PLoS ONE: MIR-1178 Fremmer spredning, G1 /S Transition, migration og invasion af bugspytkirtelkræftceller ved Målretning CHIP

Abstrakt

CHIP, en co-chaperone-protein der interagerer med HSC /Hsp70, har vist sig at være under-udtrykt i bugspytkirtelkræftceller og har vist potentiale tumor suppressor ejendom. Ikke desto mindre er de underliggende mekanismer af CHIP regulering i bugspytkirtelkræftceller fortsat ukendt. I denne undersøgelse fandt vi, at miR-1178 faldt oversættelsen af ​​CHIP protein ved at målrette 3′-UTR region. Vi observerede, at overekspression af MIR-1178 lettet proliferation, G1 /S overgang, migration og invasion af pankreatiske cancerceller. Omvendt inhiberingen af ​​MIR-1178 ekspression undertrykte signifikant disse fænotyper. Endvidere CHIP overekspression ophævede MIR-1178-induceret celleproliferation og invasion. Vore data antyder, at MIR-1178 fungerer som en oncomiR i bugspytkirtelkræftceller ved inhibering CHIP ekspression

Henvisning:. Cao Z, Xu J, Huang H, Shen P, Du L, Zhou L, et al. (2015) MIR-1178 Fremmer spredning, G1 /S Transition, migration og invasion af bugspytkirtelkræftceller ved at målrette CHIP. PLoS ONE 10 (1): e0116934. doi: 10,1371 /journal.pone.0116934

Academic Redaktør: Jose G. Trevino, University of Florida, USA

Modtaget: 31 jul 2014; Accepteret: 16. december 2014 Udgivet: 30 Jan 2015

Copyright: © 2015 Cao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.272.484), Beijing Natural Science Foundation (nr 7.132.179), Major stat Basic Research Development Program Kina (973 Program, No. 2014CB542300), Research særlige fond for offentlig velfærd Industry of Health (nr 201.202.007), og National Science Teknologi Søjle Program under tolvte femårsplan periode (nr 2014BAI09B11). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA [1]. Eksisterende behandlinger har ringe effekt på forbedring overlevelse hos patienter med pancreascancer [2-4]. Der er et presserende behov for at udforske de mekanismer tumorigenese, progression og metastase af kræft i bugspytkirtlen og kortlægge nye terapeutiske mål.

CHIP, en co-chaperone protein, der interagerer med HSC /Hsp70 [5], fremmer ubiquitinering og nedbrydning af talrige vigtige cancer-relaterede proteiner, såsom NF-KB [6, 7], Met [8] og p53 [9-11]. Tidligere fandt vi, at CHIP undertrykt pancreascancer celleproliferation, forankringsuafhængig vækst, migration og invasion ved at mediere nedbrydningen af ​​EGFR. Et lavt ekspressionsniveau af CHIP blev korreleret med en forværret prognose hos patienter med pancreascancer [12]. Men mekanismerne i reguleringen af ​​CHIP udtryk i bugspytkirtelkræftceller forbliver ukendt.

MikroRNA’er (miRNA) er små, endogene, kodende RNA-molekyler med en vigtig rolle i den post-transkriptionel regulering af genekspression [13 -16]. Guo J

et al

. [17] fandt, at MIR-764-5p hæmmer proteintranslation af CHIP i mus. Men om miRNA regulerer CHIP udtryk i humane cancerceller er ikke blevet påvist, tidligere.

I den aktuelle undersøgelse, vi udført en

i silico

skærm af miRNA at identificere mulige regulatorer af CHIP udtryk. Vi fandt, at miR-1178 retter sig mod 3′-UTR af CHIP mRNA og negativt regulerer oversættelse af CHIP. Endvidere MIR-1178 ekspression bidrager til pancreascancer celleproliferation, G1 /S overgang, migration og invasion. Vi fandt også, at virkningerne af MIR-1178 er reversible ved overekspression af CHIP. Vores resultater tyder på, at miR-1178 udtryk accelererer bugspytkirtlen tumorigenese ved direkte hæmning af CHIP udtryk.

