PLoS ONE: Lamin A /C er en risiko Biomarkør i kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

A-type laminer er typen V mellemliggende endeløse proteiner kodet af genet

LMNA

. Mutationer i

LMNA

giver anledning til diverse degenerative sygdomme relateret til tidlig ældning. A-type laminer også påvirke aktiviteten af ​​retinoblastomproteinet (pRb) og onkogener sådan β-catenin. Derfor er det blevet spekuleret på, at ekspressionen af ​​A-type laminer også kan påvirke tumor progression.

Metode /vigtigste resultater

Et arkiv af kolorektal cancer (CRC) og normal colon væv blev screenet for ekspressionen af ​​A-type laminer. Vi brugte den proportionale hazard ratio (HR) metode Cox til at undersøge patientens overlevelse. Brug af CRC cellelinier undersøgte vi virkningerne af lamin A-ekspression på andre gener ved RT-PCR; på cellevækst ved FACS-analyse; og på invasivitet ved cellemigration assays og siRNA knockdown af målrettede gener. Vi fandt, at lamin A udtrykkes i colon stamceller, og at patienter med A-type Lamin-udtrykkende tumorer har betydeligt dårligere prognose end patienter med A-type Lamin negative tumorer (HR = 1,85,

s

= 0,005) . For at forstå dette resultat, vi etableret en model baseret på ekspressionen af ​​GFP-lamin A i CRC celler. Vi fandt, at ekspressionen af ​​GFP-lamin A i disse celler ikke påvirkede celledeling men fremmer i høj grad øget celle motilitet og invasionsevne. Årsagen til denne forøgede invasionsevne var at ekspression af lamin A fremmet opregulering af actin bundling protein T-plastin, hvilket fører til nedregulering af celleadhæsionsmolekyle E-cadherin.

Konklusioner

Ekspression af a-type laminer øger risikoen for at dø af CRC fordi dets tilstedeværelse medfører øget invasionsevne og potentielt en mere stamcelle-lignende fænotype. Denne rapport direkte links A-type lamin udtryk for tumor progression og hæver profil

LMNA

fra en impliceret i flere, men sjældne genetiske forhold til et gen involveret i en af ​​de hyppigste sygdomme i den vestlige verden.

Henvisning: Willis ND, Cox TR, Rahman-Casañs SF, Smits K, Przyborski SA, van den Brandt P, et al. (2008) Lamin A /C er en risiko Biomarkør i kolorektal cancer. PLoS ONE 3 (8): e2988. doi: 10,1371 /journal.pone.0002988

Redaktør: Kevin G. Hardwick, University of Edinburgh, England

Modtaget: May 6, 2008; Accepteret: 17 Jul 2008; Udgivet: 20 August, 2008

Copyright: © 2008 Willis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: National Health. service Forskning og Udviklingsfond, Association for International Cancer Research, EU rammeprogram 6

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

laminer a og C er type V mellemliggende endeløse proteiner, der danner en del af en filamentøs netværk betegnet den nukleare lag foring den indre nukleare membran (INM) [1]. A-type laminer er alternativt splejsede produkter af

