PLoS ONE: Identifikation og validering af referencecentre Gener for RT-qPCR Studier af iltsvind i Pladecellekræft Livmoderhalskræft Patienter

Abstrakte

Hypoxi er en negativ faktor i livmoderhalskræft, og hypoxi-relateret genekspression kunne være en stærk biomarkør for at identificere de aggressive hypoxiske tumorer. Revers transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) er en værdifuld metode til genekspressionsstudier, men egnede referenceprodukter gener for data normalisering som er uafhængige af hypoxi status og kliniske parametre af cervikale tumorer mangler. I det foreliggende arbejde, vi havde til formål at identificere reference- gener for RT-qPCR studier af hypoxi i skællede livmoderhalskræft. Fra 422 kandidat reference- gener valgt fra litteraturen, vi brugte Illumina-array-baserede udtryk profiler til at identificere 182 gener ikke er berørt af iltsvind i livmoderhalskræft, dvs. gener reguleret af iltsvind i otte livmoderhalskræft cellelinjer eller korrelere med hypoxi-associerede dynamisk kontrast Enhanced magnetisk resonans parameter A

Brix i 42 patienter, blev ekskluderet. Blandt de 182 gener, ni kandidater (

CHCHD1

,

GNB2L1

,

IPO8

,

LASP1

,

RPL27A

,

RPS12

,

SOD1

,

SRSF9

,

TMBIM6

), som ikke var forbundet med tumor volumen, scene, lymfeknude involvering eller sygdomsprogression i array-data 150 patienter, blev udvalgt til yderligere afprøvning af RT-qPCR. geNorm og NormFinder analyser af RT-qPCR data fra 74 patienter identificeret

CHCHD1

,

SRSF9

og

TMBIM6

som den optimale sæt af reference- gener, med stabil ekspression både samlet og tværs patient undergrupper med forskellig hypoxi status (A

Brix) og kliniske parametre. Egnetheden af ​​de tre referenceår gener blev valideret i studier af hypoxi-inducerede gener

DDIT3

,

ERO1A

, og

STC2

. Efter normalisering, RT-qPCR data for disse gener viste en signifikant korrelation med Illumina ekspression (P 0,001, n = 74) og A

Brix (P 0,05, n = 32), og

STC2

data var forbundet med kliniske resultater, i overensstemmelse med Illumina data. Således

CHCHD1

,

SRSF9

og

TMBIM6

synes at være egnede referenceprodukter gener til at studere hypoxi-relateret genekspression i pladecellekræft livmoderhalskræft prøver ved RT-qPCR. Desuden

STC2

er en lovende prognostisk hypoxi biomarkør i livmoderhalskræft

Henvisning:. Fjeldbo CS, Aarnes EK, Malinen E, Kristensen GB, Lyng H (2016) Identifikation og validering af referencecentre Gener for RT-qPCR Studier af iltsvind i Pladecellekræft livmoderhalskræft Patienter. PLoS ONE 11 (5): e0156259. doi: 10,1371 /journal.pone.0156259

Redaktør: Christian Schönbach, Nazarbayev University, Kasakhstan

Modtaget: November 23, 2015; Accepteret: 11 maj 2016; Udgivet: 31. maj 2016

Copyright: © 2016 Fjeldbo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Alle Illumina genekspression filer er tilgængelige fra GEO-databasen (GSE75034)

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Norges Forskningsråd, Grant nummer 226.120 /O30, (https://www.forskningsradet.no /da /Home_page /1177315753906). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tumor hypoxi er en vigtig faktor, der fører til strålebehandling modstand, metastaser og dårlig prognose for mange maligne sygdomme, herunder livmoderhalskræft [1-5]. Til måling hypoxi-relateret genekspression variationer i patientprøver, revers transkription kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) er en værdifuld metode på grund af sin høje følsomhed, fleksibilitet, lave omkostninger og brugervenlighed [6-8]. I RT-qPCR analyse, er det vigtigt at vælge optimale referencepunkter gener for data normalisering for at fjerne ikke-biologisk, eksperimentelt induceret variation fra dataene. For nøjagtig og pålidelig normalisering er flere referencepunkter gener anbefales [6,7,9]. Bestemmelse af reference- gener for kliniske studier er særligt udfordrende, fordi stabiliteten af ​​de gener, skal efterprøves i væv under undersøgelse og på tværs af tumor fænotyper og kliniske parametre.

