PLoS ONE: Sammenligning af Cancer Gene Targeting og Biokemiske selektivitet af All Målrettet kinase hæmmere Godkendt til kliniske Use

Abstrakt

De anti-proliferative aktiviteter af alle femogtyve målrettede kinase inhibitor lægemidler, som er i klinisk brug blev målt i to store assay paneler: (1) et panel af proliferationsassays af fireogfyrretyve humane cancercellelinier fra forskellige tumor- væv oprindelse; og (2) et panel af mere end 300 kinase enzymaktivitetsassays. Denne undersøgelse giver et frontalt sammenligning af alle kinase inhibitor narkotika i brug (status Nov. 2013), og for seks af disse stoffer, den første kinome profilering data i det offentlige domæne. Korrelation af narkotika aktiviteter med kræft genmutationer afslørede nye stof følsomhed markører, hvilket tyder på, at kræft er afhængige af mutant

CTNNB1

vil reagere på trametinib og andre MEK-inhibitorer, og kræft er afhængige af

Smad4

til lille molekyle EGFR-inhibitor lægemidler. Sammenligning af cellulære målretning effektiviteter afslører de mest målrettede inhibitorer til EGFR, ABL1 og BRAF (V600E) -driven cellevækst, og viser, at de bedst målrettede agenter kombinerer høj biokemisk potens med god selektivitet. For ABL1 hæmmere, vi beregningsmæssigt udlede optimeret kinase profiler til brug i en næste generation af lægemidler. Vores undersøgelse viser styrken i at kombinere biokemiske og cellulære profilering data i evalueringen af ​​kinase inhibitor narkotika handling

Henvisning:. Uitdehaag JCM, de Roos JADM, van Doornmalen AM, Prinsen MBW, de Man J, Tanizawa Y, et al. (2014) Sammenligning af Cancer Gene Targeting og Biokemiske selektivitet af All Målrettet kinase hæmmere Godkendt til klinisk brug. PLoS ONE 9 (3): e92146. doi: 10,1371 /journal.pone.0092146

Redaktør: Yiqun G. Shellman, University of Colorado, School of Medicine, USA

Modtaget: December 19, 2013; Accepteret: 17 februar 2014; Udgivet: 20 Mar 2014

Copyright: © 2014 Uitdehaag et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Innovation Office (Agentschap NL) af økonomiministeriet i Nederlandene (INT 111.039). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. RB og GZ er grundlæggere og aktionærer i Holland Translationel Research Center BV (ntrC). KY er en af ​​stifterne af Carna Biosciences, Inc. (Carna). KY og YK er aktionærer i Carna. Den beskrevne cancer cellelinje profilering tilbydes som en kommerciel tjeneste ved ntrC under navnet Oncolines. Den beskrevne biokemiske kinase profilering tilbydes som en kommerciel tjeneste ved Carna under navnet QuickScout. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

målrettede behandlinger øge effektiviteten af ​​cancerbehandling. De bringer stor fordel for patienterne, fordi de forbedrer overlevelseschancerne med langt færre bivirkninger end traditionelle cytotoksiske behandlinger. Småmolekyleinhibitorer af protein kinaser er et glimrende eksempel på succesen af ​​målrettet terapi. Der er i øjeblikket (November 2013) femogtyve kinaseinhibitor lægemidler godkendt til klinisk anvendelse, alle undtagen to for cancer (tabel 1 og figur 1). I 2012 proteinkinaser var den mest succesfulde mål klasse baseret på antallet af godkendte nye lægemidler af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA), og denne tendens fortsatte i 2013 [1]. Men i betragtning af den høje nedslidning af lægemiddelkandidater, de begrænsede Overlevelsesgevinsten ved første generations terapier, problemet med lægemiddelresistens og det faktum, at målrettet terapi er kun til gavn for en lille brøkdel af kræftpatienter, der er behov for nyt og forbedret målrettede kinase hæmmere.