Materialer og metoder

cellelinjer og reagenser

De humane pancreas cancer cellelinjer BxPC-3, PANC-1, SW1990 og MiaPaCa-2 var gaver fra Dr. Freiss H (University of Heidelberg, Heidelberg, Tyskland) [18, 19]. Disse cellelinier blev passeret i mindre end 6 måneder efter genoplivning. Ingen reauthorization blev udført. Cellerne blev dyrket i RPMI 1640 eller Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% FBS (begge typer medium var fra HyClone, Utah, USA), 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en befugtet inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C.

Cell transfektion

Panc-1 og BxPC-3-celler blev podet i plader med 6 brønde, dyrket natten over, og derefter transficeret med miR-1178 efterligner, et miR-1178 hæmmer eller deres matchede negative kontroller (alle fra GenePharma, Shanghai, Kina). Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) blev anvendt til celletransfektion ifølge producentens anvisninger. Celler blev indsamlet til yderligere analyser efter yderligere 48 timers inkubation.

RNA-isolering og kvantitativ real-time RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra transficerede celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, USA ) ifølge producentens instruktioner. Revers transkription blev udført ved anvendelse af en revers transkription-kit (Promega, Madison, USA). CHIP mRNA-niveauer blev målt ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) med SYBR Green PCR Kit (Takara, Japan). Ekspressionsniveauerne af kønsmodne MIR-1178 blev kvantificeret ved MIR-QRT-PCR under anvendelse af Hairpin-det miRNA qPCR kvantificeringskit (GenePharma, Shanghai, Kina), som indeholdt en stamme-løkke-lignende RT-primeren og PCR-primere specifikke for de forskellige miRNA eller til den interne kontrol U6 RNA. Analyser blev udført på Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System (Life Technologies, South San Francisco, USA). Fold ændringer blev beregnet under anvendelse af 2

-ΔΔCT metode. De omvendte primere for GAPDH og CHIP blev syntetiseret ved Invitrogen (USA). Primersekvenser er vist i S1 tabel. Udtrykket af miR-1178 blev anset høj, når ekspressionsniveauet var lig med eller over medianen af ​​kohorten og lav, når niveauet var under medianen af ​​kohorten. Det QRT-PCR-analyser blev gentaget mindst 3 gange.

Western blot-analyser

Efter 48 timers transfektion i 6-brønds plader blev celler lyseret med RIPA buffer (Applygen, Beijing, Kina ). Lysater blev denatureret med natriumdodecylsulfat (SDS) prøvepuffer ved 100 ° C i 5 minutter og adskilles ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), efterfulgt af overførsel til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, MA, USA). Efter blokering med 5% fedtfri tørmælk ved stuetemperatur i 1 time, blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer. Antistofferne er vist i S2 tabel. Efter vask med TBST blev membranerne inkuberet med sekundære antistoffer (Applygen, Beijing) ved stuetemperatur i 1 time. Proteinbånd blev visualiseret med elektrokemiluminescens (ECL) detektionssystem, og ekspressionsniveauerne af proteinerne blev vurderet ved anvendelse Image-Pro Plus 6.0 software (Media Cybernetics, USA). Western blot analyser blev gentaget mindst 3 gange.