Tidligere arbejde på reference- gener i livmoderhalsen har fokuseret på forskellige stadier af livmoderhalskræft carcinogenese ved at evaluere kandidatgener tværs humant papillomvirus (HPV) negative og positive læsioner [10], og på tværs af normale, forstadier og kræft prøver [11-13]. Så vidt vi ved, ikke er blevet indberettet egnede referenceprodukter gener til at studere hypoxi-associeret genekspression i livmoderhalskræft biopsier. Mange kandidater er blevet foreslået til dette formål fra eksperimentelle undersøgelser, hvor cellelinjer dyrkes under lave iltkoncentrationer [9,14-17], men kun én undersøgelse om hoved- og halscancer har udnyttet den hypoxi status af kliniske prøver i valideringen af ​​en sådan ansøgere [18]. kræves Tumor-site specifik evaluering [9,15], og bør omfatte associationer til kliniske funktioner og resultat i tillæg til hypoxi status.

De fleste undersøgelser søger efter reference- gener starter med et begrænset panel af omkring 8-25 kandidater udvalgt på basis af gener, der almindeligvis anvendes i litteraturen, som ikke nødvendigvis er de mest stabilt udtrykte gener. Ved hjælp af hele genomet udtryk data for en indledende vurdering af kandidaterne kan være nyttige til at identificere de mest lovende panel af gener til at teste i en RT-qPCR assay [19-24]. I nærværende undersøgelse blev denne fremgangsmåde, der anvendes til at identificere egnede referenceprodukter gener for hypoxi studier i livmoderhalskræft biopsier. En grundig gennemgang af litteraturen identificerede 422 potentielle reference- gener, hvoraf 410 kandidater var til stede i vores datasæt og blev udsat for en indledende vurdering, hjælp genekspression profiler af 150 livmoderhalskræft kræftpatienter og otte livmoderhalskræft cellelinjer. Ni gener, der ikke er forbundet med hypoxi eller kliniske parametre, blev yderligere bedømt med RT-qPCR, og tre af dem blev valgt som den optimale sæt referencestoffer gener. Egnethed reference- gener for data normalisering blev bekræftet i undersøgelser af tre kendte hypoxi-inducerede gener i relation til tumor hypoxi status og kliniske resultat.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af Det regionale Udvalg for medicin og sundhed Etik i det sydøstlige Norge (REC S-01129), og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Patient kohorter og tumor prøver

i alt 160 patienter med lokalt fremskreden planocellulært karcinom i livmoderhalsen, prospektivt rekrutteret til vores kemostråleterapi protokol på den norske Radium Hospital 2001-2012, blev inkluderet (tabel 1). Illumina genekspressionsprofiler eksisteret i 150 patienter (Illumina kohorte, tabel 1) og blev anvendt til at vælge kandidat reference- gener til testning med RT-qPCR (figur 1). For 42 af disse patienter, at hypoxi-associerede dynamisk kontrast forbedret (DCE) -magnetic resonans (MR) billeddannelse parameter A

Brix [25] var til rådighed og bruges som målestok for tumor hypoxi status. Ti uafhængige patienter (RT-qPCR kohorte 1) blev anvendt til præ-evaluering af ni kandidatgener. Desuden 74 af de 150 patienter i Illumina kohorten (RT-qPCR kohorte 2) blev anvendt til yderligere evaluering og validering af kandidater. Derudover blev 22 biopsier fra otte uafhængige patienter (2-4 biopsier fra hver patient) anvendes til at vurdere intra-tumor heterogenitet (heterogenitet kohorte).

Tumorvolumen og tilstedeværelse af patologisk lymfe knuder er vurderet ud fra forbehandling MR-billeder. Et til fire tumorbiopsier (ca. 5 × 5 × 5 mm) blev taget ved diagnose, straks lynfrosset og opbevaret ved -80 ° C. Alle patienter fik ekstern stråling på 50 Gy til den primære tumor og valgfrie områder, 45 Gy til de resterende bækkenet, og yderligere 14 Gy til patologiske lymfeknuder. Dette blev efterfulgt af brachyterapi af 25. Gy. Samtidig cisplatin (40 mg /m

2) blev givet ugentligt i maksimalt 6 kurser i henhold til tolerance. Patienterne blev fulgt op ifølge standardprocedure som beskrevet [25].