Alle er kinase inhibitorer, der blev godkendt til klinisk brug i Nov. 2013.

afgørende for udviklingen af ​​målrettede behandlinger er evnen til at parret narkotika reaktion på en genetisk markør, såsom mutation, translokation eller overekspression af en cancer-gen [2]. Trods at der er mere end 500 kinaser kodes af det humane genom, nuværende godkendte kinaseinhibitor lægemidler virker primært gennem kun omkring ti forskellige mål (tabel 1 og tabel S1). De fleste kinaseinhibitorer for onkologi virker ved at hæmme tumor celleproliferation, angiogenese, eller begge [3]. Der er derfor behov Drug følsomhed biomarkører til at støtte udviklingen af ​​nye målrettede behandlinger og udvide nytten af ​​markedsførte anti-behandlinger mod kræft.

For bedre forudsige patientens responder befolkninger på et tidligt stadium i udvikling af lægemidler, og for bedre at forstå kinase narkotika handling, har vi etableret en kræftcelle linje panel af fyrre-fire cellelinier, der er blevet afledt af en bred vifte af humane tumorer (figur 2A). De kræft genmutationer, der driver kræft fænotype af de fleste af de cellelinjer er blevet karakteriseret i COSMIC cellelinier (CCL) projektet [4]. Vores panel indeholder repræsentanter for alle kendte onkogener og tumor suppressorer, at der i et stort celle panel sammenfatte en mere end 90% af alle dokumenterede genetiske ændringer (tabel S2) [4]. Tyve-tre af disse hyppige genetiske ændringer forekomme i mindst to cellelinjer (figur 2B og tabel S3)

A:. Tissue oprindelse cellelinier i panelet Oncolines. B:. Hyppigheden af ​​kræft gen ændringer i celle panel,

dvs.

, mutationer, translokationer og eksemplarnummer ændringer i COSMIC cellelinje Project [4]. C: Hierarkisk gruppering af profilering data af markedsførte kinase inhibitor narkotika i 44-cellelinje panel. Ikke skalérbart

10logIC

50’erne blev brugt. Doxorubicin_123 er en tredobbelt profilering til kontrol. Ikke-kinase hæmmere er farvet rød. D:. Kinaseinhibitorer har en større selektivitet i cellen panelet end klassiske cytotoksiske midler (5-fluoruracil, cisplatin, vincristin, doxorubicin, etoposid, docetaxel og bortezomib)

Nylige undersøgelser har vist, at cellelinie paneler kan anvendes til at identificere nye markører af lægemiddel følsomhed ved kobling lægemiddel reaktion på tilstedeværelsen af ​​cancer genmutationer [4] – [7]. Disse undersøgelser har brugt celle paneler med op til 400-1000 cellelinjer, for at opdage nye følsomheder relateret til sjældne genetiske varianter. Men sådanne paneler er upraktisk til rutinemæssig brug [8]. Mindre paneler er forsøgsmæssigt mere tilgængelige og kan også give nyttige data, som er blevet påvist for tres cellelinje panel af National Cancer Institute (NCI60), hvori siden 1990’erne mere end 300.000 forbindelser er blevet karakteriseret [9], og femogfyrre cellelinje panel af den japanske forskningsfond [10].

for at sammenligne de anti-proliferative aktiviteter af alle kinase inhibitor lægemidler der er blevet godkendt til klinisk brug, vi har profileret dem i vores fireogfyrre cellelinie panel. Vi korreleret narkotika aktiviteter til kræft genmutationer og identificeret nye stof følsomhed markører for MEK og EGFR-hæmmere. Desuden blev data for celle panel anvendes til kvantitativ sammenligne relative målretning virkning af lægemidler designet til at inhibere den samme kinase.

For yderligere at undersøge biokemiske oprindelse differentielle effekter i cellulær målretning vi profileret alle kinaseinhibitor lægemidler på en panel af enzymaktivitetassays på over 300 vildtype og mutante kinaser [11]. Betragtninger er tilgængelige omfattende biokemiske selektivitet data for mange kinaseinhibitorer [12] – [14], dette giver de første omfattende profiler af de godkendte lægemidler cabozantinib [15], dabrafenib [16], ponatinib [17], regorafenib [18], trametinib [19] og vemurafenib [20] (tabel 1). Kombination af de cellulære og biokemiske datasæt afslører, at biokemisk potens og selektivitet er selvstændige bidragydere til effektiv målretning af genetiske bilister i tumorceller. Desuden kan specifikke off-target aktiviteter bidrage positivt til målretning, som vi viser for ABL1 hæmmere, ved beregningsmæssigt linke kinome profiler til cellulær målretning. Vores undersøgelse viser, at celle panel profilering i kombination med biokemisk panel profilering er et kraftfuldt værktøj til at finde nye anvendelsesområder for eksisterende hæmmere, og udformningen af ​​optimalt målrettede hæmmere.

