PLoS ONE: Mutation af BNP-mannose-4,6-dehydratase i kolorektal cancer Metastase

Abstrakt

fucosylering er en afgørende oligosaccharid modifikation i kræft. Den kendte funktion af fucosylering i cancer er at mediere metastase gennem selectinligandproteinet-afhængige processer. Tidligere fandt vi fuldstændigt tab af fucosylering i coloncancercellelinie HCT116 grund af en mutation i BNP-fucose syntetisk enzym, BNP-mannose-4,6-dehydratase (GMDS). Tab af fucosylering førte til udslip af cancerceller fra tumor immunovervågning efterfulgt af tumorprogression og metastase, hvilket tyder på en hidtil ukendt funktion af fucosylering i tumor progression pathway. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi hyppigheden af ​​GMDS mutation i en række kliniske colorektale cancer vævsprøver: 81 prøver af primær colorektal cancer væv og 39 prøver af metastatisk læsion herunder lever og lymfeknude. Fire typer deletionsmutation i GMDS blev identificeret i originale kræft væv samt metastatiske læsioner. Hyppigheden af ​​GMDS mutation var lidt højere i metastatiske læsioner (12,8%, 5/39 prøver) end i de oprindelige kræft væv (8,6%, 7/81 prøver). Nr mutation af GMDS genet blev observeret i normale colon væv omkring cancervæv, hvilket antyder, at mutationen er somatisk snarere end i kimcellelinje. Immunhistokemisk analyse viste fuldstændig tab af fucosylering i tre tilfælde af kræft væv. Alle tre sager havde GMDS mutation. I en af ​​tre tilfælde blev tab af fucosylering observeret i kun metastatisk læsion, men ikke dens oprindelige tyktarmskræft væv. Disse data viser involvering af GMDS mutation i progressionen af ​​colorektal cancer

Henvisning:. Nakayama K, Moriwaki K, Imai T, Shinzaki S, Kamada Y, Murata K, et al. (2013) Mutation af BNP-mannose-4,6-dehydratase i kolorektal cancer metastaser. PLoS ONE 8 (7): e70298. doi: 10,1371 /journal.pone.0070298

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Januar 25, 2013; Accepteret: 18 juni 2013; Udgivet: 29 juli 2013

Copyright: © 2013 Nakayama et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

fucosylering er en af ​​de vigtigste oligosaccharid modifikationer i cancer og inflammation [1]. Fucosylering reguleres af forskellige fucosyltransferaser, guanosin-5′-diphosphat (BNP) -fucose syntetiske enzymer, og BNP-fucose transportører. De fleste BNP-fucose syntetiseres af de novo-vejen, hvor BNP-mannose omdannes til BNP-fucose ved BNP-mannose-4,6-dehydratase (GMDS) og BNP-4-keto-6-deoxymannose-3,5- epimerase-4-reduktase (FX) [2] – [4]. Adskillige antistoffer, som genkender -fucosylerede glycoproteiner eller glycolipider i sera fra patienter med cancer har længe været anvendt som tumormarkører [5]. Alfa-fetoprotein (AFP) -L3 fraktion, som er fucosylerede AFP, er også blevet anvendt klinisk som en tumormarkør for hepatocellulært carcinom siden 1996 i Japan og siden 2005 i USA [6]. Generelt er fucosylering niveauer steg i carcinogenese af adskillige former for kræft [7], [8]. Tidligere dog fandt vi, at fuldstændigt tab af fucosylering grund deletionsmutation af GMDS gen tilladt kolon kræftceller til at flygte fra naturlige dræberceller cellemedieret tumor overvågning ved graduering af tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) signalering [9 ], hvilket antyder, at en hidtil ukendt metastatisk pathway afhængig tab af fucosylering. GMDS mutation er blevet observeret i kolon (HCT116, LS174T, NCI-H716) og gastrisk (SCH) kræft cellelinier såvel som i human tyktarm og ovariecancer væv [9]. Interessant nok blev GMDS mutation ikke fundet i nogen tilstødende normale væv, hvilket antyder, at GMDS mutation var somatiske. Hvis tabet af fucosylering er kritisk for tumormetastase under kolorektal cancer progression, vil hyppigheden af ​​GMDS mutation sandsynligvis øges i metastatiske læsioner. I denne undersøgelse undersøgte vi hyppigheden af ​​GMDS mutation i metastatisk kolorektal cancer væv såsom lever og lymfeknuder.