Cellekultur

Otte humane cervikale cancercellelinier fra American Type Culture Collection blev anvendt til at vurdere hypoxi-responsive gener ; HeLa, SW756, C-33 A, C-4I, ME-180, HT-3, SiHa og CaSki. De cellelinjer blev bekræftet af STR /DNA-profilering ved hjælp PowerPlex 21 (Promega, Madison, WI) ved Eurofins Genomics (Ebersberg, Tyskland). Cellerne blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 inkubator i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med GlutaMAX (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) suppleret med 100 U /ml penicillin /streptomycin (Sigma , St. Louis, MO) og 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco). Celler blev rutinemæssigt testet for

Mycoplasma

infektion. Celler blev dyrket i 24 timer i 10 cm plastskåle (1-1,8 x 10

6 celler for at opnå ~ 4 x 10

6 celler efter 48 timers inkubation) før udsættelse for hypoxiske (0,2% O

2, 5% CO

2) eller normoxisk (95% luft, 5% CO

2) betingelser for 24 timer ved 37 ° C. En Invivo2200 kammer (Ruskinn Technology Ltd., Bridgend, UK) blev anvendt til hypoxi behandling.

genanalyse

RNA isolation.

Totalt RNA blev isoleret fra celle linjer ved hjælp RNeasy MINIKIT (Qiagen, Germantown, MD) og fra frosne prøver ved hjælp Trizol reagens (Life Technologies) (Illumina kohorte, RT-qPCR kohorte 2) eller miRNeasy MINIKIT (Qiagen) (RT-qPCR kohorte 1, heterogenitet kohorte). Alle kliniske prøver havde mere end 50% af tumorcellerne i hematoxylin og eosin-farvede snit, der stammer fra den centrale del af biopsi. Bortset fra heterogenitet kohorten blev RNA fra forskellige biopsier af samme tumor poolet og RNA-koncentrationen blev målt under anvendelse af et NanoDrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA). RNA integritet blev bekræftet ved Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Alle prøver havde en RNA integritet nummer (RIN) i intervallet 3,6-9,0 med en median RIN på 7,1.

genekspression ved Illumina perle arrays.

For hele genomet genekspression profilering, Illumina 48K perle arrays med ca. 48000 udskrifter blev brugt; HumanWG-6 v3 (patienter, cellelinier) og HumanHT-12 V4 (cellelinier) (Illumina Inc., San Diego, CA). De patientdata er en del af de data, der benyttes i tidligere arbejde [25]. cRNA blev syntetiseret, mærket og hybridiseret til arrayene. Signal udvinding og fraktil normalisering blev udført ved hjælp af den software, der leveres af fabrikanten (Illumina Inc.), og log2-transformerede data blev anvendt i analyserne. Dataene blev deponeret i genekspression omnibus (GEO) database (GSE75034).

genekspression ved RT-qPCR.

For RT-qPCR analyser, den 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) blev anvendt, og amplifikationsprodukterne kurverne blev analyseret under anvendelse af SDS Software v2.3 (Applied Biosystems). DNA-free

™ Kit (# AM1906, Ambion, Austin, TX) blev anvendt til at fjerne genomisk DNA, ifølge producentens beskrivelse. Omvendt transskription blev udført af High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems), som omfatter tilfældige primere, brug af 2000 ng DNase-behandlet RNA i en 20 pi reaktion. 1 pi cDNA blev amplificeret under anvendelse af TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x) og Custom TaqMan Array 96-Well Fast Plader med tørrede-down TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) eller enkelt-rør TaqMan assays og 96-brønds Fast plader . Termocycling parametre var som beskrevet i Custom Array protokollen, eller for enkelt-rør assays: 20 s ved 95 ° C (enzymaktivering), 40 varmecykler ved 1 s ved 95 ° C (denaturering) og 20 s ved 60 ° C ( annealing og udvidelse). TaqMan assays for kandidat reference- gener og tre hypoxi-inducerede gener vurderet i denne undersøgelse er angivet i tabel 2. Kun pre-udviklede fortegnelserne TaqMan assays blev valgt. Til vurdering af TaqMan assays, blev størrelserne af PCR-produkter bestemmes ved gelelektroforese under anvendelse af en D1000 ScreenTape