Resultater

Sammensætning og validering af Cell panel

Et panel af fireogfyrretyve humane cancercellelinier blev samlet fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellelinierne blev udtaget til både en lang række forskellige væv tumortyper (figur 2A) og mange forskellige genetiske ændringer i onkogener og tumorsuppressorgener (figur 2B). Offentlig DNA-sekvens information fra CCL-projektet [4] og kræftcellen Linje Encyclopedia (CCLE) [5] blev anvendt til at udvælge de cellelinjer. For alle cellelinjer, udviklede vi proliferationsassays under anvendelse måling af intracellulær ATP indhold som en indirekte udlæsning af celleantal. Sammenlignet med andre celle paneler har panelet (Oncolines) øget genetisk diversitet (fig S1) og de testkoncentrationer spænder over et bredere område: ni point fra 32 pM til 3,2 nM. Vi har ikke vurdere sammensatte aktiviteter ved ekstrapolation udenfor test interval, som blev udført i en anden undersøgelse [4]. I stedet for at sikre, at alle IC

50’erne faldt inden for testning interval, blev det udvidet til subnanomolære koncentrationer i tilfælde af meget potente forbindelser. For at bevare cellelinie egenskaber, blev cellelinierne dyrket i medierne anbefalet af de oprindelige forskere, som deponerede cellelinjerne, og ved ATCC. Alle anvendte celler var inden ni passager fra den oprindelige ATCC hætteglasset

Nøjagtigheden af ​​cellulære respons data er at få øget opmærksomhed [21] – [23].. Ved at følge en standardiseret arbejdsgang og gennemføre kriterier strenge kvalitetskrav, vi opnået en maksimal IC

50 skift af en faktor to og en standardafvigelse på 0,07 på

10logIC

50 værdier (en faktor på 1,17), baseret på flere uafhængige målinger af de samme forbindelser på tværs af panelet (fig S2). At benchmarke denne værdi, vi undersøgte reproducerbarhed på offentlige datasæt. Trods den generelle enighed om, at offentlige datasæt sammensatte profilering eksperimenter er af høj værdi til lægemiddelforskning samfund, information om reproducerbarheden af ​​data er sparsomme. For NCI60 panel blev observeret en afvigelse på højst IC

50 af en faktor 11, når den samme forbindelse blev målt ved to forskellige lejligheder (Figur S2C) Endvidere i en nylig analyse af chEMBL data [21], når to grupper i forskellige laboratorier målt samme konstante, en standardafvigelse på 0,8 i

10logIC

50’erne blev fundet. Dette svarer til en faktor 10

0,8 = 6 som standardafvigelse i IC

50’erne. Vi konkluderer derfor, at vores cellelinje profilering data er meget reproducerbar.

For at afgøre, om panelet har tilstrækkelig størrelse, udførte vi en magt analyse. Afhængig af antallet af cellelinjer, der bærer en specifik cancer genmutation, en IC

50 skift af 2 til 10 gange mellem respondere og non-respondere er statistisk signifikant (tabel S4). Disse grænser falder godt inden svarene normalt observeret [4], og dermed en 44-cellelinje panel er passende stor til at udføre narkotika responder analyser.

Profilering af Klinisk kinase hæmmere i Cell Panel

i en sammenlignende stof følsomhedsanalyse, vi profileret alle femogtyve kinaseinhibitorer i klinisk brug på alle fyrre-fire cellelinjer, sammen med seks klassiske cytostatika og proteasominhibitoren bortezomib (figur 2C, tabel S5). Alle kinaseinhibitor lægemidler godkendt til behandling af kræft viste antiproliferativ aktivitet på i det mindste nogle af cellelinierne. Kun tofacitinib og fasudil, de to lægemidler, der er godkendt til ikke-kræftindikationer (tabel 1), viste ingen eller meget ringe hæmmende aktivitet.

