PLoS ONE: Designing Nanoconjugates til effektivt målrette bugspytkirtelkræftceller In vitro og in vivo

Abstrakt

Baggrund

Kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA. Monoklonale antistoffer er en farbar vej for at hæmme kræft vækst behandling. Tumorspecifik lægemiddelafgivelse kunne opnås udnytte disse monoklonale antistoffer som målrettede midler. Denne type designer terapeutisk udvikler sig, og med anvendelse af guld nanopartikler er en lovende fremgangsmåde til selektivt at levere kemoterapeutiske midler til maligne celler.

Nanopartikler af guld (BNI) viser ekstrem løfte i nuværende medicinske forskning. BNI er blevet vist at ikke-invasivt kill tumorceller ved hypertermi hjælp radiofrekvens. De er også blevet gennemført som tidlig påvisning midler på grund af deres unikke røntgenkontrastmidler egenskaber; succes blev afsløret med klar afgrænsning af blod kapillærer i en præklinisk model af CT (computer tomografi). De grundlæggende parametre for intelligent design af nanoconjugates er på forkant. Målet med denne undersøgelse er at definere de nødvendige designparametre at kunne målrette bugspytkirtelkræftceller.

Metode /vigtigste resultater

De er beskrevet i denne undersøgelse nanoconjugates blev karakteriseret med forskellige fysisk-kemiske teknikker. Vi viser, at antallet af cetuximab molekyler (målsøgende middel) på et BNI, den hydrodynamiske størrelse af nanoconjugates, tilgængelig reaktiv overfladeareal og evne til nanoconjugates at sekvestrere EGFR (epidermal vækstfaktor receptor), alle spiller kritiske roller i målretning tumorceller

in vitro

in vivo

i en ortotopisk model af kræft i bugspytkirtlen.

Konklusion

Vores resultater tyder den specifikke målretning af tumorceller afhænger på en række afgørende komponenter 1) målrettet middel til nanopartikel forholdet 2) tilgængeligheden af ​​reaktiv overfladeareal på nanopartikel 3) evne til nanoconjugate at binde målet og 4) hydrodynamiske diameter af nanoconjugate. Vi mener, at dette studie vil hjælpe med at definere designparametre for at formulere bedre strategier til specifikt at målrette tumorer med nanopartikler konjugater

Henvisning:. Khan JA, Kudgus RA, Szabolcs A, Dutta S, Wang E, Cao S, et al . (2011) Design Nanoconjugates til effektivt Target bugspytkirtelkræftceller

In Vitro

In Vivo

. PLoS ONE 6 (6): e20347. doi: 10,1371 /journal.pone.0020347

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: December 2, 2010; Accepteret: April 30, 2011; Udgivet: 27 juni 2011

Copyright: © 2011 Khan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health CA135011, CA136494, CA150190 og en MD Anderson Cancer center Developmental Grant (UTMD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft hævder næsten 25% af dødsfald årligt. Kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i Amerika, i både mænd og kvinder. Trods store bestræbelser på at opdage og behandle kræft i bugspytkirtlen, forbliver stort set den samme for forekomst og dødelighed. Tidlig diagnose og effektiv levering af terapeutiske midler til maligne celler forbliver de to store udfordringer i cancer strategier [1].

Monoklonale antistoffer mod vækstfaktorreceptorer har vist sig at være levedygtige behandlinger til inhibering cancervækst [2] . Ved hjælp af disse monoklonale antistoffer som målrette midler til tumor specifikke levering er udvikler sig som en lovende tilgang til selektivt at levere kemoterapeutika [3]. Uorganiske nanomaterialer bliver undersøgt som levering køretøj til målrettet drug delivery. Guld nanomaterialer er af særlig interesse på grund af den unikke fysisk-kemiske og optoelektroniske egenskaber, nem syntese og overfladebehandling [1], [4], [5], [6], [7], [8], [9] [10], [11], [12], [13].