® Station (Agilent Technologies). For de tre valgte referencestoffer gener (se nedenfor) og de tre hypoxi-inducerede gener blev PCR effektiviteter bestemt ud fra cDNA fortyndingskurver og viste lineære reaktionsprodukter effektivitet (S1 Fig).

Alle prøver blev kørt i to eksemplarer, og den gennemsnitlige kvantificering cyklus (C

q) for hver prøve blev anvendt i analyserne. Prøver med gennemsnitlig C

q 37 eller standardafvigelse 0,4 blev udelukket. Minus revers transkriptase kontroller blev testet for resterende genomisk DNA for alle TaqMan assays, og kontaminering blev evalueret ved ikke-template kontroller uden RNA ind i cDNA-syntese. Alle negative kontroller havde ubestemt C

q. Ekspressionsniveauet af et målgen blev analyseret under anvendelse af komparativ C

q-metoden [26], normalisere c

q-værdier af målgenet til en normaliseringsfaktor beregnet som gennemsnittet C

q- værdier af reference- gener; ΔC

q, gen = C

q, gene- (C

q,

CHCHD1

+ C

q,

SRSF9

+ C

q ,

TMBIM6

) /3 for referenceårene gener identificeret i denne undersøgelse (se nedenfor).

Statistik

geNorm [6] og NormFinder [7] algoritmer blev brugt at vurdere stabiliteten af ​​kandidat reference- gener. Den geNorm algoritme er baseret på princippet om, at udtrykket forholdet mellem to ideelle reference- gener er identisk i alle prøver. For hver kandidat, er en stabilitet foranstaltning M beregnet som gennemsnittet parvis variation af genet med alle andre kandidater; dvs. den gennemsnitlige standardafvigelse for log2-transformerede ekspressionssystemer forhold mellem generne. Generne med laveste M-værdier anses for at være mest stabilt. Generne er rangeret ved trinvis udelukkelse af de mindst stabile kandidat og fornyet beregning af M-værdier for de resterende gener udføres, indtil de to mest stabile gener starter. For at bestemme antallet af reference- gener til at omfatte for pålidelig normalisering, parvis variation mellem to sekventielle normaliseringsfaktorer (V

n /n + 1) blev beregnet for alle prøver, og cut-off værdi for optagelse af et ekstra gen var indstillet til 0,15 [6]. NormFinder er en ANOVA model tilgang, og blev brugt til beregning af den samlede variation af hver kandidat gen og dets variation på tværs af patientens undergrupper ved at tage hensyn til både inden for og mellem gruppe variationer. De estimerede variationer kombineres i en stabilitet værdi for hvert gen, hvor en lav værdi indikerer mere stabil ekspression [7].

Spearman rang korrelation blev anvendt til at estimere associationer mellem kontinuerlige variabler, Mann-Whitney U test blev anvendt til at sammenligne forskellene i genekspression niveauer mellem grupper og COX proportional hazard (PH) univariat analyse blev anvendt til at vurdere forholdet mellem kandidat referencenumre gener til kliniske resultater. Den kliniske endepunkt var progressionsfri overlevelse (PFS) for opfølgning indtil 5 år. PFS blev defineret som tiden fra diagnosen til sygdomsrelaterede død eller første tilfælde af tilbagefald. Dødsfald inden for 2 år efter optagelsen blev betragtet som sygdomsrelaterede medmindre en anden årsag blev dokumenteret. Patienterne blev censureret på deres sidste ansættelse eller 5 år, og status blev vurderet ved 3:e oktober 2014. En konkurrerende risiko model blev brugt til at beregne kumulative incidens af sygdomsprogression, med døden af ​​andre årsager end livmoderhalskræft som konkurrerende begivenhed. Elleve af de 160 patienter inkluderet døde af andre årsager uden at opleve recidiv under opfølgning. Siden omkring 1/3 af patienterne oplevede tilbagefald, blev kumulative incidens kurver sammenlignet mellem 1/3 af kohorten med den højeste genekspression og 2/3 med den laveste ekspression. Grays test blev anvendt til at vurdere forskelle mellem kurverne. Signifikansniveau var 5%, medmindre andet er angivet, og alle p-værdier var tosidet.