LMNA

gen, som er blevet kortlagt til kromosom 1q21.3 [2]. Mutationer i dette gen er den underliggende årsag til tolv forskellige genetiske sygdomme, der er kollektivt benævnes laminopathies [3]. Laminopathies er alle degenerative sygdomme, der hovedsagelig påvirker væv af mesenchymal oprindelse [3]. Mulige mekanismer bag laminopathies er blevet intensivt undersøgt i løbet af de sidste syv år, og det har ført til den konklusion, at A-type laminer bidrager til celle overlevelse i to forskellige måder. For det første A-type laminer interagerer med vigtige cytoskelet linker proteiner betegnet nesprins via SUN domæne proteiner, der forbinder INM til den ydre kernemembranen (onm) via lumen [4], [5]. De nesprins gengæld anker elementer af cytoskelettet til onm [6] – [9], hvorved hardwiring cytoskelettet til den nukleare lag og tilvejebringe en indretning til at transducere mekanisk spænding sensing fra plasmamembranen til kernen [10], [11 ]. For det andet er A-type laminer interagerer med en række bindingspartnere i kernen, som igen interagerer med og påvirke aktiviteten af ​​vigtige vækstregulatorer. Af proteinerne, at A-type laminer interagerer med, bedst kendetegnet er de såkaldte LEM domæne proteiner [12], herunder integrerede membranproteiner emerin [13], [14] og MAN1 [15], samt nucleoskeleton protein LAP2α [16]. En sammensat af A-type laminer og emerin er for nylig blevet rapporteret at regulere den nukleare akkumulering af aktiv β-catenin og tab af emerin funktion fører til ureguleret β-catenin signalering og auto-stimulerende vækst i fibroblaster [17]. Tilsvarende er et kompleks af MAN1 og A-type laminer blevet vist at vekselvirke med receptoren reguleret SMAD (rSMAD) og til at antagonisere TGF-β-signalering ved at hæmme rSMAD på INM [18], [19]. Endelig et kompleks af LAP2α og A-type laminer binder til og bindsler phosphorylerede former af vækst suppressor pRb i kernen [20]. LAP2α og A-type laminer begge deltager i Rb afhængig E2F undertrykkelse [21] og tab af LAP2α eller A-type laminer i fibroblaster resulterer i accelereret S-fasen indrejse, gennem tab af pRb aktivitet [21], [22].

i betragtning af betydningen af ​​A-type laminer og deres bindende partnere til regulering af vækst veje, er det blevet spekuleret på, at disse laminer kan være knyttet til tumor progression [23]. Tidligere undersøgelser har rapporteret differentieret ekspression af A-type laminer i tumorvæv og har knyttet fraværet af A-type laminer til øget proliferation i tumoren. Men de har undladt at sammenkæde ændringer i ekspression til patient prognosticering eller direkte til tumorprogression [24]. Vi besluttede derfor at undersøge, hvordan ekspressionen af ​​A-type laminer kunne påvirke både progression og resultater af en fælles tumor. For at gøre dette har vi screenet en meget stort arkiv af CRC væv knyttet til en omfattende patient database [25]. Uventet fandt vi, at ekspression af A-type laminer inden for en tumor var en yderst signifikant risiko indikator for tumor mortalitet. I downstream undersøgelser fandt vi, at ekspression af lamin A i CRC cellelinier fremmes invasionsevne via opreguleret ekspression af actin-bundling protein T-plastin, som igen giver anledning til nedreguleret ekspression af celleadhæsionsmolekyle E-cadherin . Vi konkluderer, at ekspressionen af ​​A-type laminer i CRC fremmer tumorindtrængen gennem reorganisering af actincytoskelettet.

Resultater

Lamin A er en voksen stamcelle biomarkør i colon krypter

Før undersøge, om a-type laminer indflydelse tumorprogression, vurderede vi fordelingen af ​​a-type laminer i normal colon mucosa ved farvning af vævssnit med et monoklonalt antistof specifikt for disse proteiner. Som forventet [26], A-type laminer blev højt udtrykt i de funktionelt differentierede epiteliale lag og blev også kraftigt udtrykt i omgivende stromale væv og underliggende muskel. Omvendt A-type lamin ekspression var meget svag eller fraværende fra størstedelen af ​​celler i de colonic krypter. Men A-type lamin ekspression var høj i cirka fem til ti celler ved basis af krypterne (figur 1A, pile). De positivt farvede celler i krypterne var meget ens i antal og indtog en position svarende til den, der forstås generelt colon epitel stamcelle niche [27], [28]. For yderligere at undersøge identiteten af ​​disse A-type Lamin positive celler, blev serielle snit farvet med antistoffer mod laminer A C eller spredning biomarkør PCNA. Cellerne i krypterne, der farves positivt for PCNA var negative for A-type laminer, mens de celler, der var negative for PCNA var positive for A-type laminer (figur 1B), hvilket indebærer, at det lille antal A-type lamin positive basal krypt celler kunne faktisk blive postuleret, at stamceller. Vi fandt også, at mens antistoffer, der specifikt detekteret lamin A gjorde plette den foreslåede stamcelle niche (men ikke celler i det tilstødende transit forstærkende zone), blev lamin C ikke påvist i hverken stamcelle niche eller transit forstærker celler, men blev udtrykt i differentierede epitelceller og underliggende muscularis (fig S1). Således ekspression af lamin A i fravær af lamin C synes at definere en gruppe af celler i det basale region af colon krypt, svarende til et areal postuleret, at stamceller niche. Salg

