PLoS ONE: Six1 Fremmer spredning af bugspytkirtelkræftceller via opregulering af cyclin D1 Expression

Abstrakte

Six1 er en af ​​de transkriptionsfaktorer, der fungerer som master-regulatorer af udvikling og ofte dysreguleret i kræft. Men er ikke klart rolle Six1 i bugspytkirtelkræft. Her viser vi, at den relative ekspression af Six1 mRNA er forøget i bugspytkirtelkræft og korreleret med avanceret tumor stadium.

In vitro

funktionelle assays viser, at tvungen overekspression af Six1 markant øger væksten og spredning evne bugspytkirtelkræftceller. Knockdown af endogen Six1 nedsætter proliferation af disse celler dramatisk. Endvidere Six1 fremmer væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller i en xenograft assay. Vi viser også, at genet, der koder cyclin D1 er en direkte transkriptionel mål for Six1 i bugspytkirtelkræftceller. Overekspression af Six1 opregulerer cyclin D1-mRNA og protein, og signifikant forøger aktiviteten af ​​cyclin D1-promotoren i PANC-1-celler. Vi viser, at Six1 fremmer cellecyklusprogression og spredning ved opregulering af cyclin D1. Disse data antyder, at Six1 overudtrykkes i bugspytkirtelkræft og kan bidrage til den forøgede celleproliferation gennem opregulering af cyclin D1

Henvisning:. Li Z, Tian T, Lv F, Chang Y, Wang X, Zhang L, et al. (2013) Six1 Fremmer spredning af bugspytkirtelkræftceller via opregulering af cyclin D1 Expression. PLoS ONE 8 (3): e59203. doi: 10,1371 /journal.pone.0059203

Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: November 23, 2012; Accepteret: 12. februar 2013; Udgivet: 20 mar 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra nationale Natural Science Foundation of China (NSFC, NO 81.172.118) og ved tilskud fra Kina Postdoc Science Foundation (til LZM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i hele verden [1]. Det har ofte en dårlig prognose på grund af manglen på pålidelige tidlige diagnostiske metoder og effektiv behandling [2]. Derfor er der et presserende behov for at forbedre vores forståelse af de molekylære mekanismer i kræft i bugspytkirtlen tumorigenese og udvikle effektive behandlingsstrategier.

Six1 er et pattedyr homolog af Drosophila sinus oculis genet og er stærkt konserveret fra Drosophila til mennesker [3], [4]. Det er bredt udtrykt i mange væv under den tidlige udvikling, mens dens udtryk er lav eller fraværende i de fleste voksne væv [5]. I den tidlige udvikling, Six1 fremmer progenitor celleproliferation og overlevelse gennem aktivering eller repression af en bred vifte af downstream målgener [3], [6]. Det spiller også en rolle i cellulær migration og invasion under embryogenese gennem induktion af epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [7], [8]. Den korrekte ekspression af dette gen er kritisk for udviklingen af ​​forskellige organer, såsom hjernen, øret, øjet, muskel, nyre sensoriske strukturer, og kraniofaciale strukturer [7], [9], [10]. Ud over den rolle Six1 i den tidlige udvikling, er det ofte fejl-udtrykt i forskellige tumorer, såsom brystcancer [5], [11], Wilms ‘tumorer [12], rhabdomyosarcomer [13], hepatocellulært carcinom [14], ovarie kræft [15], [16], og livmoderhalskræft [17], [18]. Endnu vigtigere er, kan misexpression af Six1 i kræft fremkalde udviklingsmæssige programmer ud af kontekst, der bidrager til tumor debut og progression [19], [20]. For nylig har nogle undersøgelser vist, at overekspression af Six1 letter metastase af brystcancer gennem TGF-β-signalering, epithelial-mesenchymal overgang [21], og inducere lymfangiogenese via opregulering af VEGF-C [22]. Hæmning af endogen Six1 udtryk undertrykker tumorgenese og metastase af hepatocellulært carcinom [23].