Gruppering af alle celleproliferation data (Figur 2C) bekræftede, at cytostatika har relativt undiscriminatory aktivitet mod alle cellelinier. Profilen af ​​proteasominhibitor bortezomib ligner den for cytotoksiske midler, der illustrerer, at inhibering af en veldefineret mål ikke resulterer i en målrettet terapi, når målet udfører en generel fysiologisk funktion. Af alle cellelinjer, SHP-77 var den mindst følsomme over for doxorubicin, cisplatin, docetaxel, etoposid, vincristin og bortezomib (figur 2C), der falder sammen med dets ekspression af multiple multi-drug-resistensmekanismer [24]. HCT-15 og DLD-1 er forskellige i karyotype men stammer fra den samme patient [25]. Konsekvent, profilerne af to cellelinier klynge sammen. SW-620 og SW-480 også stamme fra den samme patient, men ikke klynge sammen, primært fordi SW-620, som er afledt af en metastase, er væsentligt mere følsom over for MEK-inhibitor trametinib (figur 2C).

Clear målrettet virkninger er vist ved kinaseinhibitor lægemidler, da mange inhiberer proliferation af kun nogle få cellelinier. Hvilke linier afhænger af deres virkningsmekanisme. For eksempel EGFR inhibitorer lapatinib, erlotinib og gefitinib klynge sammen, fordi de hæmmer den samme delmængde af cellelinjer, især AU-565, FaDu, CAL 27 og C-33A, som stammer fra en række forskellige væv og har den fælles kendetegn at de overudtrykker

EGFR

(tabel S3). Den ABL1 hæmmere imatinib og nilotinib klynge sammen, fordi de selektivt hæmme cellelinjer A-204 og K-562, der er afhængige af ABL1 for vækst (Figur 2C). Imidlertid er andre kinase lægemidler inhiberer væksten af ​​multiple cellelinier, såsom axitinib, ponatinib, bosutinib, sunitinib og crizotinib, som klynge sammen i varmen kortet (figur 2C), mTOR inhibitorer temsirolimus og everolimus, og MEK-inhibitor trametinib (figur 2C). For yderligere at analysere den cellulære selektivitet kinase hæmmere, sammenlignede vi den mest potente cellulære IC

50 af en forbindelse, som et mål for specifik cellulær aktivitet, med den gennemsnitlige IC

50 i den fulde panel, som et mål for generel cellulær toksicitet. Klassiske cytotoksiske terapier og bortezomib viser en 10-fold forskel mellem den gennemsnitlige IC

50 i cellen panelet og den mest potente IC

50 (figur 2D). I modsætning hertil viste de fleste kinaseinhibitorer en 100-fold forskel, og dasatinib endda en mere end 1000 gange forskel (figur 2D), hvilket viser, at kinaseinhibitorer faktisk opnå en forbedret selektivitet vindue i sammenligning med klassiske kemoterapeutiske midler.

Biokemisk profilering for Klinisk kinase hæmmere

for at relatere anti-proliferative aktivitet af kinase inhibitor medicin til hæmning af specifikke kinase mål blev alle forbindelser profileret på en enkelt koncentration på et panel af mere end 300 biokemiske kinase assays (figur 3A, tabel S6) [11]. Derudover, for de vigtigste mål, IC

50 værdier blev bestemt (tabel 1). For vemurafenib, dabrafenib, trametinib, regorafenib og cabozantinib, dette er den første store kinome profil i det offentlige rum. En sammenligning af de godkendte RAF hæmmere vemurafenib og dabrafenib viser, at dabrafenib er langt mere potent end vemurafenib på vildtype BRAF og mutant BRAF (V600E). Dabrafenib hæmmer også væsentligt flere kinaser (tabel 1, figur 3A). Den første profil trametinib afslører, at, da de fleste MEK-inhibitorer [26], er udsøgt selektiv (figur 3A). Regorafenib er en strukturel analog af sorafenib og viser en lignende biokemisk profil (figur 3A). Regorafenib er blevet klassificeret som mere potent [18]. Men de data viser, at dette er sandt for sin hæmning af VEGFR2, et mål for angiogenese lægemidler, men ikke for PDGFRα, et mål i gastrointestinale stromale tumorer, en indikation for hvilken regorafenib er godkendt samt (Tabel 1). Biokemisk hæmning af TIE2, en anden receptor er involveret i angiogenese, var mindre, i overensstemmelse med en tidligere rapport (tabel S6) [18]. I stedet regorafenib har betydelig ekstra hæmmende aktivitet på flere onkogene kinaser, herunder ephrin receptorer og p70S6K, der kan bidrage til dens differential kliniske profil [27]. Cabozantinib er blevet karakteriseret som et kombineret VEGFR2, MET og RET inhibitor og er en af ​​de mest potente VEGFR2 inhibitorer (tabel 1). Det er godkendt til brug i medullært thyroidea carcinom, i overensstemmelse med dens potente hæmning af RET [28]. Dette er imidlertid ikke et kendetegn for cabozantinib, som alle vækstfaktor kinase receptor inhibitorer, og mange ABL1 inhibitorer er potente RET inhibitorer (tabel S6). Cabozantinib aktivitet på MET, andet vigtigt mål stof [29], er meget mere speciel, da crizotinib er i øjeblikket den eneste anden godkendte lægemiddel, der hæmmer denne kinase