(A) Tynde snit af formalinfikserede, voks indlejrede prøver af normal colon blev farvet efter varme medieret antigen-genvinding med et monoklonalt antistof JoL2 mod laminer A /C. Snit blev let modfarvet med Mayers Haemalum. Pilespidser angiver differentierede epitelceller mens pile angiver den forventede placering af stamceller niche i bunden af ​​krypten. Scale barer = 150 um (venstre panel) 50 um (højre paneler). (B) Serielle sektioner af normal colon blev farvet med antistoffer mod enten laminer A /C (JoL2) eller PCNA (PC10) og forarbejdet som beskrevet ovenfor. Pile angiver langsomt delende celler ved basis af krypterne, som pletten positivt med JoL2 men negativt med PC10. Scale barer = 150 um.

Angivelse af A-type laminer er en fare indikator i CRC

Holland Kohorte for kost og kræft [29] er en prospektiv kohorteundersøgelse. I første omgang blev vævsprøver fra 819 patienter anmodet 54 patologi laboratorier i hele Holland. Incident tilfælde omfattede de patienter udvikler tarmkræft mellem 1989 og 1993. Tumor materialet ikke var tilgængelig for 5% af tilfældene, og af de resterende 775 ledige vævsprøver, 737 indeholdt tilstrækkelige tumor materiale til immunhistokemisk analyse. Brug standard parametre for at teste på signifikansniveau 5% og med en effekt 90%, vil den mindste befolkningens størrelse kræves for at trygt detektere små hazard ratio være 516, og dermed var det sikkert at antage, at prøvens størrelse var stor nok til at producere statistisk signifikans .

immunhistokemisk farvning for at detektere ekspressionen af ​​laminer A /C efter antigen hentning blev udført på alle tilgængelige prøver. I alle afsnit det stromale væv omkring kræft var altid stærkt positiv for laminer A /C giver en intern positiv kontrol. Brug farvning af stromale væv som et kriterium for vellykket antigen hentning, 673 (91%) af prøverne var til rådighed til scoring. Vi fandt, at mens der var nogen variation i intensiteten af ​​den samlede farvning, nuklear lamin A /C ekspression i tumoren kan let klassificeres som enten til stede (Figur 2E-H) eller fraværende (figur 2A-D) fra kernen. Det blev også bemærket, at i et lille antal tilfælde, der var sporadisk cytoplasmatisk farvning og disse prøver blev scoret som negativ, når kernefarvning var til stede. Efter blind scoring af dias, hentning af patient og overlevelse oplysningerne fra databasen førte det endelige antal af unikke sager skal reduceres til 658 på grund af overlapning af patientadministrative koder, og yderligere 2 sager blev udelukket efter at være blevet klassificeret som signetring tumorer.

4 um formalin-fikseret, paraffinindlejrede sektioner fra 656 uafhængige menneskelige kolorektale adenokarcinomer blev taget fra patienter, der deltog i Holland Kohorte for kost og kræft. Vævssnit blev underkastet immunhistokemisk under anvendelse af JoL2 muse monoklonalt anti-humant lamin A /C-antistof før chromogen visualisering og lys kontrastfarvning med Mayers Haemalum at differentiere kerner. A-D viser positivt farvning stromale (S) væv, der omgiver negativt farvning tumor (T) væv. (A) Moderat godt differentieret stadium I adenocarcinom; (B) Moderat godt differentieret stadie II adenocarcinom; (C) Moderat godt differentieret fase III adenocarcinom; (D) Moderat godt differentieret stadie IV adenocarcinom. E-H viser positivt farvning stromale (S) væv, der omgiver positivt farvning tumor (T) væv. (E) Moderat godt differentieret stadium I adenocarcinom; (F) Moderat godt differentieret stadie II adenocarcinom; (G) Moderat godt differentieret fase III adenocarcinom; (H) Moderat godt differentieret stadie IV adenocarcinom. Scale barer = 30 um.