Men rolle Six1 i bugspytkirtelkræft er ukendt. Den kritiske rolle Six1 i initiering og progression af talrige kræftformer tilskyndet os til at studere funktionen af ​​Six1 i bugspytkirtelkræft. I denne undersøgelse, viser vi, at Six1 er overudtrykt i bugspytkirtelkræft og korreleret med avanceret tumor stadie. Brug

in vitro

in vivo

funktionelle assays, viser vi, at tvungen overekspression af Six1 afvigende fremmer spredning, der bidrager til bugspytkirtlen tumorigenese. Vi viser også, at genet koder for cyclin D1 er en direkte transkriptionel mål for Six1 i bugspytkirtelkræftceller. Desuden viser vi, at Six1 fremmer cellecyklusprogression og spredning ved opregulering af cyklin D1.

Materialer og metoder

Etik Statement

Indsamlingen af ​​vævsprøver blev godkendt og overvåget af Research Ethics Committee of Zhengzhou University. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, der leveres prøver. Dyreforsøg og xenograft tumor model blev godkendt og overvåget af Research Ethics Committee of Zhengzhou University.

Cell Kultur

Menneskelig pancreas karcinom cellelinjer PANC-1 (CRL-1469) og MIA PaCa-2 (CRL-1420) blev opnået fra American Type Culture Collection ATCC (Rockville, MD, USA). Alle cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Hyclone, Logan, UT, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA), 100 enheder /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin (Invitrogen , Californien, USA) i 5% CO

2 atmosfære ved 37 ° C.

humant væv prøver

Primær pancreas tumor (n = 51) og tilstødende ikke-tumorvæv (n = 13) blev indsamlet mellem 2005 og 2010 fra patienter med resektion primære bugspytkirtlen ductusceller adenocarcinomer på First Affiliated Hospital i Zhengzhou Universitet. Den tilstødende ikke-tumorvæv blev opnået fra et segment af de operativt fjernede prøver, der var længst fra tumoren (mere end 5 cm). Væv blev lynfrosset umiddelbart efter operationen. Ingen tidligere lokal eller systemisk behandling var blevet gennemført på disse patienter før operationen. Alle data, herunder alder, køn, tumorstørrelse, placering, fase, differentiering, perineural invasion og lymfeknude-status blev opnået fra oprindelige patologi rapporter. Patologisk iscenesættelse blev opdateret i henhold til gældende amerikansk fælles udvalg om kræft retningslinjer. Genekspression for Six1 blev opnået for hvert pancreas tumor, og alle prøver blev middelværdi centreret. Prøverne blev derefter opdelt i to grupper for yderligere analyse: prøver, hvori Six1 ekspression var over gennemsnittet (Six1 “høj”), og de resterende prøver (Six1 “lave”). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og denne undersøgelse blev godkendt af Research Ethics Committee of Zhengzhou University (Zhengzhou, Kina).

plasmider Klargøring og etablere stabile cellelinier

Menneskelig Six1 cDNA var amplificeret fra human skeletmuskel ved revers transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR). Human skeletmuskel væv blev opnået fra normale omgivende væv margin på sarkom resektion prøver. Den detaljerede reaktion tilstand PCR blev udført ifølge tidligere rapport [5]. Den Six1 cDNA blev derefter subklonet ind i plasmid pcDNA4 /TO (Invitrogen, Californien, USA). pCMV-cyclin D1 er erhvervet fra Sevicebio (Wuhan, Kina). pcDNA4 /TO-Six1 og pCMV-cyclin D1 blev oprenset i stor skala ved anvendelse af EndoFree Plasmid Maxi kit (Qiagen, Tyskland) til transfektion. Panc-1 eller MIA PaCa-2-celler blev podet i seks-brønds plade og transficeret med pcDNA4 /TO-Six1 ved hjælp af Lipofectamine 2000 reagens som anbefalet af producenten (Invitrogen, Californien, USA). Fireogtyve timer efter transfektionerne cellerne blev passeret og vælges med 100 pg /ml Zeocin i 2 uger, og derefter fik pcDNA4 /TO-Six1 stabil cellelinjer.

