forøges procentdelen af ​​celler med kondenseret kromatin efter varmebehandling (fig S6).

( a) Up-regulerede gener i varme-eksponerede siLuc-transfekterede celler (gruppe 2 i fig. 3A). Denne gruppe omfatter anti-apoptotiske gener såsom NFKB pathway gener, AHR og NR1D1; (B) Up-regulerede gener i varme-eksponerede Sidna-PKcs-transfekterede celler (Gruppe 3 i fig. 3A). Denne gruppe omfatter pro-apoptotiske gener, der normalt hæmmet ved DNA-PK aktivitet såsom EGR2, KLF4 og ATF4.

Figur 5B illustrerer den mulige genetiske netværk som skal bestå af op-regulerede gener i Sidna -PKcs-transficerede celler (gruppe 3). Figur 4H-J give qPCR resultaterne for nogle udvalgte gener, nemlig JUND, ERG2 og KLF4. Blandt de opregulerede gener er JUND der opfører sig på samme til Jun-proteinerne til at transaktivere en AP-1-responsiv promotor sammen (fig 4H). JUND udviser en celle-afhængige rolle i forebyggelsen af ​​celledød i UV-understregede mus embryonale fibroblaster [35], samtidig med at UV-induceret caspase-3 aktivitet i human myeloblastisk leukæmi [36]. SOCS1 ekspression induceres af TLR stimulation og inhiberer JAK /STAT signalering [37] som negativ feedback model [38]. SOCS1, som reguleres af JUND i T-celler [39], regulerer varigheden af ​​NFKB-signalering ved at mindske ekspression af NFKB-afhængige gener [40]. PLAUR er et urokinase-plasminogenaktivator-receptorgenet. PLAUR regulerer endotelcelle overlevelse og er vigtig for VEGF-induceret anti-apoptose [41]. Den overekspression af JUND fører til nedregulering af VEGFA mRNA [42].

Den genetiske netværk bekræfter ligeledes opregulering af adskillige pro-apoptotiske gener, der går i samarbejde med den observerede forbedring i apoptose i fravær af DNA-PK. EGR2 spiller en central rolle i PTEN-inducerede apoptosecyklus. ERG2 blev forskelligt forøget i Sidna-PK banke ned celler (Figur 4I). Den overekspression af EGR2 inducerer apoptose i forskellige tumorcellelinier via BNIP3L og BAK [43]. CYCS (cytochrom c-genet, som inducerer apoptose gennem bcl-2 pathway ved dens frigivelse fra mitochondrier til cytoplasma), aktiverende transskriptionsfaktor 4 (ATF4) (hjælpemidler i opregulering af pro-apoptotisk protein C /EBP-homologt protein ekspression [ ,,,0],44]), og zink-finger transkriptionsfaktor KLF4 (rapporteret at være involveret i apoptose induktion i T-celle-leukæmi [45]) blev alle identificeret som op-regulerede gener. Stigningen i mRNA niveau af KLF4 var under signifikansniveauet (p = 0,078), dog var tendensen skelnes i alle gentagelser (Figur 4J). Disse pro-apoptotiske gener kan hæmmes via DNA-PK-aktivitet og således i fravær af en funktionel DNA-PK, kan disse gener føre til en forøgelse af varme-induceret apoptose.

Materialer og metoder

Kemikalier

Den selektive DNA-PK inhibitor NU7026 (2- (morpholin-4-yl) benzo [h] chomen-4-on) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og NU7441 (8- (4-Dibenzothienyl) -2- (4-morpholinyl) -4H-1-benzopyran-4-on) blev indkøbt fra Axon Medchem (Groningen, Holland). De blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) i en slutkoncentration på 10 mM. Stamopløsninger blev opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse.