A:. Hierarkisk gruppering af hæmmende profiler af alle kinase lægemidler i et panel af mere end 300 biokemiske kinaseassays (% -inhibition ved 1 uM inhibitorkoncentration). Trametinib, everolimus og temsirolimus viser kun mindre hæmning, som mTOR og MEK-kinase analyser ikke inkluderet i panelet. B: Potente biokemiske IC

50’erne på den biologiske mål korrelerer med mere potent cellulære IC

50’erne. C: Biokemisk selektivitet fører til en mere selektiv reaktion i cellen panelet. Biokemisk selektivitet blev kvantificeret ved selektivitet entropi [33] og selektiviteten målrette cellevækst blev udtrykt af den gennemsnitlige IC

50 i cellen panelet. Ikke-onkologi narkotika fasudil og tofacitinib blev slettet fra analysen på grund af manglende respons. Åbne cirkler: den mTOR og MEK-hæmmere everolimus, temsirolimus og trametinib henholdsvis

De biokemiske profiler af alle femogtyve kinase lægemidler i samme assay panel tillade os at studere, hvordan biokemiske potens og selektivitet indflydelse. generel cellulære målretning. Dette er vigtigt, som i kinase området, selektivitet af nye lægemiddelkandidater er en meget debatteret emne [30] – [32]. Forbedret biokemisk potens korrelerer med forbedrede cellulære IC

50s, og styrken af ​​denne relation er target-afhængig (figur 3B). For at overvåge biokemisk selektivitet, vi sammenfattet de kinome profiler ved at beregne selektivitet entropi (tabel 1) [33]. Den nedre denne værdi, desto mere selektive en forbindelse. En lavere biokemisk selektivitet entropi forventes at resultere i mindre generel cellulær toksicitet som bestemt ved gennemsnit celle panel IC

50, og dette er tilfældet i mange inhibitorer (figur 3C). Axitinib, ponatinib, bosutinib, sunitinib og crizotinib har en høj entropi (tabel 1) og viser en bred cellulær aktivitet (figur 3C). Den cellulære toksicitet af EGFR, ABL1 og inhibitorer BRAF (V600E) forbedrer også med stigende selektivitet (figur 3C). Undtagelserne er mTOR og MEK-inhibitorer, som er biokemisk meget selektive inhibitorer (tabel 1, figur 3A), men inhiberer proliferation af mange celler. Dette bekræfter, at MEK og mTOR drive udbredelsen af ​​mange cellelinjer, og illustrerer, at selektiviteten af ​​et cellulært respons afhænger også af biologiske mål.

genetiske markører for Drug Følsomhed

At udforske biologi ligger til grund for cellulære reaktioner, vi undersøgte de genetiske determinanter for svar på de femogtyve kinase hæmmer narkotika i en saglig måde. Vi korreleret eventuelle forskelle i IC

50 af Anova-analyse med mutationer, translokationer, mRNA overekspression og DNA-kopi nummer ændrer sig i et sæt af meget hyppige og validerede cancer gener (Tabel S3 og figur S3 til S5). Adskillige kendte sammenslutninger af målrettede behandlinger blev brugt til at validere celle panel som et testpræparat værktøj til opdagelsen af ​​nye lægemidler følsomhed markører. For eksempel nutlin 3a, en forbindelse stabilisere interaktionen af ​​p53 med MDM2, inhiberede proliferationen af ​​cellelinier vildtype for