Under opfølgningsperioden, 246 patienter døde, med 163 af disse patienter dør som følge af CRC. Af de 656 ledige prøver immunhistokemisk vurderede, blev nuklear lamin A /C-ekspression sig at være positiv i 463 (70%) patienter og negativ i 193 (30%) patienter. Inden prøven gruppen af ​​patienter, der døde af CRC relaterede årsager inden for studiet periode (ti år), 127 scoret positiv for laminer A /C, mens 36 scoret negativt. Brug af Cox proportional hazard beregninger [30], fandt vi, at patienter, der udtrykker laminer A /C inden for tumoren var næsten dobbelt så stor risiko for at dø (Hazard ratio [HR] 1,85; 95% konfidensinterval [CI] 1,16-2,97) i CRC relateret årsager sammenlignet med clinicopathogically identiske patienter, der var negative for laminer A /C (

s

= 0,005) (figur 3). Således udtryk for lamin A /C i en tumor var stærkt korreleret med CRC relaterede dødsfald.

Samlet kumulative fare analyse for tilstedeværelse af lamin A /C udtryk og kolorektal cancer relaterede dødelighed for trin I-III patienter i Holland kohorte Undersøgelse om kost og kræft. Relativ hazard ratio (HR) = 1,85 (95% CI = 1,16-2,97),

s

= 0,005 (Korrigeret for køn og alder ved diagnose).

Angivelse af lamin A i CRC cellelinjer fremmer øget invasionsevne

fund, at ekspressionen af ​​lamin A /C i patientens tumorer er tæt korreleret med CRC dødelighed var uventet og til en vis grad counter intuitiv. Derfor, for at forstå, hvorfor ekspression af laminer A /C øger risikoen for dødsfald i CRC, opnåede vi en række CRC cellelinjer og oprindeligt vurderet dem for lamin A /C status ved immunblotting. I én pre-metastatisk cellelinie, SW480, lamin A var næsten upåviselig (fig S2A, B), mens niveauer af ekspression af laminer B

1, B

2 og C svarede til andre CRC-cellelinier (f.eks HT29 ). SW480 blev derfor udvalgt til undersøgelse. At bestemme, hvordan ekspression af lamin A kan påvirke SW480 blev kulturer stabilt transficeret med enten GFP eller et GFP-lamin A konstrukt. Efter stabil transfektion med GFP-lamin A moderate mængder af både endogen lamin A samt fusionsproteinet blev påvist, hvorimod i GFP transficerede kulturer, lamin A forblev fraværende (fig S2C, D). Morfologien af ​​cellerne i GFP og GFP-Lamin en transficeret kulturer var også forskellige. Morfologien af ​​celler i GFP transficerede kulturer (SW480 /CNTL) kunne skelnes fra ikke-transfekterede kulturer (SW480), med mange celler, som var stærkt fladtrykte eller voksende oven på hinanden. I modsætning hertil i GFP-lamin A transficerede kulturer (SW480 /lama), celler havde en mere spindel udseende og voksede som et monolag ved lav celletæthed (figur 4A).

