PLoS ONE: Androgen Signaling Fremmer Oversættelse af TMEFF2 i prostatacancerceller via phosphorylering af α-underenheden af ​​translation initiation Factor 2

Abstrakt

Den type jeg transmembranprotein med epidermal vækstfaktor og to follistatin motiver 2 (TMEFF2), udtrykkes primært i hjerne og prostata. Ekspression af TMEFF2 dereguleres i prostatacancer, hvilket antyder en rolle i denne sygdom, men den molekylære mekanisme (r) er involveret i denne effekt er ikke klare. Selvom androgener fremme

tmeff2

transskription, androgen levering til kastrerede dyr bærer CWR22 implanteret øger TMEFF2 protein niveauer i fravær af mRNA ændringer, hvilket tyder på, at

TMEFF2

kan også være post-transkriptionelt reguleret. Her viser vi, at oversættelsen af ​​

TMEFF2

reguleres af androgener. Tilsætning af fysiologiske koncentrationer af dihydrotestosteron (DHT) til prostatakræft-cellelinier øger translation af endogen

TMEFF2

eller transficeres

TMEFF2-Luciferase

fusioner, og denne virkning kræver tilstedeværelsen af ​​opstrøms åbne læserammer ( uORFs) i 5′-utranslaterede område (5′-UTR) af

TMEFF2

. Under anvendelse af kemisk og siRNA inhibering af androgen receptor (AR), viser vi, at androgen virkning på

TMEFF2

oversættelse medieres af AR. Vigtigere, DHT fremmer også phosphorylering af α subunit af translationsinitiering faktor 2 (eIF2α) i en AR-afhængig måde, parallelt med virkning på

TMEFF2

oversættelse. Desuden endoplasmatiske reticulum (ER) stress betingelser, der fremmer eIF2α fosforylering, også stimulere

TMEFF2

oversættelse. Disse resultater indikerer, at androgen signalering fremmer eIF2α phosphorylering og efterfølgende oversættelse af

TMEFF2

via en mekanisme, der kræver uORFs i 5′-UTR af

TMEFF2

Henvisning:. Overcash RF, Chappell VA, Green T, Geyer CB, Asch AS, Ruiz-Echevarría MJ (2013) Androgen Signaling Fremmer Oversættelse af

TMEFF2

i Prostata Cancer Cells via Phosphorylering af α subunit af Translation Indledning Factor 2. PLoS ONE 8 (2): e55257. doi: 10,1371 /journal.pone.0055257

Redaktør: Hari Koul, University of Colorado, USA

Modtaget: 23, 2012; Accepteret: December 27, 2012; Publiceret: 6 Feb 2013

Copyright: © 2013 Overcash et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af en bevilling fra National Cancer Institute (1R15CA155873). Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at ingen konkurrerende interesse eksisterer

Introduktion

Androgener signalering gennem AR spille en væsentlig rolle i den normale prostata udvikling og bidrage til udviklingen af ​​prostatacancer. Binding af androgener til AR fremmer en konformationel ændring, som i sidste ende fører til dens translokation til kernen og regulering af transkription af et bestemt sæt af androgen-responsive gener. Klinisk og eksperimentel dokumentation antyder, at prostatakræft progression sker gennem ændring af den normale androgen signalering, reducere specificiteten eller størrelsen af ​​AR ligand kræves for proliferation og overlevelse [1]. Vigtigere, seneste resultater viser, at funktionen af ​​AR er specifik for sygdommen fase udløser en anden genekspression program i androgen-afhængige sammenlignet med androgen-uafhængig prostatacancer [2]. Mens rolle AR signalering akse i transkriptionel regulering er veldokumenteret, er meget lidt kendt vedrørende dets rolle i translationsinitiering foreslået i tidlige undersøgelser [3], [4].

transmembranprotein med epidermal vækstfaktor og to follistatin motiver 2 (TMEFF2) er en enkelt pass transmembrane protein. TMEFF2 udtrykkes i embryoet [5], [6] og selektivt i den voksne hjerne og prostata [7] – [9]. En rolle for TMEFF2 i prostatacancer blev foreslået af undersøgelser, der antyder, at TMEFF2 ekspression er ændret på en signifikant fraktion af primære og metastatiske prostatatumorer [5] – [10]. Desuden har vi for nylig vist, at TMEFF2 interagerer med sarcosin dehydrogenase (SARDH), enzymet ansvarlig for omdannelsen af ​​sarcosin til glycin [11]. Vigtigere, sarcosin blev identificeret som en markør for prostatacancer progression i en storstilet skærm af metabolitter fra humane prostataprøver [12]. Øget plasma og urin sarcosin niveauer skelnes prostatakræft fra godartet prostata væv, og blev yderligere forhøjet i metastatisk cancer. Derudover blev sarcosin metabolisme og de involverede i det (dvs. SARDH) enzymer vist at virke som regulatorer af celleinvasion og metastase [12]. Derfor er interaktion af TMEFF2 med SARDH foreslår endvidere en rolle for TMEFF2 i prostatakræft progression. Faktisk har vi også fastslået, at TMEFF2 fungerer som en tumorsuppressor og at denne rolle korrelerer, i det mindste delvist, med dens evne til at interagere med SARDH og modulere cellulære niveauer af sarcosin [11] fuld længde.