TP53

mere potent end cellelinier, der udtrykker mutant

TP53

(fig S3 ). Den BRAF-hæmmere vemurafenib og dabrafenib fortrinsvis hæmmede udbredelsen af ​​cellelinjer, der indeholder

BRAF (V600E)

mutation. ABL1 hæmmere og EGFR-hæmmere efter præference hæmmede cellelinjer, der er afhængige af

ABL1

og

EGFR

onkogener henholdsvis (Tal S4 og S5).

Med Anova-analyse, vi opdaget nye lægemiddelfølsomhed markører for MEK og EGFR-hæmmere. MEK inhibitor trametinib efter præference inhiberede cellelinier bærer mutationer i

CTNNB1

, som koder transkriptionsfaktoren β-catenin (figur 4A). Foreningen blev bekræftet med to andre MEK-inhibitorer,

dvs..

AZD6244 og PD0925301 (figur S6). I gennemsnit har MEK-inhibitorer var mellem 12 og 37 gange mere potent i cellelinjer, der udtrykker mutant β-catenin i sammenligning med cellelinier, der udtrykker kun vildtypeproteinet. En yderligere interessant resultat er, at alle fire EGFR-hæmmere, herunder afatinib, er mere aktive i proliferationsassays i cellelinjer huser en mutation i

Smad4

(figur 4B og figur S5). Foreningen blev bekræftet med to andre EGFR-hæmmere, der stadig er i klinisk udvikling,

dvs..,

Pelitinib og neratinib (Figur S7). Forskellen i aktiviteten af ​​EGFR-hæmmere i

Smad4

mutant

versus

vildtypeceller varierede fra 2 til 12 gange

A:. MEK-inhibitor trametinib og B : EGFR inhibitor afatinib. Vulkanen plots viser den gennemsnitlige IC

50 skift mellem mutant og ikke-mutant cellelinier (x-aksen) og betydningen fra Anova test (y-aksen). Betydning blev korrigeret for flere test og alle foreninger over tærskelværdien (stiplet linje) er farvet grønt. Områder i cirkler er proportional med antallet af cellelinjer bærer mutationer.

Sammenligning Målretning Effekt inden Inhibitor Klasser

Analyse af genetiske determinanter for cellulært respons muliggør sammenligning af specificitet cellulære målretning af forskellige lægemidler, der er designet til at inhibere den samme molekylære mål, såsom EGFR, ABL1 eller BRAF inhibitorer (tabel 1, figur 5).

Hver cirkel repræsenterer et markedsført kinaseinhibitor og dets målrettede cellevækst inhibering. A: cellelinjer, der overudtrykker

EGFR

. B: Cellelinjer der indeholder

BRAF (V600E)

mutation. C: Cell linjer, der indeholder afvigende

ABL1

signalering. Forbindelser i øverste venstre hjørne af parcellerne har overlegen målretning. Statistisk relevante sammenslutninger efter korrektion for multiple test er farvet blåt. D: Kvantitativ sammenligning af inhibitor målretning ved standardisering af IC

50 skift mellem følsomme og ikke-følsomme cellelinjer

EGFR-hæmmere er et af de tidligste eksempler på målrettede behandlinger (tabel 1).. Gefitinib, erlotinib og afatinib er blevet godkendt til EGFR-overekspression lungekræft. Også lapatinib er aktiv mod EGFR (IC

50, 4,9 nM, tabel 1). Disse inhibitorer er alle meget selektive (tabel 1). Desuden spektrum selektive inhibitorer Vandetanib, bosutinib, ponatinib og dasatinib er potente EGFR-hæmmere (tabel S6). Overlay af den enkelte Anova analyser for EGFR viser, at selektive hæmmere har en bedre korrelation med