Alle analyser blev udført ved anvendelse af R [27] udgave 3.1.1. For geNorm analyser, den read.qPCR () og selectHKs () funktioner i ReadqPCR og NormqPCR pakker [28] blev anvendt. For NormFinder analyserer Normfinder () funktion, som Molekylær Diagnostisk Laboratorium, Institut for Molekylær Medicin, Århus Universitetshospital Skejby, blev Danmark anvendt, og de risikoanalyser konkurrerende blev udført med cuminc () funktionen i cmprsk pakke [29]. Salg

Resultater og diskussion

udvælgelse af kandidat reference- gener fra array-baserede udtryk profiler

for at identificere stabilt udtrykte gener i livmoderhalskræft prøver, udvælgelse af ansøgere var begrænset til gener der tidligere er blevet rapporteret som reference- gener i litteraturen [10,11,13,18,30-35], som nye referencepunkter kandidater baseret på metaanalyse af store microarray eller RNA-sekventering datasæt [19-23], eller til stede på TaqMan udtrykke humant Endogen styrepladen (Applied Biosystems). Dette resulterede i en liste med 422 forskellige gener, for hvilke 410 var til stede på Illumina vifte anvendt i den foreliggende undersøgelse (figur 1, S1 Table), repræsenteret ved 631 forskellige sonder.

De mest sandsynlige kandidater blandt de 410 gener blev identificeret ved anvendelse Illumina Array ekspressionssystemer profiler af 150 cervikale kræftpatienter og otte cervikale cancercellelinier dyrket under normoxi og hypoxi. Først blev kandidater udelukket på grundlag af deres tilknytning til en hypoxi respons i livmoderhalskræft eller med kliniske parametre i patientens kohorte. Gener for hvilken ekspression af mindst én probe i det kliniske datasæt korreleret med hypoxi-associerede DCE-MRI parameter A

Brix (n = 42) blev fjernet, samt gener, der var mere end 1,5 gange op- eller nedreguleret under hypoxi i mindst én af de cellelinier (S1 Table). Derudover blev kandidater viser en associering mellem deres ekspressionsniveauer og tumorvolumen, stadium, lymfeknude-status eller det kliniske resultat i 150 patienter (S1 Table) udelukket. De fjernede gener inkluderet

GAPDH

,

HMBS

,

EEF1A1

,

ACTB

,

PGK1

,

RPLP0

og

TBP

, der er blevet identificeret som relevante reference- gener i tidligere undersøgelser af livmoderhalskræft carcinogenese [10-13,36,37], og

B2M

,

HPRT1

,

RPL11

,

RPL37A

,

ACTR3

, og

NDFIP1

, som har vist sig at være egnet til hypoxi studier i hoved- og halscancer [18,30]. Helt, 99 forskellige gener, der er repræsenteret med 117 sonder forblev som reference- kandidater på dette tidspunkt. For at sikre påvisning af reference- gener i RT-qPCR assays, en yderligere udelukkelse af gener baseret på et meget lavt ekspressionsniveau (gennemsnitlig log2 ekspression af 150 patienter 7) blev udført, hvilket reducerer dette tal til 89 kandidater repræsenteret med 101 prober.