RNA Interference

For lille interfererende RNA (siRNA) medieret nedregulering af Six1 eller cyklin D1, følgende siRNA sekvenser blev købt fra Ribobio Company, Guangzhou, PRChina). Sekvenserne af Six1 målrettet siRNA er 5′-AGAACGAGAGCGUACUCAA-3 ‘eller 5′-GGGAGAACACCGAAAACAA-3′; sekvensen af ​​cyclin D1 målrettet siRNA er 5’-GTTCATTTCCAATCCGCCC-3 ‘eller 5′-GCCGAGAAGUUGUGCAUCUUU-3’. PANC-1 og MIA Paca-2-celler blev podet i plader med 6 brønde, dyrket til 50% konfluens og transficeret med siRNA eller scramble kontrol siRNA (tilvejebragt af Ribobio Company, Guangzhou, Kina) duplexer anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, California, USA ) ifølge producentens anbefalinger. 20 nM siRNA’er blev anvendt per brønd og cellerne blev inkuberet i yderligere 48 til 72 timer, før de høstes for protein ekstraktion og immunoblotanalyse.

kvantitativ real-time RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy mini kit ifølge producentens instruktioner (Qiagen, Tyskland). Mængden og renheden af ​​den isolerede RNA blev kvantificeret med en NanoDrop 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) ved bølgelængder på 230, 260 og 280 nm. Kun RNA-prøver med et 260/280 forhold fra 1.9 til 2.1 og en 260/230 forhold fra 2.0 til 2.5 var acceptable til yderligere analyse. Integriteten af ​​total RNA blev bedømt ved visualisering af 18S og 28S ribosomale RNA mønstre i en denaturerende agarosegel (Qiagen, Tyskland). Og de skarpe, klare 28S og 18S rRNA-bånd og en 28S /18S-forhold på to anses for at være af god kvalitet RNA. Den første streng cDNA blev syntetiseret under anvendelse af SuperScript® III First-Strand Synthesis System ifølge producentens instruktioner (Invitrogen, Californien, USA). Kvantitativ PCR blev udført under anvendelse SYBR Green farvestof på et Applied Biosystems 7300 Real-time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kort beskrevet blev 10 pi RNA /primer blanding fremstillet i en steril 0,2 ml rør som følger: 0,5 ug af total RNA, 1 pi oligo (dT)

20 (50 uM), 1 pi 10 mM dNTP mix og DEPC-behandlet vand til et endeligt volumen på 10 pi. Blandingen blev derefter inkuberet ved 85 ° C i 5 minutter og afkølet på is i mindst 1 minut, før tilsætning af 10 pi cDNA Synthesis Mix (2 pi 10 x RT Buffer, 4 pi 25 mM MgCl

2, 2 pi 0,1 M DTT, 1 pi RNaseOUT ™ og 1 pi SuperScript® III revers transkriptase). Den 20 pi revers transcription reaktion blev inkuberet ved 50 ° C i 30 minutter, efterfulgt af 85 ° C i 5 min. RNA-template blev fjernet ved tilsætning af 1 pi RNase H og inkubering ved 37 ° C i 20 min. Kvantitativ PCR blev udført under anvendelse SYBR Green farvestof på et Applied Biosystems 7300 Real-time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA). Den kvantitative PCR blev udført med 12,5 pi 2 x SYBR Green PCR mastermiksens (Tiangen Biotech, Beijing, Kina), 1 pi template cDNA, 200 nM af hver amplifikationsprimer og DEPC-behandlet vand til et endeligt volumen på 25 pi. Reaktionerne blev inkuberet i en 96-brønds optisk plade ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 94 ° C i 15 s og 60 ° C i 30 s. Tærsklen cyklus (C

T) data determinate bruge standard tærskel indstillinger. C

T er defineret som den fraktionerede cyklusnummer hvor fluorescensen passerer fast tærskelværdi. Real-time PCR data blev analyseret ved sammenlignende C

T metoden [24]. Alle reaktioner blev kørt in duplo, og sterilt vand blev testet sammen med prøven som negativ kontrol. Gelelektroforese blev udført for at bekræfte den eksklusive amplifikation af det forventede PCR-produkt. Primersæt anvendt, var som følger: til gen-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3 ‘og 5′-GGCTG TTGTCATACTTCTCATGG-3′; for Six1, 5’-AAGGAGAAGTCGAGGGG TGT-3 ‘og 5′-TGCTTGTTGGAGGAGGAGTT-3′; for cyklin D1, 5’-GCTGCGAAGT GGAAACCATC-3 ‘og 5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3’

Analyse af Microarray data

Oncomine Cancer Microarray database [25] (http:. //www .oncomine.org) blev anvendt til at undersøge genekspression af Six1 i humane pancreas cancer prøver som vi tidligere beskrevet [26]. Genekspression data blev også opnået fra NCBI genekspression Omnibus (GEO) database (tiltrædelse numre GSE15471, GSE32676 og GSE28735; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [27] – [29]. Expression data for Six1 og cyklin D1 var log-transformeret, median centreret pr array, og standardafvigelsen blev normaliseret til én pr array.