Guld nanopartikler (BNI) er for nylig blevet anvendt til at dræbe tumorceller ved hypertermi ved hjælp af ikke-invasiv radiofrekvens [14]. Deres anvendelighed som kontrastmiddel er også blevet demonstreret ved klar afgrænsning af blod kapillærer i et præklinisk model ved CT (computertomografi) i sammenligning med de konventionelle iod baserede kontrastmidler [15]. Begge studier er håbefulde og deres nytte er yderligere opmuntret af sikkerhedsprofilen [16], [17].

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) er et vigtigt mål i kræftforskning. Det overudtrykkes i en række humane maligniteter, herunder kræft i bugspytkirtlen. Human EGFR er et transmembrant glycoprotein [3], [18], [19], [20]. Den består af et ekstracellulært ligandbindende domæne, et hydrofobt transmembrant domæne og et intracellulært tyrosinkinasedomæne. Ligandbinding til EGFR inducerer receptor homo /heterodimerisering fører til phosphorylering af tyrosinrester. Phosphorylering af EGFR aktiverer kompleks nedstrøms signalering begivenheder, der førte til spredning, migration, invasion, og hæmning af apoptose af cancerceller [21], [22], [23].

Det monoklonale anti-EGFR-antistof, Cetuximab (C225), er en unik målretning middel til at målrette EGFR-positive cancerceller. Cetuximab blev godkendt af FDA til behandling af patienter med EGFR positiv kolorektal cancer (CRC) [21], [22], [23]. Det er også blevet enten godkendt eller er i forskellige faser af kliniske forsøg i mange andre maligniteter såsom NSCLC (ikke-småcellet lungecancer), SCCHN (pladecellecarcinom i hoved og hals) og pancreascancer [24], [25] , [26]. Cetuximab er et kimerisk human:murine immunoglobulin G1 (lgG1) monoklonalt antistof (MoAb). Bindingen af ​​C225 til EGFR fører til receptor internalisering og nedbrydning uden receptor fosforylering, og dermed hæmme EGFR-associerede veje [24], [25], [26].

På trods af den nye nytten af ​​BNI i målrettet levering grundlæggende spørgsmål forbliver ubesvarede. Hvad er designkriterier for opdigte nanoconjugates, der vil sikre maksimal optagelse i kræftceller? Heri udnytter vi cetuximab (C225) som et målsøgende middel og BNI som et modelsystem. Vi viser, at antallet af C225 antistoffer på en BNP (C225:GNP forhold), den hydrodynamiske størrelse, den tilgængelige reaktive overfladeareal og evne nanoconjugate at binde EGFR, alle spiller kritiske roller i målretning tumorceller

i vitro

in vivo

i en ortotopisk model af kræft i bugspytkirtlen. Optagelse studier med isotypekontrol, BNP-IgG, indikerer, at specificiteten af ​​tumor celle målretning er afhængig af nanopartikel overflade dækning af C225. Uspecifik optagelse falder, når C225 til BNP forholdet stiger. Disse undersøgelser er afgørende for at udvikle et effektivt målrettet levering system til fremtidig klinisk brug.

Arbejdet præsenteret heri viser systematisk karakterisering af BNI-C225 nanoconjugates. Den specifikke målretning potentiale blev undersøgt, både

in vitro

in vivo

i en ortotopisk model af kræft i bugspytkirtlen. Vores resultater viser, at den hydrodynamiske radius, tilgængelige reaktive overfladeareal og lastkapacitet på C225 på BNI spille kritiske roller til effektiv målretning af tumorceller. Disse resultater fremhæve vigtige parametre, der skal overvejes for en lovende nanopartikel baseret drug delivery system til fremtidig klinisk anvendelse.