i denne undersøgelse vi rapportere, at oversættelsen af ​​

TMEFF2

reguleres af androgener, og denne effekt kræver en funktionel AR. Resultater bruger xenograftmodeller og prostatakræft-cellelinier, der er etableret, at TMEFF2 udtryk ændrer sig som reaktion på androgener og /eller androgen-afhængige eller -uafhængige tilstand af cellerne [8], [10]. Som påvist ved Gery et al., [8] disse ændringer er delvis skyldes transskriptionel aktivering af

tmeff2

som reaktion på androgener. Men øget TMEFF2 protein niveauer i mangel af en tilsvarende stigning i mRNA-niveauer er observeret efter tilsætning af androgener til kastrerede dyr bærer CWR22 xenografter, tyder på, at

TMEFF2

kan også være post-transkriptionelt reguleret [10].

TMEFF2

mRNA har flere potentielle opstrøms åbne læserammer (uORFs) i dens leder region, og sekvensanalyse tyder på, at de er godt konserveret blandt pattedyr. Selvom kun til stede i 5-10% af de cellulære mRNA’er, uORFs er almindelige i de førende regioner af mRNA’er der koder oncoproteiner eller proteiner involveret i reguleringen af ​​cellevækst og differentiering, og de fungerer ved at modulere translation af disse essentielle gener [13]. Efter at være blevet oversat, uORFs generelt blokere oversættelse af de vigtigste nedstrøms kodende region ved at hæmme translation reinitiering på de vigtigste translationsinitieringscodon. Dog kan uORFs fremme selektiv translation af den nedstrøms kodende region under cellulært stress eller andre forhold, som forøger phosphorylering af α-underenheden af ​​det eukaryote translationsinitiering faktor 2 (eIF2α) [13].

eIF2 i sin GTP- bundet form er nødvendig for at udtage translationsinitieringskodonet. Phosphorylering af α-underenheden af ​​eIF2 ved Ser-51 (eIF2α-P) inhiberer udveksling af eIF2-BNP til eIF2-GTP, forhindrer anerkendelse af den initierende codon og faldende global translationsinitiering [14]. Men som nævnt ovenfor, uORF-holdige mRNA’er aktivt oversat under disse betingelser. To mekanismer er blevet foreslået for at forklare denne effekt. I den første, eksemplificeret ved

ATF4

mRNA, som indeholder to uORFs, oversættelse reinitiering på den inhiberende nedstrøms uORF bypasses under betingelser med eIF2α-P, på grund af det faktum, at de lavere niveauer af eIF2-GTP stigning den tid, der kræves for scanning ribosomer til at re-erhverve eIF2-GTP og reinitiere oversættelse [15]. I den anden ene, observeret i mRNA indeholder et enkelt uORF, scanning ribosomer omgå hæmmende uORF grund af den reducerede effektivitet i oversættelse ved initieringskodoner med en dårlig Kozak konsensus sekvens [16]. I begge tilfælde uORF bypass resulterer i et øget antal ribosomer startende omregnet til initieringskodonen af ​​de vigtigste kodende sekvens, og derved øge syntesen af ​​det specifikke protein.

I denne undersøgelse viser vi, at

TMEFF2

oversættelse er reguleret af androgener. Androgen-regulering af

TMEFF2

oversættelse kræver tilstedeværelse af uORFs i lederen region af

TMEFF2

mRNA og er afhængig af eIF2α-P. Endvidere er denne effekt medieret af AR, da det ikke observeres når Ar niveauer reduceres med RNAi eller AR antagonist bicalutamid, eller i cellelinjer, der ikke udtrykker det. Disse resultater understøtter en ny reguleringsmekanisme af androgen signalering, hvor uORF-holdige mRNA’er translationelt aktiveres som reaktion på eIF2α-P.