Materialer og metoder

Etik Statement

Protokollen og informeret samtykke blev godkendt af institutionelle anmeldelse bestyrelser på Osaka University Graduate School of Medicine. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.

vævsprøver

Enogtredive prøver af metastatisk leverkræft, 2 prøver af metastatisk andre kræftformer (mavekræft, kræft i skjoldbruskkirtlen), og 81 prøver af de oprindelige tyktarmskræft væv afledt af patienter med kolorektal cancer, som gennemgik primær resektion ved Institut for Kirurgi på Osaka Medical center for cancer og hjertekarsygdomme fra 1995-2005 blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Seks prøver fra metastatiske lymfeknuder fra patienter med kolorektal cancer, som gennemgik primær resektion ved Institut for Kirurgi på Suita Kommunehospitalet 2010-2012 blev også anvendt i denne undersøgelse. Kliniske parametre hos patienterne i denne undersøgelse er opsummeret i tabel 1. Nogle af cancer væv blev indlejret i paraffin og anvendt til immunohistokemisk analyse. Disse undersøgelser blev godkendt af institutionelle etiske komité i Osaka Universitetshospital.

Screening af GMDS Mutation med Reverse Transcription-polymerase kædereaktion (RT-PCR) Analyse

Total RNA var ekstraheret fra frosne væv ifølge en standardprotokol under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Den ekstraherede RNA blev revers-transkriberet under anvendelse af Super Script ™ III revers transkriptase og oligo dT primer (Invitrogen). Ved hjælp af syntetiseret cDNA blev PCR udført med KOD-Plus-DNA-polymerase (TOYOBO, Osaka, Japan). PCR-primerne for GMDS var som følger: F, 5′-GCAAGCTTAAAATGGCACACGCACCGGCAC-3 ‘og R, 5′-GCGGATCCTCAGGCATTGGGGTTTGTC-3’. Glyceraldehyder-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en intern kontrol, og de følgende PCR-primere blev anvendt til at amplificere GAPDH: F, 5′-AACGGGAAGCTTGTCATCAAT-3 ‘og R, 5′-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3’. Sekvensanalyse blev udført med et ABI PRISM 3100 genetisk analysator (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Immunohistokemisk Studies

Kræft og normale colon væv blev fikseret med 10% formalin /phosphatpufret saltvand (PBS) og opbevaret som paraffinindlejrede prøver. Vævssnittene 4-um blev afvokset, og endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved behandling med 0,3% hydrogenperoxid i methanol i 10 min. Efter vask to gange med PBS, blev prøverne inkuberet med Tris pufret saltopløsning og Tween 20 indeholdende 5% bovint serumalbumin natten over ved 4 ° C. Prøverne blev inkuberet med biotinyleret

Aleuria aurantia

lectin (AAL; 2,0 ug /ml) eller kanin-anti-GMDS antistof (0,3 ug /ml) i 1 time ved stuetemperatur. Prøver blev vasket tre gange med PBS og efterfølgende inkuberet med ABC-kit (Vector Labs, Burlingame, CA) i AAL-farvning eller med Dako Cytomation Envision + System HRP-mærket Polymer anti-kanin-antistof (Dako, Glostrup, Danmark) i GMDS farvning på stuetemperatur i 30 minutter. Efter prøver blev vasket tre gange med PBS, blev positiv farvning visualiseret ved hjælp diaminobenzidin (Dako).