(A) Morfologien af ​​utransficerede SW480, SW480 /CNTL og SW480 /Lama blev sammenlignet ved fasekontrastmikroskopi. SW480 /CNTL og utransficerede celler viste en flad morfologi og flere lag vækst. Derimod ektopisk ekspression af GFP-lamin A (SW480 /Lama) syntes at inducere morfologiske ændringer, herunder udseendet af en spindel-lignende form og vækst som et monolag. Scale bar = 10 um. (B) Skrab sår blev foretaget i 100% sammenflydende kulturer af SW480 /CNTL eller SW480 /lama celler. Fasekontrast billeder blev taget hver to timer over en 12 timers periode fra identiske regioner. Scale bar = 200 um. (C) Såret størrelse i forhold til udgangspunktet sårstørrelse blev målt efter 12 timer i tre uafhængige forsøg og udtrykkes som en procentvis reduktion i sårstørrelse +/- standardafvigelse (s.d.). Cellemigrering ~seven gange hurtigere i SW480 /lama forhold til SW480 /CNTL kulturer, p 0,005. (D) cellecyklus egenskaber blev undersøgt under anvendelse af flowcytometri. Andelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen er givet som middelværdi ± standardafvigelse. af tre gentagelser. Der blev ikke påvist væsentlige forskelle i cellecyklus dynamikken mellem de to cellelinjer.

migrerende /metastatisk adfærd i kræftceller er typisk forbundet med fænotypiske ændringer [31]. For at undersøge om ændret cellemorfologi korreleret med ændret vandringsadfærd udførte vi cellemotilitet assays af kulturerne. Efter scratch såring, sårlukning var syv gange hurtigere i kulturer transficeret med GFP-lamin A sammenlignet med kulturer transficeret med GFP (figur 4B 0,005). (B) SW480 /Lama kulturer blev behandlet med scrambled siRNA eller siRNA specifikke for T-plastin. 108h efter behandling RNA blev ekstraheret og amplificeret ved RT-PCR under anvendelse af primere specifikke for T-plastin og E-cadherin. Et hundrede procent knockdown af T-plastin blev ledsaget af re-ekspressionen af ​​E-cadherin udskrifter. (C, D) Alternativt scratch sårdannelse blev udført på sammenflydende kulturer 108h efter siRNA behandling og sårlukning blev målt som beskrevet i figur 4B, C. Cellemigrering 2 fold hurtigere i kulturer behandlet med scrambled siRNA sammenlignet med kulturer behandlet med Sit-plastin (

s

0,05). Scale bar = 200 um.

Diskussion

I dette papir, vi indberetter to nye og uventede resultater. For det første, lamin A, men ikke lamin C en potentiel biomarkør for stamcelle niche i colon krypten og for det andet, er udtryk for lamin A /C i CRC væv stærkt korreleret med CRC dødelighed og derfor lamin A /C repræsenterer en ny og vigtig prognostisk biomarkør i CRC.

placeringen af ​​stamceller niche i tyktarmen er blevet ekstrapoleret fra celle kinetiske og radioaktiv studier. Ved radiomærkning S-fase kryptceller med tritieret thymidin, har den gennemsnitlige migration hastighed af celler i forhold til deres celle position blevet målt. Ved hjælp af denne metode, oprindelsen af ​​migration og ved ekstrapolation, har stamcelle niche blevet forudsagt til at opholde sig i bunden af ​​krypten [35]. Antallet af stamceller besætter denne niche nærmer sig mellem 9:55 celler [36]. For nylig ekspression af Wnt responselementet Lgr5 er blevet vist at definere colon stamceller og er blevet anvendt til at bekræfte, at stamcellerne indtager en niche i bunden af ​​krypterne [27]. Celler af et tilsvarende antal, og besætter netop denne niche let farves med antistoffer afsløre laminer A /C eller lamin A, men er ikke farves med antistoffer specifikt påviser lamin C. I modsætning hertil i celler besætter transit forstærkende zone, udtryk for både lamin A og lamin C er fraværende. Som forventet [26], [37], [38], begge laminer er let påvises i funktionel differentieret epithel på tyktarmens slimhinde. Overensstemmelse med den forestilling, at lamin A er en potentiel biomarkør for colon stamceller, cellerne i bunden af ​​krypten som er positive for lamin A, er generelt negativ for DNA-replikation protein PCNA, som ville forventes i celler, der er for det meste hvilende [39]. Det lamin A er en potentiel biomarkør for voksne stamceller har vigtige generelle implikationer for sygdom. Laminer A /C er muteret i en lang række degenerative sygdomme, der er knyttet til tidlig ældning [3] og det er blevet foreslået at en årsag til degeneration i disse sygdomme er tab af voksne stamceller funktion [40]. Det lamin A udtryk bemærkes i den voksne stamceller niche af tyktarmen, giver direkte støtte til denne hypotese. Konstateringen af, at lamin A kan være en formodet stamcelle biomarkør har yderligere konsekvenser for vores opdagelse, at ekspressionen af ​​lamin A /C i CRC er tæt korreleret med en øget risiko for CRC-relateret dødelighed, da det kunne anses muligt, at kræftceller, der udtrykker Lamin a kan have en mere stamcelle-lignende fænotype og derfor i sagens natur mere farlig [41].