Ud over stabil ekspression, bør henvisningen genet ideelt have udskrift overflod ligner de gener under undersøgelse for at øge følsomheden for at detektere små genekspression ændringer [24]. Vi fandt, at kandidater med den laveste variationskoefficient (CV) generelt blev udtrykt ved høje niveauer, en observation også ses af andre [24], mens de fleste hypoxi-regulerede gener fra vores tidligere arbejde [25] havde et relativt lavt udtryk niveau ( data ikke vist). En endelig panel af gener, der skal evalueres ved hjælp af RT-qPCR blev derfor udtaget til forskellige ekspressionsniveauer Ud over at holde CV så lavt som muligt. Kandidater blev også valgt på en sådan måde, at de repræsenterede forskellige veje eller funktionelle grupper med henblik på at minimere risikoen for at vælge co-regulerede gener [6]. Endelig blev tilgængeligheden af ​​en egnet forbehandling designet og valideret TaqMan-assay anvendes som et udvælgelseskriterium. Panelet af ni kandidater, der skal testes i RT-qPCR assays er anført i tabel 1, og havde CV i området fra 0,01 til 0,09 og betyde log2 ekspressionsniveauer i området fra 7,4 til 14,0 i de kliniske datasæt. Blandt disse gener,

GNB2L1

tidligere har været anvendt som reference gen i hypoxi studier af hoved- og halscancer [18].

Pre-evaluering af 9 kandidat referencepunkter gener ved RT-qPCR

for at sikre, at kandidaterne kunne korrekt registreret i en TaqMan assay og muligvis yderligere at begrænse panelet, en præ-evaluering af de ni gener blev udført i 10 patienter (RT-qPCR kohorte 1, tabel 1, figur 1) . TaqMan assays blev først vurderet ved gelelektroforese af PCR-produkter fra en patient (Fig 2A). For alle assays blev et stærkt bånd af den forventede størrelse set. Men for

SOD1

, en ekstra svagere bånd af mindre størrelse, der kunne repræsentere primerdimerer også dukkede op, hvilket indikerer, at analysen ikke fungerer optimalt.

SOD1

blev derfor udelukket i de videre analyser.

(A) Gel elektroforese af PCR-produkter til ni kandidat reference- gener i en patient. Lavere (25 bp) og øvre (1500 bp) markører er vist i hver bane. Gene symboler er angivet. Figuren er et sammensat billede, hvor

CHCHD1

er fra et separat billede og stigen fra hvert billede vises. Lodrette linje viser beskæring af billedet eller forskellige billeder. (B) Box plots af det aritmetiske gennemsnit af dobbelte C

q-værdier for otte kandidat reference- gener i 10 patienter. Kasser angiver interkvartile område (IQR) med median som den sorte center bar. Extended lodrette bjælker repræsenterer 1,5 x IQR under den første kvartil og 1,5 x IQR over den tredje kvartil, og cirkler markerer mistænkes outliers. (C) geNorm analyse af otte kandidat reference- gener. Gennemsnitlig ekspression stabilitet (M) af de resterende kandidater efter trinvis fjernelse af de mindst stabile genet er vist. Den mindst stabile gen i hvert trin er angivet nedenfor. (D) Stabilitet værdi af hver af de otte kandidat reference- gener fra NormFinder analyse, hvor en lav værdi indikerer mere stabil ekspression.

De otte tilbageværende kandidater blev detekteret med C

q-værdier spænder fra 19,1 til 31,1, hvor

GNB2L1

og

TMBIM6

var den mest udbredte og

RPL27A

mindst rigelige udskrift (fig 2B). geNorm og NormFinder analyser blev udført for at rangere de gener, i henhold til den overordnede stabilitet tværs af de ti patienter (Fig 2C og 2D). Den gennemsnitlige udtryk stabilitet M fra geNorm analyse varierede fra 0,72 ved hjælp af alle otte gener til 0,4 for de to mest stabile kandidater (fig 2C). Rangeringen af ​​generne i NormFinder analysen var næsten identisk med geNorm ranking (Fig 2D). For en mere grundig stabilitet analyse, herunder vurdering af stabilitet i hele patientens undergrupper, og bestemmelse af det optimale antal referencepunkter gener til at omfatte til normalisering, de fem mest stabilt udtrykte gener som bestemt af de to metoder, dvs.

CHCHD1

,

GNB2L1

,

IPO8

,

SRSF9

og

TMBIM6

, blev undersøgt yderligere.