Resultater

GMDS Mutation i kolorektal cancer

For at undersøge hyppigheden af ​​GMDS mutation i originale og metastatiske kolorektal kræft, blev totalt RNA ekstraheret fra 81 prøver af humane oprindelige colorektale cancervæv, 39 prøver af metastatisk cancer væv og tilstødende normale colonvæv og blev underkastet RT-PCR-analyse. Fire kortere PCR-produkter blev fundet i flere originale og metastatiske cancervæv (fig. 1). Detaljeret sekvensanalyse afslørede forskellige typer sletning af GMDS exoner: exoner 2-4, 5-7, 2-7, og 3-7. To af disse mutationer, sletning af exon 5-7 og exons 2-4, var identiske med dem i HCT116 og SCH cellelinier hhv. Sletninger af exon 2-7 og 3-7 i GMDS genet repræsenterer nye mutationer identificeret i denne undersøgelse. De GMDS mutationer i metastatiske læsioner var i overensstemmelse med dem fra de originale kolorektal cancer væv. Interessant nok blev den homozygot af GMDS mutation uden normale type GMDS udskrift fundet i en metastatisk leverkræft væv (tilfælde 1 i fig. 1). Hyppigheden af ​​GMDS mutation i metastatiske læsioner var 12,8% (5/39 prøver): 12,9% (4/31 prøver) i leveren, 16,7% (1/6 prøver) i lymfeknuder, og 0% (0/2 prøver) i andre organer (tabel 2). En lidt lavere frekvens 8,6% (7/81 prøver) af GMDS mutation blev observeret i de oprindelige kræft væv i forhold til deres metastatiske læsioner selv om forskellen ikke var statistisk signifikant (

s

0,10 ved χ

2 test). Ingen GMDS mutation blev observeret i 24 prøver af tilstødende normale colon væv.

GMDS mutationer blev fundet i syv tilfælde af originale kolorektale cancer væv og fem tilfælde af metastatiske læsioner. Pile angiver bands repræsenterer GMDS mutation: sletning af exons 2-4 (A, 876 bp), 5-7 (B, 693 bp), 2-7 (C, 450 bp), og 3-7 (D, 495 bp) . Pilespidser angiver vildtype GMDS (*) og ikke-specifikke (**) bånd. L-6 indikerer et af de tilfælde med metastatiske lymfeknuder. N, tilstødende normale væv; T, tumor; LN, lymfeknude.

Immunhistokemi

For at undersøge cellulære fucosylering niveau i disse kræft væv, 33 tilfælde af originale kolorektale cancer væv og fire tilfælde af deres metastatiske lymfeknuder var farvet med anti-GMDS antistof og et fucosylerede glycan lectin, AAL. RT-PCR analyser viste heterozygote GMDS mutation i fem af de 33 sager. Tyve-otte kolorektal cancer væv uden GMDS mutation viste positiv farvning for både GMDS og AAL. Repræsentative billeder er vist i fig. 2A (sag N). I modsætning hertil to af fem tilfælde af den oprindelige kræft med GMDS mutation viste negativ farvning for både GMDS og AAL (Case 4 og 6 i fig. 2A). Interessant, en af ​​fem tilfælde med GMDS mutation viste negativ farvning for både GMDS og AAL i metastatisk lymfeknude på trods af positiv farvning i sin oprindelige tyktarmskræft væv (sag L-6 i fig. 2B og C).

Tredive-tre tilfælde af originale kolorektale cancer væv og fire tilfælde af deres metastatiske lymfeknuder blev farvet med anti-GMDS antistof og AAL. (A) Tilfælde 4 og 6, der skildrer den oprindelige kolorektal cancer med GMDS mutation, men ikke sag N, som ikke havde GMDS mutation, viste negativ farvning for både GMDS og AAL. (B, C) I tilfælde L-6, hvilket gjorde havn GMDS mutation blev den metastatiske lymfeknuder ikke farves for GMDS (B) og AAL (C) på trods af positiv farvning for både GMDS og AAL i den oprindelige kolorektal cancer vævsprøve. Sag L-4 uden GMDS mutation viste positiv farvning for GMDS og AAL i både de oprindelige og metastatiske legioner. Bar indikerer 100 um. LN, lymfeknude.

Diskussion

I tidligere vores undersøgelse blev GMDS mutation identificeret ved gDNA sekventering i to ud af 100 tilfælde af human kolorektal cancer væv og ved RT-PCR analyse i fem ud af 10 tilfælde af mikrodissekeres humane ovariecancer væv. I denne undersøgelse, vi yderligere demonstreret GMDS mutation i flere humane originale og metastatisk kolorektal cancer væv. Hyppigheden af ​​GMDS mutation var lidt højere i metastatiske læsioner (12,8%) end i de oprindelige cancervæv (8,6%). Interessant nok i ét tilfælde (L-6), tab af fucosylering blev observeret i den metastatiske lymfeknuder men ikke i sin oprindelige cancervæv (fig. 2B og C). Disse resultater antyder, GMDS mutation er involveret i progressionen af ​​colorektal cancer. Antallet af sager med GMDS mutation ikke var tilstrækkelig til at undersøge den statistiske sammenhæng mellem GMDS mutation og sygdomsaktivitet med sikkerhed. Yderligere analyse med mere antallet af prøver vil være forpligtet til at bestemme sammenhængen mellem GMDS mutation og tyktarmskræft progression. Fire ud af ni patienter med GMDS mutation (case 1-8 og case L-6) blev udsat for kirurgisk operation inden for 3 år efter diagnosen. Således er en opfølgende undersøgelse også forpligtet til at undersøge gentagelse af metastaser.