Materialer og metoder

Cell Culture

LNCaP og 22RV1 celler blev opnået fra American Type Culture Collection og blev opretholdt i RPMI 1640 (Gibco) suppleret med enten 10% FBS (Gemini Bio-produkter) eller 10% trækul-strippet serum (Atlanta Biologicals). PC3-celler (ATCC) blev opnået fra Dr. D. Terrian (East Carolina University) og blev også opretholdt i RPMI 1640. Mouse embryonale fibroblast udtrykker vildtype og mutant (Ser51 til Ala) eIF2 blev opnået fra Dr. R. Kaufman ( Sanford /Burnham Medical Research Institute) og er blevet beskrevet tidligere [17]. Disse celler blev dyrket i DMEM. Dihydrotestosteron, bicalutamid og actinomycin D blev købt fra Sigma-Aldrich.

konstruerer og Reporter Analyser

PCR mutagenese blev anvendt til at mutere de startkodoner af uORFs fra Aug til Gug i

TMEFF2

5 ‘UTR. Primere anvendt til mutagenese er angivet i tabel 1. De 5 ‘UTR’er blev indsat opstrøms for Gaussia

luciferase

gen i pCMV-gluc-vektoren (New England Biolabs). Den TMEFF2-myc-His fusionskonstruktion er tidligere blevet beskrevet (11). For uORF analyser blev cellerne dyrket til 70-90% sammenflydning i 6-brønds plader og transficeret med 1,5 pg af hver konstruktion per brønd og den samme mængde af pSEAP-Control Vector II (BD Biosciences). Celler blev transficeret med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ved at følge fabrikantens protokol og under anvendelse af 4 pl /brønd af Lipofectamine reagens. Celler og supernatanter blev opsamlet 24 timer efter transfektion, og luciferaseaktiviteten blev bestemt ud fra supernatanterne ved hjælp af BioLux kit (New England Biolabs). SEAP niveauer blev målt ved hjælp af Great Escape Seap Kemiluminescens Kit 2.0 (Clontech Laboratories). For begge analyser, blev luminescens detekteret ved hjælp af en 20/20

n luminometer (Turner Biosystems).

For DHT-stimuleret reporter analyser, cellerne var hormon-sultet i 48 timer i phenol rød- frit medium indeholdende 10% trækul-strippet serum (CSS) før stimulering med DHT. Fireogtyve timer efter hormon fjernelse blev cellerne transficeret under anvendelse Fugene HD transfektionsreagens (Promega) ifølge producentens anbefalinger. Kort beskrevet 10 ug hver konstruktion og 10 ug pSEAP2 blev fortyndet i serumfrit RPMI sammen med 30 pi Fugene HD reagens til et samlet volumen på 500 pi. 100 pi af denne transfektion blanding blev tilsat per brønd af en 6-brønds plade. Den følgende dag, DHT eller ethanol køretøj blev tilsat til frisk CSS-RPMI og cellerne blev inkuberet i yderligere 48 timer inden høst celler og supernatanter. Til måling Gaussia luciferase-mRNA-niveauer blev RNA isoleret fra celler ved anvendelse af RNAqueous kit (Ambion) i henhold til medfølgende protokol. cDNA blev derpå syntetiseret ved anvendelse af iScript kit (BioRad Laboratories), og luciferase-mRNA-niveauer blev målt ved QRT-PCR under anvendelse af IQ SYBR Green Supermix og IQ5 Real-Time PCR Detection System (BioRad Laboratories). Luciferase mRNA niveauer blev normaliseret til P-

actin

og genekspression blev analyseret ved hjælp IQ5 Optical System Software (BioRad Laboratories). Se tabel 1 for primere anvendt til QRT-PCR.

DHT Stimulation Tidsforløb

Celler blev hormon-udsultet i phenolrødt-frit medium indeholdende 10% CSS natten over før stimulering med 10 nM DHT eller DMSO-kontrol. Actinomycin D blev anvendt ved en koncentration på 5 nM. RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af RNeasy Kit (Qiagen) og cDNA blev syntetiseret under anvendelse af SuperScript II revers transkriptase (Invitrogen).

TMEFF2

besked niveauer blev målt ved QRT-PCR-amplifikation ved hjælp TaqMan

TMEFF2

primere (Hs00249367_m1, Applied Biosystems), og normaliseret til

GAPDH

besked niveauer (forstærket med Hs99999905_m1, Applied Biosystems).

Androgen receptor Knockdown

AR udtryk blev reduceret i 22RV1 celler ved hjælp af ON-TARGET plus SMART pulje til human AR (Thermo Scientific). Ikke-targeting siRNA blev inkluderet som en kontrol. Kort fortalt, 5 pi dæmpende RNA’er og 7,5 pi DharmaFECT transfektionsreagens (Thermo Scientific) blev hver for sig fortyndet i 300 pi serumfrit, phenolrødt-frit RPMI. Efter 5 minutters inkubation blev opløsningerne kombineret og inkuberet i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur, derefter tilsat til en 85% sammenflydende cellemonolag i en T-25 kolbe indeholdende 2,4 ml komplet, phenolrødt-frit RPMI.