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev analyseret under anvendelse af en celletælling kit (CCK-8) (Dojindo, Japan). PANC-1 (4 × 10

5 celler /brønd) og BxPC-3 (5 × 10

5 celler /brønd) blev cellerne transficeret i 6-brønds plader. Efter 24 timer blev cellerne opsamlet og udsået i 96-brønds plader (1000 celler /brønd). Celleproliferation blev målt hver dag i 4 dage. På hvert tidspunkt, 10 pi /brønd CCK-8-reagens blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i 2,5 timer ved 37 ° C. Optisk densitet (OD) blev målt ved 450 nm og 630 nm ved en mikropladelæser (Wellscan MK3, Thermo Labsystems, Finland). CCK-8 assay blev gentaget 3 gange med seks replikater

Cell migration og invasion assay

Cell migration og invasion blev vurderet ved anvendelse Transwell migration kamre (8 um porestørrelse, Corning, USA). . Membranerne for invasionen assay blev overtrukket med en fortyndet ECM-opløsning (Sigma-Aldrich, Shanghai, Kina). PANC-1 (2 × 10

4 celler /brønd) eller BxPC-3 (4 × 10

4 celler /brønd) Celler blev podet i den øvre del af et kammer med serum-frit medium efter transfektion. Medium indeholdende 10% FBS tjente som en kemoattraktant i det nedre kammer. Efter 48 timers inkubation ved 37 ° C blev ikke-invaderede celler på toppen af ​​membranen skrabet og fjernet ved vatpinde, og de invaderede celler blev vasket med PBS, fikseret med 90% ethylalkohol, farvet med hematoxylin og derefter talt ved hjælp af lysmikroskopi. Migrationen og invasion assay blev gentaget 3 gange med dobbelte brønde.

Cellecyklusanalyse

I cellecyklus-assayet blev celler høstet 48 timer efter transfektion og fikseret i 70% ethanol ved 4 ° C natten over. Efter vask to gange med PBS blev cellerne inkuberet med 30 pg /ml propidiumiodid (PI), 0,2 mg /ml RNase A, og 0,2% Triton X-100 (alle fra Sigma-Aldrich, USA) ved 37 ° C i 30 minutter. Cellerne blev derefter analyseret ved flowcytometri (BD Biosciences, USA).

Dual-luciferaseanalyse

For at vurdere, om CHIP er et direkte mål for miR-1178, den pMIR-RAPPORT assay var anvendes. Chippen 3′-UTR vektorer indeholdende vildtype eller muteret frø sekvens blev konstrueret ved og indkøbt fra GenePharma (Shanghai, Kina). PANC-1-celler blev podet i 12-brønds plader (1 × 10

5 celler /brønd) og co-transficeret med vildtype eller mutant vektor og 50 nM MIR-1178 efterligner eller NC efterligner anvendelse af lipofectamin 2000. Ved 24 timer efter transfektion blev luciferaseaktivitet målt ved anvendelse af Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) ifølge producentens protokol.

Statistisk analyse

SPSS v. 13.0 software (SPSS, Inc., Chicago, IL) blev anvendt til statistiske analyser. Kontinuerte data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD) og blev sammenlignet ved Students t-test eller Fishers eksakte test.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

CHIP er et direkte mål for miR-1178

At identificere regulatorer af CHIP udtryk, blev åben adgang software Targetscan brugt. Ifølge forudsigelse af Targetscan blev MIR-1178 identificeret som en mulig regulator af CHIP ekspression. Vi fandt, at miR-1178 udtryk varierede blandt 4 humane bugspytkirtelkræft cellelinjer, herunder SW1990, BxPC-3, MiaPaCa-2, og PANC-1, hvor den relative ekspression niveauet af miR-1178 var 0,568 ± 0,12, 1,04 ± 0,05, 1,51 ± 0,07, og 0,87 ± 0,09, henholdsvis (figur 1A;.

P

0,01). De PANC-1 og BxPC-3-celler, som havde moderat ekspression af MIR-1178, blev anvendt i hele resten af ​​undersøgelsen.