cellelinier og behandling

humane cervikale carcinoma HeLa S3-celler (Riken, Tsukuba, Japan), human malignt gliom M059K og dets DNA- PKcs defekt variant M059J (tilvejebragt af A. Takahashi, Gunma University, Japan), blev alle dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin antibiotisk blanding. Og kinesisk hamster ovarie celle CHO-K1 og dets DNA-PKcs defekte variant V3-celler [46] (Riken) blev alle dyrket i MEMα suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin antibiotisk blanding. Opvarmningen blev udført ved at nedsænke en parafilm-forseglet cellekultur pladen i et vandbad ved 44 ° C i 60 minutter. Temperaturen blev overvåget med en digital termometer (# 7563, Yokogawa, Tokyo, Japan). I inhiberingseksperimenter blev celler præinkuberet med 10 uM af NU7026 eller NU7441 i 30-60 min, efterfulgt af varme eksponering. Behandlede celler blev derefter inkuberet ved 37 ° C indtil analyse uden mediumudskiftning.

chromatinkondensering Analyse

Kontrol og behandlede celler blev opsamlet 24 timer efter behandling og farves ved anvendelse af en nuklear-ID ™ grøn kromatin kondensation detektion kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) ifølge fabrikantens protokol. Omfanget af chromatinkondensering blev målt ved at beregne fluorescensintensiteten af ​​Nuclear-ID ™ grøn forhold til kontrol med flowcytometri (Epics XL, Beckman Coulter, Miami, FL).

Western blotting-analyse

Celler blev opløst i lyseringsbuffer (50 mM NaCI, 1% Nonidet P-40 og 50 mM Tris-HCI, pH 8,0) indeholdende natriumorthovanadat og proteaser inhibitor cocktail (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). SDS-polyaclylamidegel elektroforese og Western blotting blev udført som beskrevet andetsteds [47]. De primære anvendte antistoffer var som følger: et monoklonalt muse-anti-HSP70-antistof (MBL, Nagoya, Japan); et monoklonalt muse-anti-Hsp40-antistof (MBL); en kanin polyklonalt anti-caspase 3 antistof, som genkender den fulde længde caspase-3 (35-kDa) samt fragmenter (19- og 17-kDa) af det aktiverede enzym (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); en kanin polyklonale anti-phospho DNA-PKcs at Ser2056 antistof (Abcam, Cambridge, UK); en kanin monoklonale anti-DNA-PKcs-antistof (Epitomics, Burlingame, CA); en kanin polyklonalt anti-HSF1 antistof (StressGen Bioreagents, Victoria, Canada); og et monoklonalt muse-anti-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) antistof (Organon Teknika, Durham, NC). Immunoreaktive proteiner blev visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens (ECL) detektionssystem på en selvlysende billedanalysator (LAS-4000, Fujifilm, Tokyo, Japan).

Band tætheder blev kvantificeret af Image J (Rasband, WS, ImageJ, amerikanske National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2012.), og de relative mængder af proteiner forbundet med hver specifikt antistof blev normaliseret til GADPH bands.

Transfektion med lille interfererende RNA (siRNA)

Negativ kontrol luciferase siRNA og DNA-PKcs målrettet siRNA blev opnået fra Nippon Gene Materiale (Toyama, Japan), og Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Products (Lafayette, CO), hhv. De siRNA’er rettet NR1D1 (Rev-erbα) og BIRC3 (c-IAP2) blev købt fra Santa Cruz bioteknologisk, Santa Cruz, CA. Transfektion blev udført i HeLa-celler under anvendelse af RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev HeLa-celler opsamlet, vasket og suspenderet i komplet vækstmedium uden antibiotika. Cellerne blev podet med en tæthed på 2,5 x 10

4 celler /brønd i plader med 12 brønde og efterladt til at fastgøre i 24 timer. For transfektion blev 800 pi Opti-MEM (Invitrogen) tilsat til cellerne efterfulgt af 200 pi Opti-MEM indeholdende RNAi Max /siRNA-komplekser fremstillet 20 minutter før tilsætning (Reverse transfektionsprotokol). Seks timer senere blev transfektionsblandingen mediet erstattet med frisk komplet medium uden antibiotika. Derefter blev cellerne inkuberet yderligere 42 timer. Tredive minutter før varmebehandling blev mediet udskiftet med komplet medium med antibiotika.

RNA Isolation

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA) og behandlet med DNase i (RNase-fri DNase kit, Qiagen) i 15 minutter ved stuetemperatur til fjernelse af resterende genomisk DNA. RNA kvalitet blev analyseret under anvendelse af en Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). RNA-prøver, der havde RNA integritet nummer (RIN) værdier over 9,5, blev anset for acceptabel.

Microarray og Computational genekspression Analyser

Genekspression blev analyseret ved hjælp af en GeneChip® Human Gene 1.0 ST Array spottet med cirka 28.869 probe sæt (Affymetrix, Santa Clara, CA). Prøver til matrix hybridisering blev fremstillet som beskrevet i Affymetrix GeneChip® Expression tekniske manual. De scannede arrays blev analyseret ved hjælp af GeneChip® Analysis Suite Software (Affymetrix). De opnåede intensitet data hybridiseringsbetingelser blev analyseret ved anvendelse af GeneSpring® analysesoftware ver 11,5 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) til at udtrække væsentlige gener. For at undersøge gen ontologi, herunder de biologiske processer, cellulære komponenter, molekylære funktioner og genetiske netværk blev de opnåede data analyseres ved hjælp af opfindsomhed Pathways Analyseværktøjer (Ingenuity® Systems, Mountain View, CA, USA), et web-leveret ansøgning, som muliggør identifikation, visualisering, og udforskning af molekylære interaktion netværk i genekspression data [48]. Komplette lister over probe sæt fra alle prøver er tilgængelige på Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE39063).

Fast -tids Kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR)

real-time qPCR assay blev udført på Mx3000P® realtids-PCR-systemet (Stratagene Japan, Tokyo, Japan) under anvendelse af SYBR® Premix Ex Taq (Takara Bio, Shiga , Japan) ifølge fabrikantens protokol. Revers transkriptase-reaktionen (PrimeScript® reagenskit, Takara Bio) blev udført med DNase-behandlede total RNA. Primerne blev designet baseret på følgende databasesekvenser: NM 006.145, DnaJ (Hsp40) homolog underfamilien B, del 1 (DNAJB1); NM 002.155, varme chok 70 kDa protein 6 (HSP70B «) (HSPA6); NM 018.602, DnaJ (Hsp40) homolog, underfamilien A, medlem 4 (DNAJA4); NM 002228, jun proto-onkogen (juni); NM 021.724, nuklear receptor underfamilie 1, gruppe D, del 1 (NR1D1); NM 001.621, aryl hydrocarbon receptor (AHR); NM 001.165, baculoviral IAP gentagelse indeholdende 3 (BIRC3); NM 005.354, jun D proto-onkogen (JUND); NM 000.399, tidlig vækst svar 2 (EGR2); NM 004.235, Kruppel-lignende faktor 4 (KLF4); NM 002.046, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH). GAPDH blev anvendt som kontrol til normalisering [49].

Statistical Analysis

Data er præsenteret som middelværdi ± SD. Statistisk signifikans mellem to datasæt blev bestemt ved anvendelse af Welch t-test ved hjælp af R-software (R Foundation for Statistisk Computing version 2.15.1, gratis software tilgængelig på https://www.R-project.org) med p-værdier 0,01; N. S., ikke-signifikant)

doi: 10.1371 /journal.pone.0058325.s004

(EPS)

Figur S5..

Western blot-analyse af caspase-3 i siNR1D1 og siBIRC3 transficerede celler efter varmestress. Western blot-analyse viste, at den spaltede caspase-3 kategorier 24 timer efter behandling steg i siNR1D1- og siBIRC3-transficerede celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0058325.s005

(TIF)

Figur S6 .

chromatinkondensation analyse i siNR1D1 og siBIRC3 transficerede celler efter varmestress. Ved udsættelse for varme stress, celler med ophævet NR1D1 viste signifikant stigning i chromatinkondensering sammenlignet med celler transficeret med siLuc, mens ophævelsen af ​​BIRC3 tendens til at forøge graden af ​​chromatinkondensering uden at vise statistisk signifikans. Data er udtrykt som gennemsnit ± SD (*, P 0,05; NS, ikke-signifikant)

doi: 10,1371 /journal.pone.0058325.s006

(EPS)

Tak

forfatterne takker Prof. Akihisa Takahashi, Gunma University for gave malignt gliom cellelinje M059K og M059J.