Vores konstateringen af, at ekspressionen af ​​a-type laminer i CRC væv er korreleret med en fordobling i CRC mortalitet sammenlignet med fravær af a-type laminer, for første gang direkte forbinder disse proteiner til progression af en almindelig sygdom. Tidligere undersøgelser har beskrevet ændret ekspression af A-type laminer i en række af cancere, herunder cancere i huden, lungerne, lymfekar og blødt væv [24], [37], [42] – [44]. Ingen af ​​disse undersøgelser var i stand til at linke enten fravær eller nærvær af A-type laminer til tumorprogression, selvom mindst en undersøgelse [24] foreslog, at tab af ekspression af laminer A /C var korreleret med forbedret proliferationshastigheder i tumorer. Det andet problem med disse tidligere undersøgelser er, at et begrænset antal prøver var tilgængelige til analyse og dermed studere størrelser faldt under tærsklen for pålidelig statistisk analyse. I modsætning hertil er vores nuværende fund baseret på en tilstrækkelig stor nok kohorte til at tilbyde fuld tillid til de signifikansniveauer rapporteret.

Vores konklusion er til en vis grad counter intuitiv, idet ekspressionen af ​​A-type laminer i forskellige celler generelt forsinker celleproliferation [21], mens fravær af a-type laminer kan korreleres med en manglende undergå vækststandsning ved konfluens [22]. Derfor nulhypotesen anvendes ved begyndelsen af ​​undersøgelsen var, at fravær af A-type laminer ville være korreleret med forøget risiko for cancer-relaterede dødsfald. Brug model CRC cellelinjer kunne vi ikke finde mærkbare ændringer i hastigheden af ​​celleproliferation i celler, der udtrykker lamin A sammenlignet med celler af samme genetiske baggrund, der manglede udtryk for Lamin. Men vi registrerer markant forøgede invasive egenskaber, når vi sammenlignet lamin A udtrykker celler til celler, hvor ekspressionen af ​​lamin A er fraværende. De invasive egenskaber af disse celler opstår, fordi tilstedeværelsen af ​​lamin A forårsager en nedstrøms opregulering af T-plastin, hvilket igen fører til nedregulering af E-cadherin. Plastins er en nyligt beskrevet familie af actin-bundling proteiner, som har været impliceret i invasion /metastase [34]. I den samme cellelinie som anvendt i denne undersøgelse, har ekspression af L-plastin blevet rapporteret at føre til nedreguleret ekspression af E-cadherin og øget invasionsevne og er tæt korreleret med metastase [32]. Vores nuværende resultater er helt i overensstemmelse med den tidligere undersøgelse, men antyder, det første, at lamin A styrer denne vej og for det andet, kan der invasionsevne induceres ved ekspression af T-plastin gennem den samme mekanisme. Interessant vi også observeret, at endogen lamin A blev detekteret i SW480 celler efter stabil ekspression af GFP-lamin A, hvorimod A i nærvær af GFP alene lamin forblev fraværende. Det er velkendt, at A-type laminer er modtagelige for spaltning i den ikke-spiralformede linker 2 region [3]. Lamin A eksisterer i celler som enten parallelle dæmpere eller anti-parallelle tetramerer, hvori det N-terminale hoved domæne overlapper linkeren 2-region [45]. Da GFP-delen er placeret på N-terminalen, måske stort protein beskytter linker 2 mod proteolytisk nedbrydning og derfor stabiliserer både GFP-lamin A og endogent lamin A. Konsekvensen af ​​denne hypotese er, at fraværet af lamin A i SW480-cellelinier skyldes posttranslationel modifikation af proteinet.