Resultater

Karakterisering af nanoconjugates med variabel antistof til nanopartikler nøgletal

for at forstå de parametre, der kræves for specifik målretning af nanoconjugates til tumorceller, valgte vi cetuximab (C225) som et målsøgende middel. C225 er et kimært humant-murint monoklonalt antistof, der binder til det ekstracellulære domæne af EGFR [3]. EGFR overudtrykkes i en række humane maligniteter herunder pancreascancer, som gør dem til et attraktivt mål [18]. At bestemme den optimale valens C225 på BNI (antallet af C225 molekyler pr BNI og dermed C225:GNP ratio) for intracellulære optagelse syntetiserede vi forskellige nanoconjugates med flere C225:GNP nøgletal. Karakterisering af disse nanoconjugates blev udført ved anvendelse flere fysisk-kemiske teknikker: UV-synligt lys (UV-Vis-spektroskopi), transmissionselektronmikroskopi (TEM), dynamisk lysspredning (DLS) og radioiodering af C225 med

125I. De BNI anvendt i denne undersøgelse blev syntetiseret med natriumborhydrid reduktion af tetrachloroaurate [27], [28]. Som tidligere rapporteret, at tilstedeværelsen af ​​en overfladeplasmonresonans bånd ved ca. 510 nm bekræfter dannelsen af ​​sfæriske guld nanopartikler (Figur S1). Dannelsen af ​​sfæriske BNI og deres 5 nm diameter størrelse blev yderligere bekræftet af TEM (data ikke vist).

De BNP-C225 konjugater blev derefter syntetiseret ved hjælp af denne nøgne BNP løsning og oprenset som beskrevet i de materialer og metoder sektion. Antistoffet spontant binder til BNI gennem Au-S og Au-N binding [19]. Produktionen af ​​BNI-C225 blev overvåget af UV-Vis spektroskopi. Det er klart, at med tilsætning af C225 der en gradvis rød forskydning i SPR-båndet af de nøgne guld, fra 510 nm til 519 nm (figur 1a). Sådan en rød forskydning i SPR bånd af BNI foreslår den forstyrrelse af det elektriske dobbeltlag af antistoffet omgiver BNI og dermed indikerer binding af antistoffet til nanopartiklerne [29], [30].

a . Ændring i absorptionsmaksima som en funktion af stigende koncentration af C225 i fravær (kugler) og tilstedeværelse af NaCl (trekanter). b. Koncentration af C225 bundet til BNP som funktion af stigende koncentration af C225, bestemmes ved at måle koncentrationen af ​​frit C225 mærket med I125 i supernatanten efter pelletering ned BNP-C225 konjugater ved ultracentrifugering.

for yderligere at bekræfte BNP-C225 konjugation vi udfordrede nanoconjugates mod salt aggregering (kritisk koagulation koncentration). Tilsætning af 140 mM NaCl er blevet rapporteret at resultere i aggregering af nøgne eller delvist dækket partikler, såsom aggregation fører til en dramatisk rød forskydning i SPR-båndet. Absorptionsspektrene af nanoconjugates blev registreret 15 minutter efter inkubation med 140 mM natriumchlorid (NaCl). Som forventet viste nøgne BNI en drastisk rødforskydning i SPR band fra 510 nm til omkring 600 nm (figur 1a) bekræfter sammenlægning af udækkede nanopartikler [31]. Salt aggregering var direkte relateret til den øgede belastning af C225 på BNI overfladen, dermed SPR bandet helt forsvundet på en C225 til BNP-forhold på 3 (tre C225 molekyler pr BNP), hvilket tyder fraværet af tilgængelige reaktiv overflade salt aggregering.

Kvantificering af C225 binding til guld nanopartikler ved radioiodering

bindingen af ​​C225 til BNI blev kvantificeret ved hjælp af radioaktivt mærket

125I-C225. En fast koncentration af BNI blev inkuberet med

125I-C225 ved forskellige C225:GNP nøgletal. Konjugaterne blev centrifugeret ved høj hastighed (45000 g) i 1 time for at adskille ubundet antistof fra nanoconjugates. Effektiviteten af ​​BNI-C225-I

125 binding blev derefter bestemt ved at måle emissionen af ​​gammastråler stammer fra den frie og bundne

125I-C225 i supernatanten og pelletfraktioner hhv. Som vist i figur 1b og figur S2, der var en meget høj binding procentdel af C225 (-90%) til BNI op til et forhold på 3 (3 C225 molekyler pr BNI). Imidlertid iagttages en minimal stigning i binding ovenfor et forhold på 3. Denne lille stigning ved høje antistofkoncentrationer kan skyldes svage uspecifik protein-protein interaktioner mellem det bundne og frie antistof. Disse data yderligere bestyrker bemærkningerne fra UV-Vis spektroskopi omtalt ovenfor; hvor omfanget af salt aggregering viste sig at være minimal i et forhold på 3.