(A) MIR-1178 ekspression varierede blandt 4 humane pancreas cancercellelinier. (B) A MIR-1178-bindingssted i 3′-UTR af CHIP blev forudsagt af Targetscan. (C) I PANC-1 celler, MIR-1178 efterligner undertrykt luciferaseaktiviteten af ​​reporteren indeholdende vildtype-CHIP 3′-UTR, men ikke den, der indeholder en mutant 3′-UTR. (D) Ekspressionsniveauerne for CHIP blev påvist ved western blot efter PANC-1 og BxPC-3-celler blev transficeret med de MIR-1178 efterligner eller inhibitoren. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (E) Transfektion med miR-1178 efterligner ikke undertrykke mRNA ekspressionen af ​​CHIP. Dataene er vist som middel ± SD. *

P

P

For at afgøre, om CHIP er et direkte mål for miR-1178, 3′-UTR af CHIP med vildtype eller mutante frø sekvens genkendelsessteder blev klonet ind i en dual-luciferase reporter (fig. 1B). Vi fandt, at luciferaseaktivitet blev reduceret efter co-transfektion af MIR-1178 efterligner med vildtype-vektor, sammenlignet med co-transfektion af MIR-1178 efterligner med mutanten vektor (

P

0,05 ) (fig. 1C). Vi yderligere evalueret mRNA og protein niveauer af CHIP efter ændring MIR-1178 ekspression. Resultaterne viste, at overekspression af MIR-1178 faldt betydeligt CHIP proteinekspression uden at påvirke CHIP mRNA-ekspression, sammenlignet med kontrollen. I modsætning hertil nedregulering af MIR-1178 forøget CHIP proteinekspression (fig. 1D, E). Disse data indikerer, at miR-1178 direkte kan målrette den forudsagte CHIP frø region.

MIR-1178 fremmet væksten og G1 /S overgang PANC1 og BxPC-3 celler

At udforske funktionen af miR-1178 i bugspytkirtelkræft blev miR-1178 efterligner og miR-1178 hæmmer anvendes. Efter transfektion med MIR-1178 efterligner eller inhibitoren, ekspressionen af ​​MIR-1178 var signifikant opreguleret eller nedreguleret, (fig. 2A). En CCK-8-analysen viste, at spredning satser PANC-1 og BxPC-3 celler blev forøget efter miR-1178 overekspression. I modsætning hertil MIR-1178 nedregulering inhiberede proliferationen af ​​bugspytkirtelkræftceller (fig. 2B). Desuden opregulering af miR-1178 fremmet G1 /S checkpoint overgang i både PANC-1 (S fase 30,17 ± 1,31% vs. 39,31 ± 1,51%,

P

0,01) og BxPC- 3 (S fasen 29.89 ± 1,56% versus 42.57 ± 3,74%,

P

0,05) celler, mens nedregulering af mIR-1178 førte til en forlængelse af G1-fasen (. fig 2C) .

(A) QRT-PCR viste, at efter transfektion af celler med MIR-1178 efterligner eller inhibitoren, ekspressionen af ​​MIR-1178 var signifikant opreguleret eller nedreguleret, henholdsvis. (B) En CCK-8 assay viste, at MIR-1178 overekspression fremmet proliferationen af ​​PANC-1 og BxPC-3-celler, mens nedregulering af MIR-1178 undertrykt celleproliferation. (C) Den opregulering af MIR-1178 lettede G1 /S overgangen i PANC-1 og BxPC-3-celler. I modsætning hertil blev et G1 /S cellecyklusstandsning observeret efter MIR-1178 inhibering. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD. *

P

P

0. 01.

MIR-1178 accelererede bugspytkirtelkræft celle migration og invasion

En transwell assay blev udført for at fastlægge den rolle, miR-1178 i bugspytkirtelkræft celle migration og invasion. Den overekspression af miR-1178 øget antallet af PANC-1 celler, der trængte ECM-coatede membran. I modsætning hertil blev invasiv af PANC-1 celler faldt betydeligt, da miR-1178 udtryk blev undertrykt. Lignende resultater blev fundet i BxPC-3-celler (fig. 3A). I overensstemmelse med dette fund blev de migrerende evner af disse to cellelinier også forbedret efter at cellerne blev behandlet med de MIR-1178 efterligner, mens der sås de modsatte resultater, når cellerne blev behandlet med MIR-1178 inhibitor (fig. 3B ).

Cell migration og invasion blev analyseret i membran-indeholdende transbrøndene uden eller med Matrigel. Celler, der var migreret eller invaderet til den nedre overflade af membranen blev farvet med hematoxylin og eosin og talt under et mikroskop ved 100 x forstørrelse. (A) Den opregulering af MIR-1178 ved transfektion af de efterligner forbedrede celleinvasion, mens MIR-1178 nedregulering afskrækket celleinvasion. (B) Over-ekspressionen af ​​miR-1178 forfremmet celle migration, mens nedregulering af miR-1178 hæmmede celle migration. *

P

P

0.01.

Downstream signalveje af miR-1178

I vores tidligere undersøgelse, viste vi, at CHIP er en roman tumorsuppressor i bugspytkirtelkræft via nedbrydningen af ​​EGFR. I betragtning af vores observation, at MIR-1178 nedreguleret ekspression af CHIP, vi hypotese, at MIR-1178 også kan regulere aktiviteten af ​​EGFR og dets nedstrøms signaleringskaskade. Vi fandt, at overekspression af MIR-1178 steg EGFR proteinniveauet og aktiveret den nedstrøms AKT /p21 pathway og Src /E-cadherin pathway (fig. 4A). I modsætning hertil inhiberingen af ​​MIR-1178 havde de modsatte virkninger (fig. 4B). Mange undersøgelser har vist, at EGFR /AKT /p21 og EGFR /SRC /E-cadherin veje spiller en vigtig rolle i udbredelsen, cellecykluskontrol, migration og invasion af bugspytkirtelkræftceller [20-23]. Således har vi spekuleret på, at ektopisk aktivering af EGFR /AKT /p21 og EGFR /SRC /E-cadherin veje delvist kunne redegøre for effekten af ​​miR-1178 i bugspytkirtelkræftceller.

(A, B) ekspressionsniveauerne af EGFR, p-AKT, AKT, p21, p-SRC, SRC og E-cadherin blev påvist ved western blot efter PANC-1 og BxPC-3-celler blev transficeret med de MIR-1178 efterligner eller inhibitoren. β-actin blev anvendt som en intern kontrol.

Over-ekspressionen af ​​CHIP ophævet miR-1178 proliferation, G1 /S overgang, migration og invasion af bugspytkirtelkræftceller

for yderligere at undersøge, om miR-1178 fremmer en malign fænotype ved at undertrykke CHIP i bugspytkirtelkræftceller vedtog vi en “redning” strategi for at undersøge den funktionelle relevans af miR-1178 /CHIP interaktion. PcDNA-CHIP eller pcDNA tom vektor blev transficeret i PANC-1-celler overudtrykker MIR-1178. Som vist i fig. 5A, blev niveauet af CHIP øget, når pcDNA-CHIP blev transficeret. Endvidere overekspression af CHIP inhiberede MIR-1178-induceret ekspression af EGFR, p-AKT og p-SRC. Efter aftale med inaktivering af EGFR og dens downstream veje, celle invasion, migration (fig. 5B), proliferation (fig. 5C) og G1 /S overgang (fig. 5D) blev alle undertrykt. Disse resultater indikerer, at MIR-1178 fremmer celleproliferation, G1 /S overgang, migration og invasion gennem nedregulering af CHIP.

(A) Western blot-analyse af CHIP, EGR, AKT, p21, SRC og E-cadherin-ekspression i PANC-1-celler, der var co-transficeret med enten pcDNA-chip eller pcDNA tom vektor og Mir-1178 efterligner. β-actin blev også påvist som en intern kontrol. (B) Transwell analyse af PANC-1 celler efter både co-transfektioner. (C) Vækstkurver for PANC-1-celler efter cotransfektion. (D) Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev beregnet ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -analyse. *

P

0. 05, **

P

0. 01.

Diskussion

I denne undersøgelse viste vi, at MIR-1178 målrettet 3′-UTR af chip-mRNA, hvilket resulterer i inhibering af CHIP proteintranslation. MIR-1178 lettet bugspytkirtelkræft celleproliferation, G1 /S overgang, migration og invasion ved at undertrykke CHIP udtryk. Vi konkluderer, at MIR-1178 er en endogen attenuator af CHIP udtryk, der fremmer en malign fænotype i bugspytkirtelkræftceller.

carboxylterminalen af ​​Hsp70-interagerende protein (CHIP) er medlem af E3 ubiquitin ligase, der fungerer som en sammenhæng mellem chaperone (varmechokprotein 70/90) og proteasom-systemer. CHIP er blevet påvist at være involveret i tumorigenese, proliferation og invasion i flere maligniteter [24], regulering af en række onkogene proteiner, herunder hypoxi-inducerbar faktor 1α (HIF-1α) [25], østrogenreceptor-α (ERa) [ ,,,0],26], og human telomerase-revers transkriptase [27]. Vi har tidligere fundet, at CHIP tjente som en ny tumor suppressor ved at nedregulere EGFR vej hos bugspytkirtelkræftceller. Udtrykket af CHIP blev reduceret i bugspytkirtelkræft væv [13]. Men den mekanisme af CHIP lavt udtryk stadig brug for flere undersøgelser.

Selvom stigende tegn har indikeret, at CHIP spiller en vigtig rolle i kræft [6, 28-30], forblev mekanismerne i CHIP regulering dårligt forstået. Indtil nu, var der kun to offentliggjorte undersøgelser fokuseret på de mekanismer, opstrøms regulering af CHIP. Shimamoto S

et al

. [31] rapporterede, at Ca (2 +) /S100 binder til TPR domænet og fungere som opstrøms regulatorer af CHIP. Guo J

et al

. [17] viste, at MIR-764-5p undertrykt CHIP proteintranslation i mus via binding til 3′-UTR af chip-mRNA. Men om miRNA kan regulere CHIP udtryk i humane cancerceller havde ikke tidligere fastlagt. Vores miRNA skærmen ved hjælp Targetscan software forudsagt, at CHIP kan være en af ​​de nedstrøms mål for miR-1178. For at bekræfte denne forudsigelse, udførte vi en luciferase reporter assay. Vi fandt, at luciferaseaktiviteten dramatisk blev reduceret efter co-transfektion af MIR-1178 efterligner med vektoren udtrykker vildtype CHIP 3′-UTR, sammenlignet med co-transfektion af efterligner med vektoren udtrykker et muteret CHIP 3′-UTR . Western blot-analyse yderligere vist, at overekspression af miR-1178 undertrykt CHIP proteinekspression. I modsætning hertil nedregulering af MIR-1178 forøgede CHIP proteinniveau. Disse resultater antyder, MIR-1178 direkte målrettet mod 3′-UTR af CHIP mRNA til at inhibere CHIP proteintranslation. Så vidt vi ved, det var første gang, at en miRNA, der kan inhibere ekspressionen af ​​CHIP protein blev opdaget i humane cellelinjer.

Stigende beviser har vist, at miRNA kan have både tumor undertrykkende [32-34 ] og onkogen [35, 36] karakteristika i bugspytkirtelkræftceller. Men undersøgelserne har fokus på de funktioner, miR-1178 er ikke rapporteret. I vores tidligere undersøgelse [12], fandt vi, at CHIP undertrykt pancreascancer celleproliferation, migration og invasion. Vores hypotese derfor, at MIR-1178 kan fremkalde kræft i bugspytkirtlen cellevækst, migrering og invasion. Denne hypotese blev støttet af vores observationer. Vores data viste, at miR-1178 overekspression lettet bugspytkirtelkræft celleproliferation, G1 /S overgang, migration og invasion. I modsætning hertil inhiberingen af ​​MIR-1178 undertrykkes disse processer. Vores resultater antyder, at MIR-1178 fungerer som en oncomiR under pancreascancer tumorigenese for første gang.