Hvordan tilstedeværelsen af ​​lamin A påvirker ekspressionen af ​​en actin-bundling protein er genstand for downstream undersøgelser. Dog kan man forestille to adskilte mekanismer. Det har for nylig vist, at A-type laminer direkte indflydelse på organiseringen af ​​cytoskelettet, trækstyrke celler [46] og deres evne til at reagere på stress [10]. Dette opnås via LINC kompleks, som medierer associationer mellem nukleare lamina og cytoskelettet via nesprins [4]. Derfor én mulighed er, at tilstedeværelsen eller fraværet af lamin A i en cancercelle kan føre direkte til cytoskeletal reorganisering via en tilbagekoblingssløjfe, som registrerer trækstyrken af ​​cellen. Alternativt er lamin A vist sig at interagere direkte med en række transkriptionsfaktorer [17] og dens tilstedeværelse kan direkte påvirke ekspressionen af ​​T-plastin. Uanset hvad, er det fænotypiske udfald af denne omorganisering øget invasionsevne og formentlig øget metastatisk potentiale.

Som konklusion, foreslår vi, at den høje risiko for dødelighed fra CRC relaterede årsager hos patienter, der udviser A-type lamin udtryk inden for deres tumor opstår, fordi lamin a er en up-stream regulator af en sti forbinder actin dynamik til tab af celleadhæsion, hvilket fører til øget celle motilitet og dermed øget invasive potentiale tumoren. Denne fænotype kan igen være reflekterende af en mere stamcelle-lignende egenskab af cancere. Mens mutationer i laminer A /C er blevet impliceret i en lang række sjældne genetiske sygdomme [3], vores nuværende resultater for første gang link ekspression af disse proteiner med progression af en af ​​de hyppigste årsager til kræft-relaterede dødsfald i den vestlige verden.

Materialer og metoder

Immunhistokemi

Paraffinsnit (4 um) af normal colon mucosa og kolorektal adenocarcinom blev de-paraffinised og rehydreret i xylen og ethanol. For antigen hentning blev snit nedsænket i 3% H

2O

2 for at standse endogen peroxidaseaktivitet inden de inkuberet i 0,01 M citratpuffer (pH 6,0) i 20 minutter ved 90 ° C. Snit blev derefter blokeret med 5% normalt gedeserum efterfulgt af inkubering med enten JoL2, anti-lamin A /C mus mAb [47] [1:10], PC10, anti-PCNA muse mAb [1:100], RalC, anti -lamin C kanin polyklonale antistof [24] [1:100] eller 133A2, anti-lamin A muse-mAb [48] [1:100] natten over ved 4 ° C. Snit blev derefter inkuberet med biotinyleret gede anti-mus IgG fortyndet ved 1:400 i 45 minutter ved stuetemperatur. Standarden ABC-processen blev derefter udført i overensstemmelse med instruktioner fra Dako (DakoCytomation, Glostrup, Danmark). Diaminobenzidin blev brugt som en kromogen efterfulgt af lys kontrastfarvning med Mayers Haemalum.

Cell kultur

De humane præ-metastatiske kolon adenocarcinom cellelinjer HT29 og SW480 blev opnået fra European Collection of Cell Cultures, UK. HT29 blev dyrket i McCoys 5A-medium (Sigma, UK) suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og holdt i en befugtet miljø ved 37 ° C med 5% CO

2. SW480-celler og transficerede derivater blev dyrket i Leibovitz-15 (L-15) medium (Invitrogen, UK) suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og holdt i en befugtet miljø ved 37 ° C uden CO

2.

Stabil transfektion af GFP-reportere i SW480 colonadenocarcinom celler

SW480-celler blev transficeret med DNA-konstruktioner, der koder et fusionsprotein af EGFP-lamin a fuldlængde (gave fra Dr. M. Izumi, Institut for Fysisk og Chemical Research, Saitama, Japan) og EGFP.