Western blot analyse

Western blot analyse blev udført som vi tidligere beskrevet [30]. Kort fortalt blev cellerne lyseret i kold lysepuffer [Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl

2, 0,5% Triton X-100, phosphatase inhibitor-blanding (1 mM NaF, 1 mM Na

3VO

4 og 1 mM β-glycerophosphat), og en proteasehæmmer blanding (1 mM PMSF, 2 pg /ml aprotinin, 1 ug /ml leupeptin og 1 ug /ml pepstatin a)]. Lysater blev clarifed ved centrifugering ved 10.000 x g i 20 min. Proteiner (10-25 ug) blev opløst på SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembraner (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Membranen blev blokeret i TBS-T-buffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI og 0,05% Tween-20) indeholdende 5% (w /v) fedtfri mælk ved stuetemperatur i 1 time og derefter probet med antistoffer for Six1, cyclin A, cyclin B1, cyklin E, GAPDH (alle fra Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, Californien, USA), Phospho-Rb (# 8516, Cell Signaling Technology), Rb (# 9313, Cell Signaling Technology ) og cyclin D1 (# 2926, Cell Signaling Technology) ved 4 ° C natten over. Detektion blev udført med SuperSignal West Femto maksimal følsomhed Substrat Trial Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Bandet billeder blev registreres digitalt og kvantificeret med en FluorChem FC2 imaging system (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

MTT og celletal Assay

Et tusinde celler blev podet i 96 Tja dyrkningsplader og inkuberet ved 37 ° C i forskellige tidsrum. Derefter 20 pi MTT (tetrazoliumbromid, 5 mg /ml, GE Healthcare) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. Dyrkningsmediet blev fjernet, og 150 pi DMSO blev tilsat for at opløseliggøre krystallerne i 20 minutter ved stuetemperatur, og absorbansen ved 570 nm blev aflæst med en ELISA-pladelæser (Model 680, Bio-Rad, CA). For celletælling blev celler udpladet i plader med 6 brønde inkuberet ved 37 ° C i forskellige tidsrum og derefter fjernet ved trypsinisering, og antallet af levedygtige celler blev talt i et hæmocytometer under anvendelse af trypanblåt-farvning. Hver prøve blev målt i tre eksemplarer og gentaget tre gange.

BrdU Indbygning

Celler blev udsat for 10 uM BrdU (BD Biosciences, Mountain View, CA) i 30 min og fikseret i 70% ethanol og derefter vasket med PBS, resuspenderet og inkuberet med 4 N HCI og 0,5% Triton X-100 i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vask med PBS blev cellerne neutraliseret med 0,1 M natriumborat før bliver mærket med FITC-konjugeret BrdU antistof (BD Biosciences, Mountain View, CA) og inkuberes med 50 ug /ml propidiumiodid (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO ) ifølge fabrikantens protokol, inden de blev analyseret ved en Becton Dickinson FACStar Plus flowcytometer.

kolonidannelse Assay

Seks hundrede celler blev podet i en 6-brønds plade. Efter 14 dage blev cellerne farvet med 0,5% krystalviolet (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i methanol i 10 min. Kolonier (mere end 50 um diameter) blev talt direkte på pladen. Statistisk signifikans blev beregnet ud fra mindst tre uafhængige forsøg.

reporterassays

Panc-1-celler blev udpladet i 24-brønds plader ved 100.000 celler /brønd og fik lov til at vokse under normale dyrkningsbetingelser. Ved 80% kon fl uency blev celler transficeret med ekspressionsvektorer (Six1 eller tom vektor), i fuld længde human cyclin D1-promotor (-1745D1 /LUC, -1745 til +155) [31] og Renilla reniformis luciferaseekspressionsvektoren pRL-TK (Promega, Madison, WI, USA). Molforholdet mellem pRL-TK til pGL3-reporter vektor var 1: 10. Derefter blev luciferaseaktiviteter målt ved hjælp af Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens anvisninger. Cellerne blev lyseret efter 48 timer med 500 pi 1 × Passive Lysis Buffer (Promega) per brønd, inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur og cellerester fjernet ved centrifugering. 50 pi supernatant blev blandet med 50 pi af Dual-Glo-reagens I (Promega) og brand fl y luciferase luminescens måles i en GloMax® 20/20 Luminometer (Promega, Madison, WI, USA). 50 pi Dual-Glo-reagens II (Promega) blev tilsat, og Renilla luciferase luminescens bestemt. Relative lysenheder blev beregnet som Renilla /brand fl y luminescens fra tredobbelte brønde og normaliseret til den negative kontrol.

chromatin immunoprecipitation (chip) Assay

Chippen assays blev udført ved anvendelse af en chip assaykit ( Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, NY) som foreslået af producenten. Brifely, celler (15 cm dyrkningsskål, ca. 1,0 x 10

7-celler) blev fikseret med 1% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af vask to gange med 20 ml kold 1 × PBS og høstet ved afskrabning. Efter centrifugering blev cellepellets lyseret i 1 ml SDS Lysis Buffer indeholdende Protease Inhibitor Cocktail II. Cellelysatet blev sonikeret på våd is fire gange i 15 sekunder hver gang med intervaller på 15 sekunder til opnåelse af kromatin-fragmenter på ca. 200-1000 bp nukleotider. Centrifugeret ved 12.000 x g ved 4 ° C i 10 minutter til fjernelse af uopløseligt materiale, og derefter fjernes supernatanten til friske mikrocentrifugerør i 100 pi alikvoter. Hver 100 pi supernatanter blev fortyndet med 900 pi chip fortyndingspuffer og præinkuberet med protein G agarose ved 4 ° C i 1 time, og derefter pelleteret agarose ved kort centrifugering og fjernet 10 pi (1%) af supernatanten som input. Supernatanter blev inkuberet ved 4 ° C natten over med 5 ug Six1 (sc-9709, Santa Cruz), RNA-polymerase II-antistof (Pol II, sc-56767, Santa Cruz) og normal IgG, (sc-2028 Santa Cruz) inkuberet natten over ved 4 ° C med rotation, og derefter tilsat 60 pi Protein G agarose til hvert rør og inkuberet i 1 time ved 4 ° C med rotation. Efter centrifugering fjernedes supernatanten og vaskede protein G agarose-antistof /chromatin kompleks ved resuspendering af perlerne i 1 ml hver af Low Salt /High Salt /LiCl immunkompleks Wash Bufferwash buffer for én gang, efterfulgt af vask to gange med TE-buffer. Efter den sidste vask blev immunpræcipitater elueret og revers tværbundet ved inkubation natten over ved 65 ° C i elueringsbuffer. DNA blev derefter oprenset med et PCR-oprensningskit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Immunopræcipiterede DNA’er blev analyseret ved kvantitativ realtids-PCR under anvendelse af følgende primere: cyclin D1-promotoren (-1189 til -985), 5′-AGGAACCTT CGGTGGTCTTG-3 ‘og 5′-CCTTGACCAGTCGGTCCTTG-3′; cyclin D1-promotoren (-348 til -190), 5’-CTCAGGGATGGCTTTTGGGC-3 ‘og 5′-ACTCCCCTGTAGT CCGTGTG-3′; den positive kontrol GAPDH-gen proksimale promotor, 5’-TACTAGC GGTTTTACGGGCG-3 ‘og 5′-TCGAACAGGAGGAGCAG AGAGCGA-3’.

Mus xenograftmodel

BALB /c (6-8 uger gamle) atymiske nøgne mus blev købt fra Experimental Animal center of Henan-provinsen (Zhengzhou, Kina). Musene blev opstaldet på fem /bur i microisolator enheder under fugtighed og temperatur kontrollerede forhold med 12-timers lys-mørke cyklus. Der blev fodret med en standard steril laboratorium kost (Zhengzhou University, Zhengzhou, Kina) mindst tre dage før brug. Dyresundhed blev undersøgt før tumor implantation og randomisering til sikre, at kun dyr uden nogen symptomer på sygdom blev udvalgt til at indtaste testprocedurer. Under forsøgene blev dyrene overvåget to gange dagligt vedrørende tumorbelastning, almentilstand, fødevarer og vandforsyning. Musene blev tilfældigt fordelt i to grupper og injiceret subkutant i flanken regioner med 5,0 × 10

6 celler i 0,1 ml PBS. Gruppe 1 (vektorkontrol) blev injiceret med PANC-1-celler, som stablely blev transficeret med pcDNA4 /TO; gruppe 2 (Six1) blev injiceret med PANC-1-celler, som stablely blev transficeret med pcDNA4 /TO-Six1. Når nålen blev injiceret under huden, holdt nålen parallelt med dyrets krop for at undgå at punktere underliggende strukturer og aspireret sprøjten for at sikre, at nålen ikke har ramt en blodåre. Tumorstørrelsen blev målt hver 5 dage med passere. Tumoren volumen blev beregnet med formlen: (længde × bredde

2) /2. Fem uger efter implantation, en tumor begyndte at dukke på stedet for implantation med 400 til 800 mm

3 i volumen. Mus blev aflivet ved kvælning i en CO

2 kammer og tumorer udskåret ved anvendelse af standard pincet, sakse, og kirurgiske klinger. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Animal Care og brug Udvalg retningslinjer for Zhengzhou University.

Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som middelværdi ± S.E.M. Mellem grupper og blandt grupper sammenligninger blev udført med Student t-test og ANOVA hhv. Mann-Whitney U-testen anvendes til nonparametriske variabler. Foreningen af ​​Six1 mRNA-ekspression og klinisk-patologiske karakteristika, herunder alder, køn, tumorstørrelse, placering, fase, differentiering, perineurale invasion og lymfeknude status blev analyseret ved enten Chi-square eller Fishers to-halet eksakte test. Den Spearman rank korrelation test blev vurderet til at kontrollere sammenhængen mellem ekspressionsniveauer af Six1 og cyclin D1 på log-transformerede værdier. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism software version 4.0 (PRISM4) (GraphPad Software Inc, LaJolla, CA), og

P

. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Six1 er overudtrykt i kræft i bugspytkirtlen og korreleret med Advanced tumor Stage

for at undersøge den rolle, Six1 i bugspytkirtlen udvikling af kræft, testede vi udtryk for Six1 i 51 pancreas ductusceller adenokarcinomer og 13 tilstødende ikke-tumor i bugspytkirtlen vævsprøver anvendelse af kvantitativ real-time RT-PCR. Udtrykket af Six1 mRNA i pancreas ductusceller adenocarcinomer prøver var betydeligt højere end i de tilstødende ikke-tumor i bugspytkirtlen væv efter normalisering bruger GAPDH (

P

0,01) (Figur 1A). Vi undersøgte endvidere ekspressionen af ​​Six1 ved at forespørge ONCOMINE database. I fire microarray udtryk undersøgelser [28], [32] – [34], udtryk for Six1 mRNA er væsentligt højere i bugspytkirtelkræft væv end i de tilstødende ikke-tumor i bugspytkirtlen væv; mRNA-niveauerne stige mellem 1,5 og 11,2 gange (figur 1B). Det kan bemærkes, at ikke-tumorvævet støder op til ondartet kræft i bugspytkirtlen er ikke den normale pancreasvæv og derfor disse data kan afvige virkelig ekspressionen af ​​normale pancreasvæv.

(a) de relative mRNA-ekspression niveau af Six1 blev bestemt ved kvantitativ real-time RT-PCR i 51 pancreas duktalt adenokarcinom og 13 hosliggende ikke-tumor pancreas vævsprøver. Resultater blev normaliseret til ekspressionsniveauet af GAPDH mRNA i hver prøve. *

P

0,05. (B) ONCOMINE database blev anvendt til at analysere tidligere offentliggjorte microarray data. Niveauer af Six1 mRNA forøget i bugspytkirtelkræft sammenlignet med tilstødende ikke-tumor pancreasvæv. Alle resultater, herunder

p

-værdier, blev beregnet ved hjælp af ONCOMINE data. N, tilstødende ikke-tumor pancreasvæv; T, pancreatiske ductusceller adenocarcinomer; *

P

. 0,05

genekspression mønster af Six1 i pancreas ductusceller adenokarcinomer blev sammenlignet med deres klinisk-patologiske egenskaber (tabel 1). Overekspression af Six1 mRNA var signifikant korreleret med tumor fase (

P

= 0,018). Omkring 67% (18 af 27) af fremskreden (III IV) af pancreas ductusceller adenocarcinomer viste sig at overekspression Six1. Der er ingen signifikant sammenhæng mellem Six1 og alder, køn, tumorstørrelse, beliggenhed, differentiering, perineurale invasion og lymfeknude status (alle

P

0,05; tabel 1)

Six1 Fremmer vækst af bugspytkirtelkræftceller

in vitro

in vivo

for at udforske den funktionelle rolle af Six1 i bugspytkirtelkræft, undersøgte vi effekten af ​​Six1 overekspression på proliferationen af ​​både PANC-1 og MIA PaCa-2-celler. Cellerne blev stabilt transficeret med enten pcDNA4 /TO-Six1 eller kontrolvektor plasmider. Western blot-analyse bekræftede, at ekspressionen af ​​Six1 steg i begge PANC-1 og MIA PaCa-2-celler transficeret med pcDNA4 /TO-Six1, i forhold til dem transficeret med kontrolvektor (figur 2G og fig S1A).

Celleantallene (A), procentdel af BrdU-positive celler (B) og antallet af kolonier (C) af PANC-1-celler stabilt transficeret med enten Six1 eller kontrol plasmider. Solid linje, kontrol; stiplet linie, Six1. D, Antal Panc-1-celler transficeret med Six1 siRNA og scramble kontrol. Solid linje, scramble kontrol siRNA; stiplet linie, Six1 siRNA.

E, Tumor størrelse subkutane xenotransplantater målt inden for 5-dages interval. Tumoren volumen blev beregnet ved hjælp af formlen: (længde × bredde

2) /2. F, Repræsentative subkutane tumorxenoplantater genereret i mus

5 uger

efter inokulering (øverste panel), og

vægten af ​​tumorer (

nederste panel

). G, Ekspressionen af ​​Six1 i begge PANC-1 og MIA PaCa-2-celler blev bestemt ved western blot-analyser. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt; barer, S.E.M .; *

P

. 0,05

Cell proliferation blev vurderet ved direkte celletælling, MTT

vækst assay

, BrdU inkorporering, og kolonidannelse assay. Både MIA PaCa-2 og Panc-1-celler blev anvendt. Ifølge celletal resultater, proliferationshastighed af cellerne med overudtrykt Six1 var signifikant højere end den for kontrolcellerne; mere Six1-transficerede celler blev observeret ved 4, 5 og 6 dage efter udpladning (*

P 0,05

, figur 2A).

MTT vækst analyser

viste, at cellevæksten steg markant efter overekspression af Six1 (*

P 0,05

, figur S1B). I BrdU inkorporering assay, antallet af BrdU positive celler i kontrol og pcDNA4 /TO-Six1 gruppen var 29,3% ± 1,7% og 44,0% ± 1,1%, henholdsvis (*

P

0,05, figur 2B ). I kolonidannelse assay for PANC-1 antallet af dannede kolonier til vektor kontrol og pcDNA4 /TO-Six1 gruppen var henholdsvis 84 ± 16 og 184 ± 28, (*

P

0,05, figur 2C). Vi opnåede lignende resultater

til

MIA PaCa-2-celler i kolonidannelse assay (*

P

0,05, figur S1c)

For at teste, om Six1 er nødvendig for. proliferation af bugspytkirtelkræftceller, vi tavshed Six1 i begge Panc-1 og MIA PaCa-2-celler under anvendelse siRNA metoden. Celletallet assay viste, at antallet af Six1-knockdown celler var signifikant lavere end antallet af både PANC-1 og MIA PaCa-2-celler transficeret med scrambled kontrol (figur 2D og fig S1D). Hæmning af endogen Six1 i MIA PaCa-2-celler resulterede i ca. 1,8 gange formindskelse af BrdU positive celle satser, sammenlignet med den krypterede kontrolgruppe. (Scrambled siRNA vs. Six1 siRNA-1, 43% vs. 26%; Scrambled siRNA vs. Six1 siRNA-2, 43% vs. 23%; *