Bestemmelse af en RT-qPCR normalisering faktor

De fem tilbageværende kandidater blev vurderet ved RT-qPCR-analyse i 74 patienter (RT-qPCR kohorte 2, tabel 1, figur 1), hvilket resulterer i C

Q-værdier mellem 17,9 og 25,4 ( fig 3A). geNorm og NormFinder analyser viste lignende rangordning af de gener, i henhold til den stabilitet på tværs af patienter (Fig 3B og 3C). Fra geNorm analyse, den gennemsnitlige udtryk stabilitet M varierede fra 0,57 ved hjælp af alle fem gener til 0,45 ved hjælp af de to mest stabile kandidater.

(A) Box plots af det aritmetiske gennemsnit af dobbelte C

q-værdier i fem kandidat referencenumre gener i 74 patienter. Kasser angiver interkvartile område (IQR) med median som den sorte center bar. Udvidede lodrette streger repræsenterer 1,5 x IQR under den første kvartil og 1,5 x IQR over den tredje kvartil, og cirkler markerer mistænkes outliers. (B) geNorm analyse af fem kandidat reference- gener. Gennemsnitlig ekspression stabilitet (M) af de resterende kandidater efter trinvis fjernelse af de mindst stabile genet er vist. Den mindst stabile gen i hvert trin er angivet nedenfor. (C) Stabilitet værdi af hver af de fem kandidat reference- gener fra NormFinder analyse, hvor en lav værdi indikerer mere stabil ekspression. (D) geNorm parvis variation (V) analyse for at bestemme tilstrækkeligt antal referencepunkter gener i normaliseringsfaktor. Parvis variation for to sekventielle normaliseringsfaktorer (V

n /n + 1) fra de to mest stabile gener til alle fem gener. Den vandrette linje angiver afskæringsværdi (V = 0,15), hvor inddragelse af flere gener ikke har nogen væsentlig indvirkning på normalisering faktor.

For at evaluere tilstrækkeligt antal gener, der kræves for pålidelig normalisering blev en trinvis procedure anvendes ved at inkludere gener sekventielt ind i normalisering faktor ifølge deres voksende M-værdier, indtil der ikke væsentligt bidrag var opnået. Den parvise variation mellem de normaliseringsfaktorer med tre og fire gener var under cut-off-værdi (V

3/4 0,15), hvilket indikerer, at de tre kandidater med laveste M-værdi,

CHCHD1

,

SRSF9

og

TMBIM6

, er tilstrækkelige til normalisering (fig 3D). Disse kandidater blev også fundet at være de tre mest stabile gener i NormFinder analyse (fig 3C). Desuden har deres gennemsnitlige M-værdien var 0,49 (Fig 3B), og under intervallet 0,5-1 der bør kræves ved evaluering reference- gener i cancer biopsier [38].

Vi evalueres yderligere stabiliteten af fem kandidater på tværs af undergrupper med brug af NormFinder algoritme (Fig 4). I denne analyse,

CHCHD1

,

SRSF9

og

TMBIM6

også optrådt som de optimale referencepunkter gener. De var de mest stabile kandidater på tværs af patienter med lav og høj tumor stadie eller volumen og med og uden tilbagefald, og for patienter med og uden lymfeknude involvering på diagnosetidspunktet de tre kandidater var blandt de fire mest stabile gener. Desuden er der i analysen af ​​tumor hypoxi status,

CHCHD1

,

SRSF9

og

TMBIM6

var de mest stabile kandidater på tværs af patienter med høj og lav A

Brix ( fig 4). For yderligere at validere stabiliteten af ​​disse tre gener, geNorm analyse på RT-qPCR data fra normoxiske og hypoxiske prøver fra otte cervikale cancercellelinier blev udført. Den gennemsnitlige M-værdi for de tre gener var 0,79, hvilket indikerer stabil ekspression tværs normoxisk og hypoxiske dyrkningsbetingelser [38]. Således

CHCHD1

,

SRSF9

og

TMBIM6

syntes at være velegnet til beregning af en normalisering faktor og blev udvalgt til validering i studier af hypoxi-induceret genekspression (fig 1).