Selv om de fleste af de GMDS mutationer observeret i denne undersøgelse var heterozygote, var homozygot deletionsmutation observeret i et metastatisk leverkræft væv (tilfælde 1, fig. 1). Da cancervæv består af en række celler, herunder ikke kun cancerceller, men også interstitielle celler, er det vanskeligt at påvise, om cancerceller huser en heterozygot eller homozygot type mutation ved RT-PCR-analyse ved anvendelse af hele cancervæv. Således muligheden for, at cancerceller har en homozygot GMDS deletionsmutation i væv, hvori den heterozygote deletionsmutation blev observeret rester. Faktisk blev ekspression af GMDS og fucosylerede glycaner næppe påvises ved immunhistokemisk analyse under anvendelse af anti-GMDS antistof og AAL i tre af fem tilfælde med en heterozygot GMDS mutation, hvilket antyder, at cancerceller i disse væv kan faktisk har homozygote GMDS mutation.

Ekspressionsniveauer af den GMDS genet i cancervæv er påvirket af ikke kun genmutation men også af transkriptionel regulering. Selv om nogle af glycosylerings-relaterede gener blev rapporteret at være epigenetisk reguleret [10], [11], ekspression af GMDS blev ikke ændret ved behandling med midler, der modulerer epigenetisk DNA-struktur via DNA-methylering eller histonacetylering, hvilket antyder, at epigenetiske virkninger ikke spiller en vigtig rolle i reguleringen GMDS genekspression [12] (data ikke vist). Yderligere undersøgelser vedrørende genekspression regulering af GMDS genet er berettigede.

Blandt mange fucosylering-relaterede gener, mutation af fucosyltransferaser FUT1, 2, og 3, som katalyserer α1-2 eller 1-3 /4 fucosylering, er blevet rapporteret hos patienter med sjældne blodtyper [13], [14]. Derudover har BNP-fucose transportør også blevet rapporteret at være ansvarlig for leukocytadhæsion deficiency type II, som er en sjælden recessiv syndrom karakteriseret ved vækst og mental retardering og svær immundefekt [15] – [17]. Nr mutation af fucosylering-relaterede gener er blevet rapporteret i humane cancervæv før. GMDS er den første fucosylering-relateret gen, som viste sig at være muteret i cancervæv. Næste generations DNA-sekvens-analyse kan være et nyttigt redskab til at afgøre, hvorfor GMDS mutation forekommer i flere former for kræft.

Høj fucosylering niveau i kræftceller blev demonstreret at øge metastaser ved at opjustere ekspression af sialyl Lewis A og X, selectinligander, på celleoverfladen [10]. I modsætning hertil viser vores resultater, at tab af fucosylering også øget metastase selv i fravær af selectinligander. Cancermetastase skrider frem gennem mange trin: flygte fra immunceller, invasion, angiogenese, intravasation, homing til metastatiske væv, ekstravasation og kolonisering [18]. Fucosylering kunne have en anden rolle i hvert trin. Fucosylering i cancerceller skal stramt reguleret og dets dysregulaiton vil forårsage yderligere cancer progression og metastase. Konklusionen er, at denne undersøgelse viste, at GMDS mutation bør inddrages i udviklingen af ​​tyktarmskræft. Næste generations DNA-sekvens-analyse kan give os flere oplysninger om GMDS mutation i kolorektal cancer.

Tak

Denne undersøgelse blev udført som et forskningsprogram af projektet for udvikling af innovative Kræftforskningscenter Therapeutics (P-Direct), Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan og blev delvist støttet af den Nye Energi og Industrial Technology Development Organization (NEDO) som en del af det at udvikle teknologi Projekt for Implementering Sukker Chain funktioner i Japan . Dette arbejde blev også delvist understøttet af den globale COE Program for Osaka University finansieret af Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan.