PLoS ONE: Engineering Multi-Walled kulstof nanorør Terapeutiske Bionanofluids til Selektivt Target papillære kræft i skjoldbruskkirtlen Cells

Abstrakt

Baggrund

Forekomsten af ​​papillær skjoldbruskkirtlen karcinom (PTC) er steget støt gennem de seneste årtier samt tilbagefald satser. Det er blevet foreslået, at målrettet ablativ fysisk terapi kunne være en terapeutisk modalitet i kræft i skjoldbruskkirtlen. Målrettet bio-affinitet funktionaliserede multi-walled carbon nanorør (BioNanofluid) handle lokalt, til effektivt at omdanne eksterne lysenergi til varme og derved specifikt dræber kræftceller. Dette kan udgøre en lovende ny cancer terapeutisk modalitet, fremrykkende ud over konventionel laser ablation og andre nanopartikler tilgange.

Metoder

Thyroid hormon receptor (TSHr) blev valgt som mål for PTC celler, på grund sin brede udtryk. Enten TSHr antistoffer eller Thyrogen eller oprenset TSH (thyrotropin) blev kemisk konjugeret til vores funktionaliseret Bionanofluid. En diodelaser systemet (532 nm) blev anvendt til at belyse en PTC cellelinie til fastsat eksponeringstider. Celledød blev vurderet ved hjælp af Trypan Blue-farvning.

Resultater

TSHr målrettede BioNanofluids var i stand til selektivt at ablation BCPAP, et TSHr-positive PTC cellelinie, mens ikke TSHr-null NSC-34 celler . Vi bestemt, at et 2: 1 BCPAP celle: α-TSHr-BioNanofluid konjugat ratio og en 30 sekunders laser eksponering dræbte cirka 60% af de BCPAP celler, mens 65% og 70% af cellerne blev ablateret hjælp Thyrotropin- og Thyrogen- BioNanofluid konjugater hhv. Endvidere blev minimal ikke-målrettede drab observeres ved hjælp af selektive kontroller.

Konklusion

A BioNanofluid platform tilbyder en potentiel terapeutisk vej for papillær kræft i skjoldbruskkirtlen er blevet undersøgt, med vores

in vitro

resultater tyder udviklingen af ​​en potent og hurtig fremgangsmåde til selektiv cancercelledrab. Derfor BioNanofluid behandling understreger behovet for ny teknologi til behandling af patienter med lokalt recidiv og metastatisk sygdom, der i øjeblikket undergår enten re-operative hals udforskninger, gentagen administration af radioaktivt jod og som en sidste udvej ekstern strålebehandling eller kemoterapi, med færre bivirkninger og forbedret livskvalitet

Henvisning:. Dotan i, Roche PJR, Paliouras M, Mitmaker EJ, Trifiro MA (2016) Engineering Multi-Walled kulstof nanorør Terapeutisk Bionanofluids til selektivt Target papillære Thyroid Cancer Cells. PLoS ONE 11 (2): e0149723. doi: 10,1371 /journal.pone.0149723

Redaktør: Valentin Cena, Universidad de Castilla-La Mancha, Spanien

Modtaget: 18 juni 2015; Accepteret: 4 februar 2016; Publiceret: 22 feb 2016

Copyright: © 2016 Dotan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. ID fået støtte løn fra Israel Cancer Research Fund (ICRF)

Konkurrerende interesser:. Forfatterne (ID, PJRR, MP, EJM, og MAT) vil gerne afsløre til redaktøren og anmeldere, at de også opfindere på følgende patentansøgning: BIONANOFLUID til brug som en KONTRAST, Imaging, desinfektion og /eller terapeutisk middel-US patent office PCT CA2014 /051.094 om arbejdet præsenteres her og i andre udviklinger af den terapeutiske udvikling. Denne patentansøgning ikke er i strid med tidsskriftets åbne data politik vedrørende data til stede i dette manuskript eller patentansøgningen. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling, eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

I det sidste årti har der været en signifikant stigning i forekomsten af ​​kræft i skjoldbruskkirtlen [1]. Dette mønster kan delvis forklares ved en stigning i påvisningen af ​​små knuder findes i øvrigt på halsen imaging, men en mere ildevarslende tendens er den øgede forekomst af større skjoldbruskkirtlen ( 4 cm) tumorer sammen med okkulte lymfekirtelmetastaser [2]. Papillært thyreoideakarcinom (PTC) selv udgør ~ 80% af thyreoidea carcinomer [3, 4]. Trods en meget høj 10-års overlevelse på mere end 90% [3], lokalt recidiv forekommer hos op til 20% af tilfældene, hvilket fører til diagnostiske og behandlingsmæssige udfordringer [4]. Derudover aggressive varianter af PTC, såsom høj-celle, søjleformede celler, ø, trabekulære og diffuse skleroserende varianter, men sjældne, er stigende i forekomst. Disse typer kræver ofte aggressive behandlinger forbundet med talrige bivirkninger [5, 6].

grundpille af primær PTC behandling er total thyreoidektomi [3, 7, 8], normalt efterfulgt af radioaktivt jod ablation (RAI) i mellemliggende og højrisiko-patienter [3, 7-10] og terapi livslang levothyroxin. Selvom profylaktisk central hals lymfeknude dissektion (PCND) forbliver kontroversiel, er terapeutisk lymfeknuder node dissektioner rutinemæssigt [2, 11]. For tilbagevendende /avanceret PTC, kirurgisk udryddelse er den bedste løsning. Imidlertid er komplet biokemisk remission med negative thyroglobulin niveauer kun opnået i 27% af patienterne (ofte efter flere interventioner) [12], med en 20-års overlevelse så lav som 36% [13]. Det betydelige antal patienter, der ikke er kirurgiske kandidater kan være genstand for adjuverende behandling muligheder, såsom ekstern strålebehandling terapi (EBRT), der disponerer for irreversible følgesygdomme [7, 14-18]. Derfor er det nødvendigt at finde mere præcise og målrettede behandlingsmuligheder, der vil opnå lignende resultater for primær sygdom, og forbedre de kliniske fordele for tilbagevendende sygdom, og samtidig minimere sygelighed.

Desværre er der iboende begrænsninger med vores nuværende armamentarium af strategier til udryddelse tumor tilbagefald og der er et behov for at opdage nye teknikker, når det kommer til tilbagevendende sygdom. Nanomedicin henviser til brugen af ​​nanoteknologi i sundhedssektoren domæne, og det bruger typisk materialer udviklet i nanoskala dimensioner og allerede har vist sig at være yderst effektiv som en platform for levering af enten fysiske energi eller narkotika, og også i billedbehandlingsprogrammer [19] . Derfor er begrebet nanopartikler-baserede kræftmidler at omgå problemer med konventionel medicin farmakokinetik og modstand samtidig begrænse skader, systemisk eller til normalt tilstødende væv. Den udvider også at omfatte patienter, der inoperabel baseret på konventionelle metoder. Baseret på de nuværende kemoterapeutika, øget selektivt pres ved anvendelse af kemoterapeutiske midler fører til stigninger i tumor modstand [20-22]. Desuden konventionelle fysiske terapier anvendes til at ablatere væv, såsom stråling eller høj intensitet laser behandlinger, også skade sundt væv. Nanopartikler anvendes som fysiske midler, der er i stand til at forstærke eller konvertering energitilførsel, at inducere cellulær skade på en selektiv skala. Dette er for at deres unikke fotoniske egenskaber og plasmoniske adfærd, især kulstof nanorør, hvor sådanne partikler absorberer lys meget effektivt og gennem plasmoniske resonans konvertere sin energi absorption til overdreven varmeudvikling på det overflade [23, 24].

Bio-affinitet nanopartikler, der er beskrevet heri som BioNanofluid, skal kunne: 1) effektivt at omdanne lys til varmeenergi, 2) let modificeres med ligander og /eller biomolekyler at bibringe specificitet, 3) forhindre ikke-specifik celledød, og 4) har en størrelse fordeling under 1 mikron for at aktivere vævsperfusionen. Det nanomateriale, der bedst passer denne beskrivelse er flerlags kulstof-nanorør (MWCNTs), der er cylindriske strukturer af koncentriske [25, 26] graphene ark. Lagdelingen af ​​graphene rørlængde og stort formatforhold giver et væsentligt overfladeareal til flere biomolekylære vedhæftede filer, hvilket skaber flere gyrus partikler, hvor antistoffer eller andre ligander kan genkende flere celleoverfladereceptorer. Flerlags kulstof-nanorør tilbyder fremragende lokaliserede temperatur gevinster i kraft af deres høje evne til at absorbere lys og omdanner det til varme, mens de resterende ubeskadiget [27-29]. Varme genereret over nanometer skalaer ved nanomaterialer fastgjort til celler, vil forårsage tilstrækkelig lokal hypertermi uden bulk opvarmning af ikke-kræftvæv [30]. Da ydermere det menneskelige legeme er transparent for nær infrarød (NIR), sådanne partikler med en målsøgende arm, kan levere en enorm mængde varme lokalt, når de udsættes for NIR lys. NIR allerede besidder fremragende menneskelig dybde penetration, men kan forlænges yderligere med fiber /endoskopiske fremskridt i medicinsk billedbehandling felt, som kan bringe NIR lyskilde næsten overalt i kroppen [31].

Formålet med denne undersøgelse er at designe og forberede konjugerede BioNanofluids til ablation PTC

in vitro

, ved at skabe en målrettet tilgang med den hensigt at forårsage fysisk skade på kræftceller på celleniveau. Desuden virkning af et hidtil ukendt målrettet foto-termisk terapi for PTC bruge disse konjugeret funktionaliserede flervæggede kulstof-nanorør (BioNanofluid) i en skjoldbruskkirtlen cancercellelinie model vil blive vurderet.

Materialer og Metoder

Cellelinier

papillær thyreoideakarcinom cellelinje (BCPAP) [32-34] blev indkøbt fra DMSZ (Braunschweig, Tyskland). Det hybride muse neuroblastom-motorneuroner NSC-34 [35] cellelinje blev doneret af Dr. Neil R. Cashman.

Cellekultur

BCPAP celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10 % FBS. NSC-34-celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% FBS og 20% ​​L-glutamin. Alle cellelinier blev inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 befugtet luft i plast dyrkningskolber (VWR, Canada). Når sammenflydende, blev celler opsamlet ved hjælp Versene-opløsning (0,48 mM EDTA i PBS), centrifugeret og fortyndet i medium til en koncentration på 2,5 til 3,5 x 10

5 celler /ml. Salg

Antistoffer og kemisk reagenser

Anti-TSHr antistoffer blev indkøbt fra Novus Biologicals, Canada, og Acris antistofferne Inc, USA. Thyrotropin (oprenset humant TSH phTSH) blev købt fra Bioworld, USA. Thyrogen (rekombinant TSH eller rhTSH) blev købt fra Genzyme Canada Inc., Canada. Thiolyated PEG 5000 (polyethylenglycol, MW 5000 kD) blev købt fra Laysan Bio, USA. NHS (

N

hydroxysuccinimid) og EDC (ethyl-dimethylaminopropyl-carbodiimid) blev købt fra Sigma-Aldrich, USA.

Western blotting

BCPAP og NSC-34 celler blev indsamlet ved hjælp 0,05% trypsin og lyseret ved anvendelse af 1 X Reporter Lysis buffer. Til Western blot-analyse, 20 ug total-blokerede cellelysat blev sat på en 10% SDS-PAGE-gel. Primære antistoffer blev fortyndet 1: 1000 og anvendes under producentens foreslåede protokoller. Proteinet ekspression blev visualiseret ved anvendelse af ECL kit og eksponeret for film.

konjugerede BioNanofluid præparat

COOH-funktionaliserede Au-indrettede MWCNTs blev opnået fra McGill University, Canada og fortyndet med d

2H

2O til en fungerende koncentration på 18-20 mg /l før konjugering, for at sikre mono-dispersitet. COOH funktionalisering blev opnået ved plasmabehandling, en generel fremgangsmåde til tilsætning af funktionelle grupper ved defekter i graphene strukturer [36, 37]. Au dekoration blev udført ved pulseret laser ablation under anvendelse af en Nd: YAG-laser fokuseret på MWCNT mål på en fluens i størrelsesordenen 1 J /cm

2. Processen kan rutinemæssigt dekorere CdSe, Au, Ag, Si, og Sn på MWCNTs. Materialet skabte havde Au-belagte øer (variabel størrelse 1 nm-5 nm som observeret og målt fra SEM i figur 1A) til PEG-binding og udsatte COOH-grupper, hvor Au var fraværende. Sammenhæng i batch-løsninger blev vurderet ved UV-vis spektrometri, hjælp peak 260 nm for at bestemme konsekvent koncentration.

A. Scanning elektronmikroskopi (SEM) billeder af COOH-funktionaliserede Au-mærkede thiol-Carbon afledte bionanofluids, ved to forskellige forstørrelser. Au-partikler har defineret sfæriske strukturer, fremhævet af pilespids. B. EDC-NHS koblingskemi at vedhæfte bio-affinitetsmolekyler, hvad enten antistof eller protein /mitogen til Thiol-PEG-CNT. PEGylering af thiolen-CNT er beskrevet i Materialer og Metoder.

BioNanofluid blev modificeret under anvendelse thiolerede PEG (MW 5000) i løbet af 1 time med -SH gruppe, der danner den Au-S-binding, der danner grundlaget for ikke-specifik forebyggelse absorption. Materialet skabt havde både PEG børster omkring de tynde guld-belagte øer og udsatte COOH grupper, hvor guldet var fraværende. En stamopløsning af 150 uM thiolyated PEG blev fremstillet i destilleret vand ved pH 4,5. MWCNT [500 pi stamopløsning (1 ug)] blev inkuberet med 200 pi thioleret PEG5000 150 uM stamopløsning i et endeligt volumen på 700 pi ved stuetemperatur i en time ved pH 5. Blandingen blev derefter centrifugeret i 10 minutter ved 13.000 RPM blev supernatanten kasseret, og pelleten blev resuspenderet i 350 pi PBS (pH 7,4). Thiol-PEG-CNT blev efterfølgende konjugeret til det målsøgende molekyle. Konjugeringen blanding omfattede 350 pi PEG-BioNanofluid, 90 pi (36,8 mM) NHS, 90 pi (22.1 mM) EDC, og 4 ug af en af ​​følgende ligander: a-TSHr, Thyrotropin eller Thyrogen, med en endelig pH på 5,5 (se fig 1B). Konjugeringen fik lov at forløbe i 1 time ved stuetemperatur. Efter endt konjugering blev blandingen centrifugeret i 10 minutter ved 13.000 rpm ved stuetemperatur, supernatanten fjernes, og de konjugerede BioNanofluid pellets blev vasket (3 gange) med PBS og derefter resuspenderet i 300 pi PBS.

Cell målretning og laserbehandling

100 til 200 pi af frisk indsamlede celler (indeholdende 250,000-350,000 celler pr ml) blev blandet med 100-200 ml konjugater, thiol-PEG-CNT /BioNanofluid eller PBS, ifølge eksperimentet , i et 1,5 ml Eppendorf-rør. Prøverne blev derefter inkuberet ved 37 ° C på en roterende rack i 1 time. Prøverne blev derefter vasket 3 gange med PBS for at fjerne ubundet BioNanofluid og uvedkommende cellerester. Efter vask blev cellerne delt i 25 pi alikvoter i 200 pi sterile eppendorfs, og behandlet med en 532 nm 2,7 W /cm

2-laser. Laser behandlinger blev udført under anvendelse individuelle inkuberinger af α-TSHr, Thyrotropin eller Thyrogen konjugeret-BioNanofluid. Forsøg blev gentaget med et minimum af 3 replikater for hver koncentration eller laser eksponeringstid. Kontrolforsøg blev udført med nøgne IgG-konjugeret BioNanofluid, thiol-PEG-CNT (ingen ligander) eller med PBS, og celler alene. Formålet med kontrollen var at undersøge virkningerne af hver kemiske og biologiske ændringer, uspecifik absorption og eksponeringstid til laseren på celler, og også for at begrænse eller eliminere bivirkninger, der kan forårsage celledød således, at den kun forekommer, når laser interagerer med kulstofnanorørene

Umiddelbart efter Lasereksponeringsgrænser blev trypanblå tilsat i en 1:. 1 volumenforhold celle fraktur i hvert mikrorør, og det hvide (live) celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer. Tællinger blev udført tredobbelt, og hvert eksperiment blev udført ved 3 forskellige lejligheder. Procentdelen af ​​celledræbende (levende celler tilbage) blev beregnet ifølge ligning:

BioNanofluid stabilitet eksperimenter

4 ° C

Konjugater blev udarbejdet på dag 1, og holdes. ved 4 ° C indtil dag 21. Forsøg blev udført for en hel uge (dag 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7), og derefter fortsatte på dag 10, 14 og 21. BCPAP celler blev udsat for den 532 nm laser til 30 sekunder ved et 2: 1-celler: BioNanofluid forhold. Koncentrationerne af de konjugerede og ukonjugerede BioNanofluid blev målt ved anvendelse af UV-VIS spektrometer, for at sikre ækvivalens af koncentration ved anvendelse af en opløsning af samme absorbans.

-20 /-80 ° C.

konjugater oprettet på dag 1, blev alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C eller -80 ° C. Eksperimenter blev udført på dag 1, 5, 7 og derefter hver uge i op til 6 uger. BCPAP celler blev udsat for den 532 nm laser i 30 sekunder ved et 2: 1 celle: konjugat-forhold. Ligeledes blev koncentrationerne af de konjugerede og ukonjugerede BioNanofluid målt ved hjælp af UV-VIS spektrometer.

Resultater

BioNanofluid karakteristika

Den optiske fysik af kulstof-nanorør er blevet undersøgt og beskrevet andetsteds [38]. Kort sagt, de har den største absorbans koefficient af nanopartikel arter og en bredbåndsforbindelse absorbans, der passer til design regler. Lagdelingen af ​​graphene rørlængde er i mikrometerområdet opnår en meget stor aspektforhold for flere biomolekylære vedhæftede filer, hvilket skaber flere gyrus partikler, hvor flere celleoverfladereceptorer kan genkendes af antistoffer eller andre ligander. Flerlags kulstof-nanorør (MWCNTs) tilbyder en fremragende metode til meget lokal varmeudvikling i kraft af deres høje kapacitet til at absorbere lys og konvertere det til varme, mens de resterende ubeskadiget [27-29]. Dette er en egenskab ved graphene-baserede materialer, de udviser bredbånd absorbans af lys, er i stand til at absorbere en meget stort spektrum af lyse farver og være i stand til at omdanne denne energi med høj effektivitet. Dette fremgår af den sorte farve, at kulstofnanorør udstilling. Med absorbans af lys, energien af ​​fotonen fremmer en elektron til et højere energiniveau fra grundtilstanden, kan tabet af denne energi forekomme enten i svage foto-luminescerende emissioner og små intersystem processer, men den grundlæggende overførsel af energi til den omgivende carbon materialer er i form af varmeenergi. Således varme, der genereres i løbet af nanometer skalaer ved bio-funktionaliserede MWCNTs fastgjort til selektive /specifikke celler, vil forårsage hurtig og tilstrækkelig lokal hypertermi uden “bulk opvarmning” af nærliggende potentielt følsomme væv. Tidligere har nanopartikler af guld med deres plasmoniske absorptionsegenskaber blevet anvendt til at konvertere lys til varme og inducere celledød i tumorer [25]. Den store lyse flusmidler eller ultrakorte lys puls modulationer, der kræves for at opnå høje temperaturer [39] har brug for langvarig udsættelse af 5 til 15 minutter [40] og forårsage skade skader på omkringliggende ikke-kræftceller.

Basen materiale af BioNanofluid er COOH funktionaliseret flervæggede kulstof-nanorør (længde i området fra 0,25 um til 10 um med en diameter på 25-50 nm) med guld (Au) er tyndt overtrukket som en yderligere modifikation, blev genereret via amid thiol forbindelser til kemiske og biologiske ligander. Billeder af COOH-funktionaliserede Au-dekorerede MWCNTs blev udført ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (figur 1A).

TSHr målretning af BioNanofluid for PTC-cellelinjer

Thyreoidea stimulerende hormon receptor (TSHr) blev valgt til sin robuste udtryk i både normal såvel som i differentierede skjoldbruskkirtlen cancerceller [41-44], som fremgår af undersøgelser, der viser ingen nedregulering af TSH-R i differentierede skjoldbruskkirtlen cancerceller [45], mens andre viste TSHr blive over-udtrykt i thyroid carcinomer og benigne adenomer sammenlignet med normale thyreoideavæv [43]. Fastgørelsen af ​​TSH til dets receptor stimulerer cellevækst og proliferation, og hjælper herved i PTC progression [46]. Dette giver en forklaring på, hvorfor levothyroxin foreskrives i doser, der undertrykker TSH, det vil sige for at forhindre vækst af mikroorganismer metastaser og /eller rest thyreoideavæv efter konventionel behandling for kræft i skjoldbruskkirtlen. Desuden den robuste udtryk for TSHr, er allestedsnærværende på thyrocyte, stadig fungerer som en vigtig og vedvarende regulator og fysiologiske markør i primær og metastatisk sygdom med evnen til at målrette BioNanofluid konjugater for et terapeutisk potentiale.

vurdere potentialet målrette TSHr, en TSHr-positive udtrykkende PTC cellelinie (BCPAP) blev fundet og inkuberet med to forskellige α-TSHr-BioNanofluid hjælp TSHr antistoffer fra forskellige leverandører (figur 2). Begge leverandør antistoffer viste lignende og betydelige celledræbende satser på 62 ± 5,6% (Ab # 1 -Acris antistoffer) og 62 ± 5,1% (Ab # 2 -Novus biologiske), med p-værdier på 0,000148 (Ab # 1); og 5,74 x10

-5 (Ab # 2), sammenlignet med IgG-BioNanofluids. Antistofferne Alene IgG-BioNanofluid eller ukonjugeret Thiol-PEG-CNTs udviste minimal celledræbende potentiale

To TSHr specifikke antistoffer, købt fra forskellige leverancer (Ab # 1, acris antistoffer. Ab # 2, Novus Biologicals ) blev konjugeret til vores Thiol-PEG-CNTs, sammen med IgG kanin og mus-thiol-PEG-CNT konjugater som ikke-specifikke kontroller til at målrette celle drab på BCPAP PTC celler. Andre kontrol betingelser omfatter PBS, CNT-partikler og antistoffer alene. Resultaterne er vist som% levende celler efter laserbehandling efterfulgt af Trypan Blue-farvning til at definere døde fra levende celler. α-TSHr-Bionanofluid konjugater signifikant (Ab # 1, p = 0.000148; Ab # 2, p = 5,74 x10

-5) dræbte BCPAP celler vs. IgG-bionanofluid konjugater. Alle andre kontroller viste ingen signifikante celler dræber satser vs. IgG-bionanofluids.

BioNanofluid optimeringer

For at nå en maksimal celledræbende sats med et minimum forekomst af ikke-specifik celle død, vi fortsatte med at optimere vores betingelser for at tage højde for celle fusion bioNanofluid og længden af ​​tid for eksponering af bionanofluid-celle-kompleks til laseren

først, vi evalueret fire forskellige nøgletal (4:. 1, 2 : 1, 1: 1 og 1: 2) af celler til BioNanofluid konjugater. En 2: 1 celle til BioNanofluid forhold gav 58,9% (± 2,3) celledræbende sats ved α-TSHr-BioNanofluid, 65,1% (± 2,1) for Thyrotropin-BioNanofluid, og 72,4% (± 3,52) for Thyrogen-BioNanofluid (Fig 3A ). Endvidere Thyrogen-BioNanofluid udkonkurrerede både α-TSHR- og Thyrotropin-BioNanofluid ved 2: 1-forhold. Forøgelse BioNanofluid indhold til en 1: 1 eller 1: 2 (celle: BioNanofluid) -forhold forårsagede 47,1% (± 7,65) og 69,0% (± 4,52) celledød henholdsvis af ikke-målrettet celledrab satser i CNT nanopartikler alene kontrol gruppe. Denne stigning i celledød, ved højere koncentrationer af ukonjugerede nanopartikler angår en stigning i partikelretentionskammeret på cellen af ​​ikke-specifikke celleoverflade forbund, som er fremherskende på alle MWCNT koncentrationer. Derfor er en højere koncentration /forhold mellem den ikke-specifikke partikelretention gruppe er talrige nok til at generere uønskede masseredigere opvarmningsvirkninger derved dræber celler. Endvidere den relative yderligere celledød af ikke-specifik målretning af α-TSHr-BioNanofluid konjugater ved 1: 1 [56,2% (± 8,70), p = 0,1501] eller 1: 2 [61,8 (± 21,2), p = 0,681] forholdet gruppe var ikke signifikant.

Inkluderet i disse eksperimentelle betingelser er, α-THSR-, Thyrogen-, og oprensede thyrotropin-thiol-PEG-CNT konjugater. Kontrol betingelser inkluderet PBS og CNT alene. A. Bestemmelse af optimal celle at bøje BioNanofluid forhold til at opnå specifik maksimal målrettet BCPAP celle drab. eksponering Laser tid var 30 sekunder for alle forhold. Forhold er repræsenteret volumen: volumen-forhold, således for en 1: 1-forhold, 100 pi celler (af 250,000-350,000 celler pr ml) blev blandet med 100 pi konjugeret-BioNanofluid af 2 ug /ml koncentration. B. Optimal eksponeringstid bestemmelse eksperiment. BCPAP celler blev udsat for laserbehandlingen i 20, 30 og 40 sekunder, ved et 2: 1 celle: conjugated- eller ukonjugeret-thiol-PEG CNT-forhold

Eksponeringstid blev udført med alle. konjugater til at bestemme den højeste celle drab uden tab af specificitet, dvs. høje ikke-målrettet celledød (figur 3B). Fyrre sekunders eksponering gav 67,8% (± 4,4) celledrab (α-TSHr), 67,8% (± 5,6) (thyrotropin), og 80,1% (± 5,1) (Thyrogen). Tredive sekunder eksponering gav 59,4% (± 1,3) drab (α-TSHr), 64,9% (± 5,8) (Thyrotropin), og 75,2% (± 3,5) (Thyrogen). Tyve sekunders eksponering viste 48,5% (± 4,75) (α-TSHr), 52,9% (± 6,8) (thyrotropin), og 65,8% (± 7,5) (Thyrogen). Selv de højeste celledræbende satser blev opnået med længere eksponeringstider (40 sek 30 sek 20 sek), ikke-målrettede drab i BioNanofluid kontrolgruppen med 40 sekunder eksponeringstid var 32,7% (± 11,6), igen afspejler spørgsmålet om håndtering af ikke-specifik celle drab gennem re-undersøgelse af PEG-modifikation. Derfor er en 30 sekunder eksponeringstid svarede til den højeste specifik celle drab. Men når laser eksponering blev forøget med en ti sekunders interval, det forårsagede ca. 2,5 gange det beløb (12% celledød ved 30 sekunder vs. 33% celledød ved 40 sekunders laser eksponering) af ikke-specifik celledød i un -konjugeret CNT kontrolgruppe. Dette afspejler vendepunktet mellem nanoskala temperatur levering og den tid det tager for BioNanofluid til tilstrækkelig bulk-varme en celle suspension. Tidligere studier har undersøgt virkningen af ​​lasereffekten og eksponeringstid er nødvendig for at overføre tilstrækkelig energi fører til celledestruktion. For eksempel er en undersøgelse behandlet Daudi-celler med eksponeringstider på 7 minutter og gav mere end 90% celledød [47]. Andre undersøgelser behandlet brystcancer, coloncancer, hepatocellulært carcinom og Daudi-cellelinier i 3 minutter eller mere [48-50]. Selv om nogle af de førnævnte undersøgelser brugte single-walled carbon nanorør (SWCNT) med definerede fototermisk egenskaber, fandt vi, at selv med en lille stigning på 10 sekunder, brug af MWCNT demonstrerede mere collateral damage. Vores resultater tyder på, at teknikken og partikel forberedelse af MWCNT anvendes til dette eksperiment udvise større effektivitet i foto-termisk varmeoverførsel i en celle-specifik måde.

TSHr-målrettet BioNanofluid selektivitet og specificitet

at vurdere både selektivitet og specificitet af TSHr målrettede BioNanofluid, valgte vi at udføre celle ablation eksperimenter samtidigt på både en TSHr positiv og TSHr negative cellelinie. Som BCPAP er en positiv TSHr udtrykkende cellelinie, fandt vi, at muse motor neuron cellelinie NSC-34 er null for TSHr ekspression (Fig 4A). Derfor har vi testet med α-TSHR-, Thyrotropin- og Thyrogen-BioNanofluids mod både BCPAP og NSC-34-celler (Fig 4B). Anvendelse af en 2: 1 celle: BioNanofluid ratio og 30 sekunder, fandt vi, at vores selektiv målretning af TSHr specifikt og signifikant kan diskriminere mellem TSHr udtrykkende og ikke-udtrykkende cellelinjer

A.. TSHr ekspression af BCPAP og NSC-34-celler blev bestemt ved Western blot-analyse under anvendelse TSHr specifikt antistof. BCPAP var positive for TSHr udtryk, hvorimod NSC-34 celler null. B-Actin blev anvendt som en loading kontrol. B. BCPAP og NSC-34 celle blev inkuberet α-THSR-, Thyrogen-, og oprensede thyrotropin-thiol-PEG-CNT konjugater. Kontrol betingelser inkluderet IgG-thiol-PEG-CNTs, PBS og CNT alene. Alle betingelser blev udført i 2: 1 celle: bionanofluid forhold og 30 anden laser eksponering. De BCPAP celler viste ~ 60% til ~ 73% celledræbende med alle TSHr målrettet bionanofluid konjugater, mens der blev observeret minimal celledød med kontrol- andre betingelser. Den NSC-34 cellelinje viste ubetydelig celledød i alle forhold.

BioNanofluid stabilitet

Eksperimenter blev udført for at vurdere aktiviteten af ​​de TSHr målrettede BioNanofluids, ved at vurdere deres stabilitet under langvarige opbevaringsbetingelser. Et parti α-TSHr-BioNanofluid blev skabt og opbevaret ved enten 4 ° C i 21 dage, eller -20 ° C og -80 ° C i 6 uger. Portionen af ​​α-TSHr-BioNanofluid opbevaret ved 4 ° C blev bedømt for deres aktivitet til ablatere BCPAP celler hverdag over en periode på 1 uge, og derefter gentaget på dag 10, 14 og 21 (fig 5A). α-TSHr-BioNanofluid begyndte at miste effektivitet på dag 5, med dens evne til at ablatere BCPAP celler falder fra 60% til 40%, mens Thyrogen-BioNanofluid konjugater tabt effekt på dag 6. Både α-TSHR- og Thyrogen-BioNanofluid syntes at plateau til at være 40% effektiv, indtil afslutningen af ​​forsøget, hvilket tyder fortsat, men hindret celle selektivitet. Det kan antages, at ydeevne vil falde med denaturering af proteinligander over en kort periode når de opbevares ved ustabile forhold på 4 ° C. Selv om intet kan udledes direkte som til Thyrogen eller α-TSHr struktur, koncentrationerne af BioNanofluid lagret ved 4 ° C var stabile målt ved UV /VIS spektrometer før blanding med cellerne. Som ligand-BioNanofluid UV /VIS absorbans forbliver konstant uanset potentiel denaturering, foreslås det, at give den kombinerede struktur absorbans ved 260 nm (absorbans ved denne bølgelængde er fælles for proteiner og CNTs) at lidt eller intet tab af ligand eller CNTs grund ansvar amid tilknytning eller CNT nedbrydning er årsager til tilbagegangen i aktiviteten (se S1 tabel).

A. α-TSHR- og Thyrogen-thiol-PEG-CNT konjugater blev fremstillet på dag 1 og holdes ved 4 ° C i op til 21 dage. Konjugater aktivitet blev vurderet ved celledrab assay af BCPAP celler (som beskrevet ovenfor). B. Tilsvarende blev α-TSHR- og Thyrogen-thiol-PEG-CNT konjugater fremstillet på dag 1 og blev holdt ved -20 ° C eller -80 ° C i op til 6 uger. Konjugater aktivitet blev vurderet ved celledrab assay på dag 5, dag 7, og hver uge i op til 6 uger.

Et lignende eksperiment blev udført over 6 uger, og den BioNanofluid opbevaret ved -20 ° C eller -80 ° C (figur 5B). BCPAP celle ablation eksperimenter blev udført på dag 1, 5, 7 og ugentlige, for op til 6 uger. Resultaterne viser stabilitet BioNanofluid aktivitet ved både -20 ° C og -80 ° C opbevaringsforhold, som observeret ved celle ablation procenter for α-TSHr-BioNanofluid og stadig opretholde 60% effektivitet, og Thyrogen-BioNanofluid besidder 65% virkningsfuldhed, over 6-ugers forsøget. De konjugerede og un-konjugerede MWCNT koncentrationer blev målt parallelt for hvert forsøg, og alle viste stabile koncentrationer.

Diskussion

Der er iboende begrænsninger i behandlingen af ​​tilbagevendende kræft i skjoldbruskkirtlen. Selvom de fleste tilfælde behandles med thyroidectomy, efterfulgt af TSH-suppressiv terapi med levothyroxin og radioaktivt jod i udvalgte tilfælde; tilbagevendende thyreoideacancer præsenterer en terapeutisk udfordring. Paradigmet af kræft i skjoldbruskkirtlen behandling og tilbagefald giver en passende ramme for at studere anvendelsen af ​​molekylært målrettede fysiske agenser. Nano-medieret foto termisk terapi vinder momentum i form af målrettede fysiske midler, som behandler en række forskellige kræftformer. Den kritiske udfordring for kræft i skjoldbruskkirtlen er at levere en agent, der ikke kun retter sig mod tumorceller, men også henvender normale rest skjoldbruskkirtlen celler. I denne undersøgelse, vi havde til formål at vurdere effekten af ​​en innovativ målrettet fysioterapi hjælp nyligt manipuleret bio-affinitet funktionaliserede kulstof-nanorør, eller BioNanofluid konjugater, for at vise,

in vitro

, effekten af ​​at målrette TSHr og ablation