EGFR

ekspressionsniveauerne og større potens skift end spektrum-selektive hæmmere (figur 5A). Også EGFR specifikke hæmmere, såsom gefitinib og erlotinib, har en bedre målretning effektivitet end den duelt selektive Her2 /EGFR-hæmmere lapatinib og afatinib, selvom den irreversible inhibitor afatinib er mest potente på EGFR. Den mest målrettede EGFR-inhibitor er gefitinib (mest øverst til venstre i figur 5A), som har lignende biokemiske egenskaber som erlotinib (tabel 1). Dens overlegne målretning sandsynligvis relateret til specifikke off-target aktiviteter:

dvs,

gefitinib er mindre aktiv på ABL1 og mere aktiv på EGFR (T290M) mutant og ephrin receptorerne, som kan undertrykke EGFR ved cross-talk [34].

opdagelsen af, at væksten af ​​mange tumorer er drevet af en specifik mutation i BRAF onkogenet,

dvs. BRAF (V600E),

har ført til udviklingen af ​​RAF hæmmere vemurafenib og dabrafenib (tabel 1). Trametinib er en inhibitor af MEK, som virker nedstrøms for BRAF og er også registreret for BRAF mutant cancere [19]. Sorafenib er blevet karakteriseret som en hæmmer af BRAF [35], men er ikke blevet godkendt til BRAF-mutant kræftformer og dårligt hæmmer BRAF biokemisk (tabel 1). Anova analyse af cellelinje profilering data afslører en stærk sammenslutning af anti-proliferative aktivitet af dabrafenib med mutant

BRAF (V600E)

, efterfulgt på afstand af vemurafenib (figur 5B). Dabrafenib inhiberede BRAF mutante cellelinier med en 284 gange lavere IC

50 end ikke-mutante cellelinier. For vemurafenib forskellen var 3-fold. Der var ingen sammenhæng mellem den cellulære aktivitet af sorafenib og

BRAF (V600E)

. Målretning effektiviteten af ​​RAF-inhibitorer er relateret til den forøgede biokemiske styrke af dabrafenib sammenlignet med vemurafenib, som dabrafenib er mindre selektiv (tabel 1).

En anden vigtig klasse af kinaseinhibitor lægemidler er dem målretning ABL1, hvoraf en re-arrangeret form

dvs

BCR-ABL1, driver Philadelphia kromosom-positiv kronisk myeloid leukæmi (CML). Imatinib, nilotinib, dasatinib, ponatinib og bosutinib er godkendte lægemidler til denne indikation. Men også mange vækstfaktor kinase hæmmere såsom crizotinib, Vandetanib, axitinib og sunitinib er potente ABL1 hæmmere (figur 3A, tabel S6). Anova-analyse af kræft cellelinje profilering data afslører en stærk forening med

ABL

-afhængig cellevækst for alle CML-godkendte hæmmere, undtagen bosutinib (figur 5C). Dasatinib viser den mest potente IC

50 skift, som kan relateres til deres overlegne styrke. Fordi dasatinib er spektrum selektiv og hæmmer væksten af ​​mange forskellige cellelinjer, den signifikans (p-værdi) af foreningen er lav. Den mest målrettede ABL1 inhibitor i figur 4C er faktisk den mest selektive ABL1 inhibitor, imatinib (tabel 1).

Kvantificering af Cancer Gene Targeting

For yderligere at sammenligne hæmmere, udviklede vi et kvantitativt mål for kræft gene targeting på grundlag af celle panel data og respons analyse. Den gennemsnitlige IC

50 shift (ΔIC

50) af en forbindelse i Anova analyser blev brugt som grundlag, da den viser forskellen i styrken af ​​en forbindelse mellem følsomme (mutant) og ufølsom (vildtype) celle linjer. En anden vigtig parameter er den resterende varians mellem IC

50s i vild type eller onkogen-bærende gruppe af cellelinier (σ

mut

eller

wt

), som indikerer yderligere virkninger på cellevækst udover den vigtigste inhibitor mekanisme. At kombinere begge værdier, vi valgte den standardiserede gennemsnitlige forskel (SMD) som en kvantitativ værktøj, som er beregnet som ΔIC

50 /. For klinisk anvendte EGFR, viser ABL1 og BRAF kinase inhibitor narkotika denne mængde tydeligt, at dabrafenib og imatinib usædvanligt er målrettet, og at gefitinib og erlotinib er nær-ækvivalent (figur 5C), hvilket tyder på, at SMD IC

50’erne er en god værktøj til at rangere den målretning af lægemiddelkandidater og eksisterende behandlinger.