bugspytkirtlen viser en række molekylære ændringer, der fører cancerceller, ikke blot at overleve, men også at invadere det omgivende væv og metastasere til fjerne steder. Den mest almindelige ændring involverer epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) genet. Li Y

et al

. [37] viste, at MIR-146a inhiberede invasive kapacitet PDAC celler ved direkte målretning af EGFR. Croce CM [38] rapporterede, at MIR-21 stimuleret EGFR pathway og forøget vækst af PDAC celler er uafhængige af PTEN nedbrydning. Fordi vores tidligere undersøgelse viste, at chippen er en hidtil ukendt posttranslationel regulator af EGFR [12], vi ræsonnerede, at MIR-1178 også kan regulere aktiviteten af ​​EGFR og dets nedstrøms signaleringskaskade. I denne undersøgelse viste vi, at MIR-1178 overekspression forøget EGFR proteinniveauet og aktiveret den nedstrøms AKT /p21 pathway og Src /E-cadherin pathway. I modsætning hertil inhiberingen af ​​MIR-1178 havde de modsatte virkninger. Aktiveringen af ​​AKT /p21 og Src /E-cadherin signalering er blevet rapporteret at være involveret i proliferation, cellecykluskontrol, migration og invasion af bugspytkirtelkræftceller [20-22, 28]. Disse resultater indikerer, at ektopisk aktivering af EGFR /AKT /p21 og EGFR /SRC /E-cadherin veje delvist kunne redegøre for effekten af ​​miR-1178 i bugspytkirtelkræftceller.

For at kontrollere, om miR-1178 funktioner som en oncomiR ved at undertrykke CHIP blev en “redning” strategi til at undersøge den funktionelle relevans af miR-1178 /CHIP interaktion. Vores resultater viste, at overekspression af CHIP inhiberede MIR-1178-induceret ekspression af EGFR, p-AKT og p-SRC. I overensstemmelse med inaktivering af EGFR og dens downstream veje, celleproliferation, G1 /S overgang, migration og invasion var også faldet. Vi konkluderede derfor, at den opreguleret EGFR vej og facilitering af tumorigenese af miR-1178 kan skyldes nedsat CHIP udtryk i bugspytkirtelkræftceller.

Generelt

in vitro

data ikke tilstrækkeligt til at gøre klinisk relevante slutninger i bugspytkirtelkræft [39], især med hensyn til de sammenhænge mellem miR-1178 udtryk og klinisk-patologiske træk. I vores yderligere undersøgelse, vil vi undersøge de biologiske funktioner af miR-1178 i PDX (patient-afledte xenografter) af kræft i bugspytkirtlen. Derudover vil vi evaluere udtrykket af miR-1178 i væv af bugspytkirtelkræft at undersøge sammenhængen mellem miR-1178 udtryk og kliniske karakteristika for patienter med kræft i bugspytkirtlen.

Konklusion

Som konklusion det nuværende studie viste, at mIR-1178 fremmes bugspytkirtelkræft celleproliferation, G1 /S overgang, migration og invasion gennem nedregulering af CHIP. Vore data antyder, at MIR-1178 er en endogen attenuator af chip der letter pankreatisk tumorigenese. Til vores viden, denne undersøgelse er den første til at demonstrere reguleringen af ​​CHIP udtryk ved miRNA i humane cancerceller og tydeliggøre funktionen af ​​miR-1178 i bugspytkirtelkræft. Vores resultater tyder på, at miR-1178 kan tjene som en ny terapeutisk mål for miRNA-baseret behandling i kræft i bugspytkirtlen.

Støtte Information

S1 Table. Primersekvenserne for GAPDH og CHIP

doi:. 10,1371 /journal.pone.0116934.s001

(XLS)

S2 Table. De primære antistoffer til western blot analyse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0116934.s002

(XLS)