P

0,05, figur S1E). Lignende resultater blev opnået i de PANC-1-celler (figur S1F). Den lyddæmpning af Six1 ekspression blev bekræftet efter Six1 siRNA behandlinger (20 nM i 72 timer) ved både kvantitativ PCR og Western blot analyse (figur S2). Tilsammen indikerer disse resultater, at Six1 fremmer celledeling af bugspytkirtelkræftceller.

For at bekræfte ovenstående resultater en

in vivo

tumor xenograft model blev anvendt. PANC-1-celler stabilt overudtrykker Six1 eller kontrolceller blev injiceret subkutant i to grupper på nøgne mus (n = 5). Som forventet viste kurve tumorvæksten at tumorer afledt af Six1 gruppe voksede hurtigere end dem fra kontrolgruppen. Fem uger efter injektion, tumor volumen Six1 gruppe var 0,47 ± 0,26 cm

3, mens tumoren volumen af ​​kontrolgruppen var 0,08 ± 0,06 cm

3 (*

P 0,05

, figur 2E). Desuden var den gennemsnitlige tumorvægt ved slutningen af ​​eksperimentet var signifikant højere i gruppen overudtrykker Six1 (1,69 ± 0,44 g) sammenlignet med kontrolgruppen (0,39 ± 0,25 g; *

P 0,05

, figur 2F ). Disse resultater viser, at Six1 øger væksten af ​​kræft i bugspytkirtlen

in vivo

.

Six1 transkriptionelt Aktiverer Gene Encoding cyclin D1 i bugspytkirtelkræftceller

Det er blevet rapporteret, at Six1 er en celle cyklus regulator og påvirker cellecyklus progression både i normal udvikling og i kræft [3], [5], [20], [35]. At studere underliggende molekylære mekanismer, som Six1 fremmer cellevækst af bugspytkirtelkræftceller, vi analyserede flere cellecyklus regulatorer og fandt, at cyclin D1 protein niveauer signifikant højere i Panc-1 og MIA Paca-2-celler transduceret med Six1, mens celler med Six1 knockdown viste en reduceret cyclin D1-ekspression (figur 3A og figur S1A). Six1 er en transkriptionsfaktor, der fungerer som en af ​​master regulatorer af udvikling. For at bestemme om Six1 induceret cyclin D1-ekspression på transkriptionsniveauet, analyserede vi cyclin D1-ekspression ved kvantitativ PCR-analyse. Vi fandt, at cyclin D1 mRNA-niveau steget mindst 4 gange i Six1 transducerede PANC-1 celler (*

P 0,05

, figur 3B). Vi næste spurgt, om Six1 direkte kunne regulere aktiviteten af ​​cyklin D1 promotor. PANC-1-celler blev transficeret med den humane cyclin D1 promoter reporter i nærværelse af stigende koncentrationer af human Six1-ekspressionsplasmid. Dataene viste, at Six1 væsentligt forbedret luciferaseaktiviteten af ​​cyclin D1 promoter reporter på en dosis-afhængig måde (*

P 0,05

, figur 3C). Dernæst udførte vi chipanalyse at afgøre, om Six1 binder til cyclin D1-promotoren i kromatin. Normal IgG bundet til cyclin D1-promotoren blev anvendt som negativ kontrol. RNA-polymerase II-antistof-immunpræcipiteret DNA blev amplificeret med primerne ifølge GAPDH-promotoren for at tjene som positiv kontrol. Figur 3D viser, at Six1 kan binde til cyclin D1-promotoren mellem -1189 og -985, en region, der indeholder to MEF3-lignende motiver (TCAGCTTTC og TAATATTTC) [36]. I modsætning hertil har en irrelevant sekvens nær den transkriptionelle startsted (-348 til -190) ikke binder Six1. For at opsummere, Six1 positivt reguleret cyclin D1 udtryk på både mRNA og protein niveau, hvilket antyder, at cyclin D1 er en

in vivo

mål for Six1 i bugspytkirtlen celler.

A og B, Effekten af