Målrettet tilførsel af nanopartikler af guld til bugspytkirtelkræftceller in vitro

For at forstå den rolle multivalens på den intracellulære optagelse af humane kræft i bugspytkirtlen cellelinjer med variabel EGFR, vi behandlede AsPC-1, PANC-1 og MiaPaCa-2 celler med BNP-C225 eller uspecifik isotypekontrol BNP-IgG på forskellige antistof til BNI (Ab:GNP) nøgletal. EGFR-ekspression i disse celler følger rækkefølgen AsPC-1≥PANC-1 MiaPaCa-2 [19]. Mængden af ​​cellulære optagelse til BNP-C225 og BNP-IgG, som de forskellige cellelinjer blev kvantificeret ved at bestemme guldindhold i cellerne gennem instrumental neutronaktiveringsanalyse (INAA). Figurerne 2a, 2b og 2c repræsenterer guldindhold på AsPC-1, PANC-1 og MiaPaCa-2-celler, hhv. Det fremgår tydeligt af figurerne, at optagelsen af ​​de nanoconjugates i alle tre cellelinier gradvist stiger med stigende C225:GNP ratio (øget valens). Den maksimale optagelse blev observeret med 1,5-forhold (sorte søjler) i; ud over dette forhold optagelsen af ​​de nanoconjugates nedtrappes. Optagelsen tendens i nanoconjugates følger et lignende mønster i alle tre cellelinjer. Det er også vigtigt at bemærke, at omfanget af optagelsen var meget mindre for de tilsvarende forhold for isotypekontroller, BNI-IgG (grå søjler). Interessant nok ikke-specifik optagelse af BNI-IgG gradvist faldt med stigende IgG:GNP forhold, hvor minimum optagelse blev observeret i forholdet 3. Det er sandsynligt, at i den nedre Ab:GNP ratio, det tilgængelige frie reaktive overfladeareal på BNI kan ikke-specifikt binder enten til de serumproteiner eller cellemembraner eller begge; hvilket kan fremme den ikke-specifikke optagelse af nanoconjugates. Adsorption af serumkomponenter er kendt for at påvirke optagelsen af ​​BNP [32]. Stigende Ab:GNP forhold bør øge antistof dækning af nanopartikel overflade, hvorved der tilvejebringes mindre åbent areal til rådighed for ikke-specifikke interaktioner. Reduktion af sådanne ikke-specifikke interaktioner kan forklare reduceret optagelse af BNI-IgG-konjugater observeret ved højere forhold (figur 2).

a. AsPC-1 celler, B. PANC-1-celler, c. MiaPaCa-2-celler, behandlet med BNP-C225 (sorte søjler) eller BNP-IgG (grå søjler) forberedt på forskellige Ab:GNP nøgletal. Y-aksen repræsenterer Guld koncentration som ppm af den samlede tørvægt af celler.

internalisering af de nanoconjugates ved bugspytkirtelkræftceller in vitro

For yderligere at bekræfte den intracellulære optagelse og lokalisering af BNI, TEM-analyse blev udført efter behandling af cellerne med de samme nanoconjugates anvendes til optagelses- forsøg. Figur 3 viser TEM mikrografier af AsPC-1 celler efter behandling med BNP-C225 ved varierende C225:GNP nøgletal. Lav, middel og høj forstørrelse billeder er repræsenteret for C225:GNPs forhold på 0,38, 1,5 og 3,0 (figur 3). De nanoconjugates vises inden for de vesikuløse strukturer i cellerne, hvilket bekræfter intracellulær optagelse af nanoconjugates. Lignende resultater blev også opnået med PANC-1 og MiaPaCa-2-celler (figur S3, S4). Forskellen optagelse af BNI ved kræftcellerne har forskellige C225:GNP nøgletal kan også være på grund af forskellen affinitet nanoconjugates at binde EGFR, eller størrelsen af ​​nanoconjugates. Interessant, når de samme cellelinier blev behandlet med BNI-IgG, isotype kontrol, de fleste af de BNI findes ved periferien af ​​cellemembranen med minimal endocytose (fig S5). Dette er i overensstemmelse med en nylig rapport, der beskriver målretning af en fast tumor med transferrin belagt BNI [33].