Udledning Optimal Kinome Profiles

det er blevet fremført, at specifikke krydsreaktiviteter, foruden en primær biokemisk aktivitet, kan bidrage positivt til den cellulære målretning af kinaseinhibitorer ved inhibering resistens eller tilbagemelding signalering [32], [36], [37]. Mange forskningsgrupper har forsøgt at designe specifikke, dual-aktivitet, eller endda flere aktivitet kinase hæmmere [31], [38], [39]. Imidlertid har det spørgsmål, som hæmmer profil er mest optimalt at målrette en bestemt genetisk driveren ikke blevet besvaret. Brug cellulære og biokemiske data, er vi begyndt at udlede sådanne »optimale« biokemiske profiler til cellulære mål.

I betragtning af betydningen af ​​ABL1 hæmmere (tabel 1), vi først søgte for enhver biokemisk aktivitet, i tillæg til hæmning af ABL1, kan der bidrager til den målsøgende virkning af denne lægemiddelklasse. Tyve relevante kinaser, inklusive alle mål af nuværende godkendte kinase inhibitor narkotika, blev udvalgt som kandidater, der kan giver gavnlige biaktiviteter. Hvis nogen af ​​disse kinaser blev hæmmet af en hvilken som helst af de 25 kinase inhibitor lægemidler ( 80% i tabel S6), blev parret mærket “aktiv”, ellers “inaktiv”. Den resulterende biokemiske aktivitet matrix blev brugt i en Anova analyse sammen med de cellulære målretning SMD (figur 5D) for at identificere biokemiske aktiviteter, der er målrettet cellelinjer, der bærer

ABL1

onkogen. Bortset fra den forventede identifikation af ABL1, denne analyse viste overraskende ABL2 (ARG) som signifikant side-aktivitet (figur 6A). Dette fund blev bekræftet ved anvendelse elastisk net regressionsanalyse (ikke vist), og ABL2 blev yderligere valideret ved at studere en separat datasæt binde K

ds [12], hvilket bekræfter, at ABL2-binding forøger den målsøgende virkning af ABL1 inhibitorer i cellen line panel (figur 6B). Bidraget fra ABL2 forklarer, hvorfor bosutinib, som er en potent hæmmer af ABL1 men mangler ABL2 aktivitet, har relativt svage målrettet effekt på

ABL1

onkogen-bærende celler sammenlignet med andre ABL1 hæmmere (Figur 5C).

A: Biokemiske komponenter af kinase inhibitorer, der bidrager til den specifikke målretning af

ABL1

afhængig cellevækst. Cirklen mærket ABL1 refererer til biokemisk ABL1 hæmning. B: hæmmere med lige ABL1 og ABL2 affinitet i en uafhængig datasæt [12] er bedre i at målrette

ABL1

-afhængig cellevækst end inhibitorer med ABL1 aktivitet alene. Dårlig ABL2 affinitet betyder bindende K

d forskelle mellem 4 og 26 gange i forhold til ABL1. Lige affinitet betyder bindende K

d forskelle mellem 0,5 og 4 gange.

Diskussion

Udviklingen af ​​selektive kinase hæmmere har resulteret i en række banebrydende lægemidler til genetisk godt -defined patientpopulationer [2], [40]. For at støtte udviklingen af ​​den næste generation af målrettede kinase hæmmere, har vi foretaget en grundig analyse af den cellulære og biokemiske on target-effekten af ​​alle kinase hæmmere i klinisk brug (Nov. 2013), ved parallel profilering af alle forbindelser på et panel af fyrre-fire cellelinjer og en stor kinaseassay panel (figur 2 og 3).

først analyse af vores data viser, at der er potentiale for nye anvendelser af godkendte målrettede kinase inhibitorer (Tal S4 og S5). Vi opdagede nye lægemiddelfølsomhed markører for MEK og EGFR-hæmmere. MEK-inhibitorer var 12 til 37 gange mere aktive i celler indeholdende muterede

CTNNB1

(figur 4A). Selvom MEK-inhibitorer blev inkluderet i cellen panel profilering undersøgelser af Sanger Centre [4] og de overordnede Institute [5], sammenslutningen af ​​MEK hæmning og

CTNNB1

blev ikke observeret i disse undersøgelser. [54].