NormFinder analyser af stabiliteten af ​​fem kandidat reference- gener på tværs af patientens undergrupper. Undergrupperne vurderet, var: lav (n = 49) og høj (n = 25) tumor fase (FIGO 1B-2B vs. 3A-4A), med (n = 32) og uden (n = 42) lymfeknude (LN) inddragelse ved diagnose, nedenfor (n = 36) og ovenfor (n = 36) en median tumorvolumen på 44,6 cm

3, med (n = 32) eller uden (n = 42) behandling tilbagefald på fem år, og forskellige hypoxi tilstand repræsenteres af nedenfor (n = 16) og derover (n = 16) en median a

Brix.

Validering af

CHCHD1

,

SRSF9

og

TMBIM6

som reference- gener i hypoxi studier

RT-qPCR analyser blev udført for tre gener, som vi tidligere har rapporteret at blive induceret af hypoxi i livmoderhalskræft cellelinjer og i forbindelse med A

Brix i livmoderhalskræft [25], dvs.

DDIT3

,

ERO1A

og

STC2

. RT-qPCR kohorte 2 af 74 patienter, som vi havde Illumina udtryk data, blev udnyttet. Gelelektroforese af PCR-produkterne viste, at de TaqMan assays fungeret korrekt, generering af et enkelt specifikt produkt med den forventede størrelse for hvert af de tre gener (Fig 5A). Ekspressionsniveauerne af

DDIT3

,

ERO1A

og

STC2

blev beregnet ved at normalisere C-

q-værdier til den gennemsnitlige C

q-værdi på

CHCHD1

,

SRSF9

og

TMBIM

6. Den -ΔC

q-værdi viste sig at være stærkt korreleret med Illumina data for alle tre gener (P 0,001; ρ 0,78-0,83). Yderligere signifikante negative korrelationer mellem -ΔC

q og A

Brix blev fundet, efter aftale med de korrelationer opnået med Illumina data (tabel 3). De identificerede reference- gener synes derfor velegnet til måling af hypoxi-inducerede ændringer i livmoderhalskræft.

(A) Gel elektroforese af PCR-produkter til de tre hypoxi-inducerede gener

DDIT3

,

ERO1A

, og

STC2

. Lavere (25 bp) og øvre (1500 bp) markører er vist i hver bane. Figuren er afledt fra et billede, og lodrette linjer viser beskæring af billedet. Kumulativ forekomst af sygdomsprogression for 74 patienter inddelt i lav ( 67% percentil) og høj (≥ 67% percentil)

STC2

udtryk baseret på (B) Illumina udtryk data og (C) RT-qPCR data normaliseret med

CHCHD1

,

SRSF9

og

TMBIM

6 (-ΔC

q). 60 måneder gentagelse sandsynlighed, er P-værdier fra Grays test og antallet af patienter med risiko angivet. Død af andre årsager end livmoderhalskræft blev inkluderet som en konkurrerende begivenhed (n = 5). (D) Intra-tumor variation i

STC2

ekspressionsniveauerne målt ved RT-qPCR tværs otte uafhængige tumorer med 2-4 biopsier pr tumor, dvs. i alt 22 biopsier. Måling af

STC2

mislykkedes for en af ​​de biopsier for tumor 4.

STC2

data blev normaliseret med

CHCHD1

,

SRSF9

og

TMBIM

6. Prøverne blev klassificeret i en høj og lav ekspression gruppe ved hjælp af samme afskæringsværdi som i figur 5C (dvs. -ΔC

q = -4,46). Forskellige biopsier fra samme tumor er blevet plottet med samme farve for at lette fortolkningen af ​​figuren.

Da hypoxi er kendt for at være forbundet med aggressivitet i livmoderhalskræft [3-5] vi vurderet den prognostiske værdi af

DDIT3

,

ERO1A

og

STC2

udtryk i Illumina og RT-qPCR datasæt. Baseret på Illumina data fra 150 patienter, blev en statistisk signifikant øget risiko for sygdomsprogression fundet for patienter med den højeste udtryk for

DDIT3

eller

STC2

forhold til de andre (P = 0,047 og P = 0,015 henholdsvis Grays test, data ikke vist), mens

ERO1A

udtryk var ikke associeret med udfald (data ikke vist). I RT-qPCR kohorte 2 af 74 patienter, blev den stærkeste association til resultat fundet for

STC2

i begge datasæt, og for RT-qPCR data forholdet var statistisk signifikant (Fig 5B og 5C).