TEM billeder ved forskellige forstørrelser, viser internalisering af BNI-C225. Se venligst figur S3 og S4 for TEM billeder, der illustrerer BNP-C225 internalisering af PANC-1 og MiaPaCa-2 celler.

Hydrodynamisk diameter nanoconjugates og deres evne til at udskille EGFR

i et forsøg på at fremkalde den mekanisme for differentieret optagelse af BNI-C225, vi hypotese, at de forskellige C225:GNP nøgletal besidder differentieret evne til at binde EGFR. For at validere denne hypotese, udførte vi western blot-analyse. De forskellige BNI-C225 og BNI-IgG-konjugater blev inkuberet med AsPC-1 cellelysater i 2 timer, derefter centrifugeret ved høj hastighed. Pelleten blev vasket en gang og derefter supernatanten og pelleten blev udsat for Western blot-analyse til påvisning af den relative forekomst af EGFR i de forskellige fraktioner. Resultaterne er vist i figur 4a. Dette viser klart der en gradvis udtømning af EGFR i supernatanten med en stigende C225:GNP ratio (midterste panel). Også interessant at bemærke en berigelse af EGFR i pelletfraktionen (øvre panel) nåede et plateau ved et forhold på 1,5 til 2,29, mest sandsynligt en funktion af C225 belastning på pelleten overflade. p-actin-niveauer blev anvendt som indlæsning kontroller demonstrerer lige belastning af protein i forskellige baner. Det er også vigtigt at bemærke, at når de samme lysater blev behandlet med BNI-IgG, blev næppe nogen påviselig EGFR findes i pellet fraktion, hovedsagelig den blev fundet i supernatantfraktionen, hvilket yderligere bekræfter bindingsspecificiteten af ​​BNI-C225 til EGFR. Sammen disse data tyder på, at BNP-C225 konjugater specifikt kan binde EGFR fra cellelysater og sekvestrerende evne stiger med et stigende antal C225 molekyler på BNI overfladen.

a. Binding af BNI-C225 og BNP-IgG til EGFR verificeret af Western Blot-analyse. Cellelysater fra AsPC-1-celler blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med BNI-C225 og BNI-IgG-konjugater med forskellige forhold af antistof på overfladen af ​​partiklen. Efter inkubation blev prøverne centrifugeret ved høj hastighed, og supernatanten blev opsamlet, og pelleten blev vasket en gang og respun; den nanoconjugate fraktion var 20 gange koncentrationen af ​​supernatanten. Pelleten og supernatanten fraktioner blev sat på en 7,5% SDS-PAGE-gel og analyseret for EGFR. b. Hydrodynamisk diameter af BNI-C225 målt ved dynamisk lysspredning spektroskopi

evne til nanoconjugates til at udskille EGFR med en C225:GNP forhold på 1,5 til 3 ligner.; imidlertid nedsætter

in vitro

intracellulære optagelse efterhånden som forholdet ændres fra 1,5 til 3. For at forklare den faldende optagelse af nanoconjugates med en stigende C225:GNP ratio, undersøgte vi rollen som den hydrodynamiske diameter af nanoconjugates . Den hydrodynamiske diameter (HD) af konjugaterne blev bestemt ved dynamisk lysspredning spektroskopi (DLS) målinger (figur 4b). For nylig, HD er blevet vist at være kritiske for tumortargeting af quantum dots [34]. Endvidere er også blevet påvist, at den

in vitro

cellulære optagelse og reaktion er afhængig af størrelsen af ​​nanoconjugates. Ved konjugation med en 0,38 C225:GNP forhold HD af BNI straks stiger fra 7 nm til 21 nm, hvilket yderligere bekræfter bindingen af ​​C225 til BNI overfladen [35]. HD forbliver omkring 21 nm indtil et forhold på 2,29 derefter brat stiger i et forhold på 3. Det skal bemærkes fra fig 1b og S2, at næsten alle antistofmolekyler forbliver bundet til BNI overflade op til et forhold på 3. Men der er kun en gradvis stigning i binding over dette forhold, sandsynligvis tilskrives uspecifik binding. Denne ikke-specifik binding af antistof molekyler kan være årsag til dannelsen af ​​en løs sekundært lag omkring BNP-C225 resulterer i en kraftig stigning i HD ved højere C225:GNP nøgletal. Sådan en kraftig stigning i HD kunne også være på grund af heterogenitet af prøven. Opnåelsen af ​​et diskret antal antistofmolekyler pr BNI er meget vanskeligt at opnå eksperimentelt. Forholdet mellem multivalensen af ​​nanopartiklerne af deres hydrodynamiske diametre skal undersøges nærmere. TEM analyse bekræftede, at den kraftige stigning i HD ikke skyldes sammenlægning af nanopartiklerne. TEM mikrografier viste ikke nogen signifikant sammenlægning af nanopartiklerne med forskellige C225:GNP nøgletal (figur S6).

Levering af BNI-C225 i en ortotopisk model af kræft i bugspytkirtlen

For yderligere at undersøge evnen af ​​disse nanoconjugates til specifikt at målrette tumorceller

in vivo

, vi udnyttet en ortotopisk bugspytkirtelkræft model. Modellen blev genereret efter kirurgisk implantering AsPC-1 celler der udtrykker luciferase i bugspytkirtlen hos nøgne mus og lades vokse i 12 dage. Hver tredje dag blev musene injiceret med 200 pi ketamin og 100 pi luciferin og afbildes for tumorvækst progression af bioluminiscence measurments. Denne orthotopisk model forsøger at efterligne den menneskelige patogenese af pancreascancer [36] og tillader tumorceller at opleve virkningerne af mikromiljøet i bugspytkirtlen. På dag 12 blev BNP-C225 og BNP-IgG administreret intraperitonealt at studere tumoroptagelse og distribution af nanoconjugates med forskellige Ab:GNP forhold. Musene blev aflivet 24 timer efter nanoconjugate injektion og tumorerne og andre vitale organer blev indsamlet til bestemmelse af guldindhold af INAA. Figur 5a viser et repræsentativt eksempel på en bioluminescens billede af mus 12 dage efter ortotopisk implantation af tumorceller i bugspytkirtlen (øvre panel). Stærk bioluminescens antyder dannelsen og væksten af ​​en tumor i pancreas. Tumorvækst blev yderligere bekræftet ved måling af tumorstørrelsen i slutningen af ​​forsøgene efter ofre den mus (nederste panel). Tumoren størrelse målt ved hjælp af formlen ab

2/2 (a = længde, b = bredde) var ~62 mm

3, når nanoconjugates blev administreret for biodistributionsstudier. Figur 5b viser tumor optagelse af BNI-C225 og BNP-IgG ved varierende Ab:GNP nøgletal som funktion af guld bestemt ved INAA.

in vivo

in vitro

tumor optagelse af nanoconjugates fulgte et lignende mønster. Statistisk analyse under anvendelse af to-halet studerende t-test viste, at optagelsen af ​​BNI-C225 med et forhold på 0,76 og 1,5 var betydeligt højere end forholdet 3 (p 0,05). Desuden optagelsen af ​​de BNI-C225 konjugater var signifikant højere (p 0,05) end isotypekontrol, BNP-IgG på alle nøgletal undtagen 3. Som tidligere nævnt, HD af BNI-C225 forblev konstant fra et forhold på 0,38 til 2,29 (ca. 21 nm), men dramatisk forøges i et forhold på 3 (134 nm). Teoretisk set kunne den større HD af nanoconjugates i et forhold på 3, bidrager til lavere diffusion og i reduktion vending i optagelse [37]. Dette illustrerer, at HD er en kritisk faktor for

in vivo

optagelse og dermed en vigtig faktor for aktivt målretning. For yderligere at undersøge den intratumoral (inde i cellerne, eller i vaskulaturen eller i kapslen uden for tumorvævet) placering af nanoconjugates, udførte vi TEM på tumorvæv vist i figur 5a, som blev opnået efter at ofre musene 24 timer bogføre intraperitoneal administration af forskellige nanoconjugates. Figur 6 viser placeringen af ​​BNI i forskellige områder af tumorvæv i tilfælde af BNI-C225 (C225:GNP 3.0 (figur 6a og b) og 1,5 (figur 6c) behandlede grupper. Det er klart, at BNI er inde i cellerne ( Figur 6a, venstre og højre panel er billeder af det samme område, forskellig forstørrelse) samt kapslen omfatter tumorvævet (figur 6b, venstre og højre panel er billeder af det samme område, forskellig forstørrelse). imidlertid nanoconjugates er meste lokaliseret uden for tumorvæv i tilfælde af BNP-IgG behandlede gruppe (IgG:GNP 1.5) (Figur S7).

a. bioluminescens billeder på dag 12 skildrer tumor tilstedeværelse (øverste panel) og digitalkamera billeder (nederste panel) af tumorer udtaget efter afslutningen af ​​ovennævnte mus. musene blev aflivet på dag 13, 24 timer efter nanoconjugate behandlinger. f.

In vivo tumor

optagelse af BNI-C225 og BNP-IgG konjugater med varierende forhold af antistof; 24 timer efter intraperitoneal injektion af konjugaterne i en orthotopisk model af pancreascancer. Optagelsen blev bestemt ved måling af guld koncentration i tumorer ved INAA. Y-aksen repræsenterer guld koncentration som ppm.

a og b. BNP-C225 med ratio 3.0 af Ab:GNP er vist til venstre i en lav forstørrelse for at vise et stort overfladeareal af tumorvæv og til højre forstørrelsen øges til belyse internalisering af konjugaterne selv. c. BNP-C225 med forholdet 1,5 af Ab:GNP er vist til venstre i lav forstørrelse for at vise et stort overfladeareal af tumorvæv og til højre forstørrelsen øges for at afsløre konjugaterne selv inde cellulære rum.

tilstedeværelsen af ​​injicerede konjugater i andre større organer blev også bestemt af INAA (figur S8). Guld optagelsen blev også fundet i andre organer, såsom milt, lever, lunge, nyre og hjerne [38], [39].

Diskussion

Målrettet levering af uorganiske nanomaterialer er et væsentligt område forskning for nanomedicin. Unikke fysisk-kemiske egenskaber af uorganiske nanomaterialer kan anvendes i adskillige biomedicinske applikationer såsom påvisning /diagnosticering, terapi og billeddannelse. Således er det vigtigt at definere designparametre til specifikt levere nanoconjugates til cellerne af interesse. Der er flere vigtige faktorer, der kan definere succes målrettet levering; (I) udvælgelse af en passende model til at studere tilgang levering; (Ii) udvælgelse af en effektiv målretning middel; (Iii) optimering af antallet af målrettede midler pr nanopartikel; (Iv) tilgængelighed af frit reaktivt område på partikeloverfladen, der kan initiere ikke-specifik binding; (V) evne targetingmidlet at sekvestrere målet og (vi) hydrodynamisk størrelse nanoconjugates.

De fleste af leveringen strategier er testet i ikke-ortotopisk modeller, hvor tumorer er genereret væk fra det oprindelige websted. En stor fordel for denne model er tumorer er nemt at udvikle og vækst kan overvåges ved manuel måling med skydelære. En ulempe ved denne model er, at tumorcellerne ikke oplever en sand tumormikromiljøet. I modsætning hertil ortotopisk model implantater tumorceller i organet for tumor oprindelse, som gør dem en mere realistisk model. Således valgte vi ortotopisk model til at studere designparametre nødvendige for nanoconjugates med held og specifikt at målrette en tumor.

Vi valgte Cetuximab som målsøgende middel og guld nanopartikler som stilladset til målretning levering. En af de store fordele ved at udnytte guld nanopartikler er deres dannelse af stabile bindinger med biomolekyler, såsom organothiols, organoamines, proteiner og antistoffer [5]. Vi demonstrerede signifikant binding af cetuximab til BNI op til et forhold på 3. (C225:GNP = 3) over hvilket observeres kun en marginal stigning i binding. Denne marginal stigning kan skyldes manglen på gratis reaktivt overfladeareal tilbage på BNI. Karakteren af ​​binding mellem guld og proteiner har været genstand for intens undersøgelse i de sidste adskillige årtier. Det er nu generelt accepteret, at der er tre hovedtyper af samspil, der opstår mellem et protein /antistof og en guld nanopartikel; (I) elektrostatiske interaktioner af negativt ladede BNI med positivt ladede proteiner; (Ii) kovalente interaktioner mellem thiol /amingrupper til stede i aminosyrerester i antistoffer og BNI; og (iii) hydrofobe interaktioner mellem proteiner og BNI [19], [40]. Ved hjælp af X-ray photoelectron spectroscopy og termogravimetrisk analyse vi tidligere vist, at cetuximab udnytter thiol- og aminfunktionaliteter til at binde til overfladen af ​​guld nanopartikler [19], [40].

Det er også nødvendigt at validere designparametre for forskellige cellelinier med variabel ekspression af target-receptoren. Dette er særlig vigtigt i betragtning af den heterogene karakter af tumorer. I disse undersøgelser anvendte vi tre forskellige bugspytkirtelkræft cellelinjer med variabel udtryk for EGFR. Vi viste også, at intracellulære optagelse af BNI-C225 er ikke kun afhænger af antallet af cetuximab molekyler, men også afhænger af deres evne til at binde EGFR, samt den hydrodynamiske størrelse af nanoconjugates. Det er også klart, at ikke-specifik optagelse kan minimeres

in vitro

ved at optimere dækningen af ​​det målrettende middel på nanopartikel overflade. Maksimal specifikke optagelse af BNI-C225 er observeret, når der er tre C225 molekyler på en BNP, selv om den samlede optagelse reduceres. Disse data viser yderligere den kombinerede vigtighed af antallet af målrettede midler pr partikel og det hydrodynamiske størrelse af nanoconjugates. Dette afspejles også i forskellen mellem den specifikke optagelse af BNI-C225 og den ikke-specifikke optagelse af BNI-IgG.

For nylig har flere grupper haft fokus på at forstå de designparametre for effektivt at målrette tumorer med nanoconjugates i en præklinisk model. Det er også blevet rapporteret, at en nanoconjugate med en størrelse på 100 nm effektivt målretning tumorceller [41]. Antistof-målrettede liposomer har vist sig at udøve forbedret virkning end deres ikke-målrettede modparter [42]. Desuden levering af siRNA hjælp overføre målrettet polymere nanopartikler viste bedre effekt, selvom deres kinetik, biodistribution og tumor optagelse var ens [43]. Lignende observationer blev også gjort i en undersøgelse af transferrin-coatede guld nanopartikler; Det blev påvist, at ligand indhold på nanopartiklerne er vigtige for målretning [33]. Her har vi undersøge en ortotopisk model af pancreascancer og til gengæld demonstrere de kritiske roller at antallet af antistofmolekyler på BNI, evne nanoconjugates at binde mål-receptoren, tilgængeligheden af ​​den reaktive overflade for ikke-specifik interaktion . og den hydrodynamiske størrelse af nanoconjugates alle spille i effektivt design

samlet vores data tyder på, at den specifikke målretning af tumorceller afhænger af en række vigtige faktorer; 1) targetingmiddel til nanopartikel-forhold; 2) tilgængelighed af den reaktive overfladeareal på nanopartikel; 3) evne til nanoconjugate at binde målet og 4) hydrodynamiske diameter af nanoconjugate. , Intelligent design for en vellykket målretning af tumorceller Således kræver optimering af disse afgørende faktorer. Vi mener, at dette studie vil hjælpe med at definere designparametre for at formulere bedre strategier til specifikt at målrette tumorer med nanopartikler konjugater.

Materialer og metoder

Syntese og karakterisering af BNI-antistof-konjugater