Immunoblotting

Cellelysater blev fremstillet med radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer [25 mM Tris-HCI pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Trition X-100, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS] suppleret med 0,1 mM β-glycerophosphat og 0,5 mM natriumorthovanadat og protease inhibitor cocktail (Sigma). Tyve ug lysater blev separeret på Mini-Protean TGX geler (BioRad) og overføres til PVDF-membraner. Disse blev derefter blokeret i 30 minutter i 5% NFDM fortyndet i TBS-T og inkuberet med det primære antistof natten over ved 4 ° C. Inkuberinger med et 1:10,000 fortynding af HRP-konjugeret sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology) var i 1 time ved stuetemperatur. Påvisning blev udført under anvendelse SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific) i 5 minutter. I nogle tilfælde blev blots strippet med Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) efter producentens anbefalinger. Antistoffer mod TMEFF2, PSA, og eIF2α-P (Ser51) var fra Abcam, eIF2α og CREB2 /ATF4 antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, og P-eIF2α (Ser51) antistoffer var fra Cell Signaling Technology.

polysom ​​Analyse Salg

cellemonolag vasket en gang med kold 1X PBS og skrabet med lysepuffer [100 mmol /L KCI, 10 mmol /l HEPES (pH 7,4), 0,5% NP40, 5 mmol /l MgCl

2, 100 ug /ml cycloheximid], og inkuberet på is i 10 minutter, efterfulgt af en 5 min centrifugering ved 10.000 rpm ved 4 ° C for at pelletere celledebris. Lige proteinkoncentrationer på cytoplasmatiske ekstrakter (1,8 mg) blev derefter lagt oven på en lineær sucrosegradient [15-45% (vægt /volumen) 10 mmol /l HEPES (pH 7,4), 100 mmol /L KCI, 5 mmol /l MgCl

2] og centrifugeret ved 35.000 rpm i 2 timer ved 4 ° C i en SW41-Ti rotor uden bremsen. Ved hjælp af en ISCO UA-6, blev fraktioner opsamlet med kontinuerlig UV overvågning ved 254 nm. RNA blev isoleret fra fraktioner under anvendelse af Trizol-reagens (Ambion). Femogtyve mikrogram RNA blev derefter anvendt til cDNA-syntese under anvendelse af et iScript kit (BioRad Laboratories). En prøve på 0,1 ug af hver cDNA præparat blev anvendt til at forstærke

TMEFF2

,

ATF4

, og

β-actin

ved PCR ved hjælp af Platinum Taq HiFi DNA Polymerase-systemet ( Invitrogen). PCR-produkter blev derefter visualiseret på en 1% agarose gel og analyseret ved hjælp af den offentlige domæne NIH billede J program (udviklet på det amerikanske National Institutes of Health og tilgængelig på internettet på https://rsb.info.nih.gov/nih- billede /).

Immunoflourescence

celler blev udpladet ved en densitet på 10.000 celler /brønd i Lab-Tek 8 brønd kamre objektglas (Nalge Nunc International) og inkuberet natten over i en fugtig 37 ° C inkubator med 5% CO

2. Celler blev vasket i PBS og fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter, vasket i PBS og permeabiliseret med 0,1% Triton-X100 i PBS og blokeret med 5% normalt gedeserum i 0,1% PBST. Prøver blev inkuberet i 1 time med de angivne primære antistoffer. De tilsvarende sekundære antistoffer blev tilsat ved en 1:500 fortynding i 5% gedeserum i PBS-T (0,1% Tween 20): gede-anti-kanin-IgG-AF488 (Invitrogen) og gede-anti-muse-IgG-AF488 (Invitrogen). Celler blev vasket 3 gange i PBS-T (0,1% Tween 20). Objektglas blev lufttørret og monteret i medium indeholdende DAPI.

Subcellulær Fraktionering

Ekstrakter fra celler dyrket i nærvær af 10 nM DHT, eller DMSO som kontrol blev fraktioneret i cytosoliske, membranøs, nukleare og cytoskeletale fraktioner ved hjælp af Subcellulær Proteome ekstraktionssæt (Calbiochem).

Statistisk analyse

data er udtrykt som middelværdi ± SD. Forskelle blev analyseret under anvendelse parret, to-halet t-tests. P-værdier ≤ 0,05 (*) eller ≤0.01 (**) blev anset for signifikante.

Resultater

TMEFF2

5′-UTR Indeholder Flere uORFs at Block Oversættelse af den TMEFF2 Protein

5 ‘UTR af

TMEFF2

mRNA indeholder flere potentielle uORFs (figur 1A), at hvis oversat ville potentielt blokere oversættelse af

TMEFF2

vigtigste kodning sekvens, og dermed bidrage til reguleringen af ​​

TMEFF2

udtryk. For at undersøge den rolle, de uORFs i regulering TMEFF2 proteinekspression, spurgte vi, om blokering oversættelse af uORFs ville påvirke translation af TMEFF2 protein i human prostatacancer-cellelinier. En TMEFF2-Gaussia Luciferase (gluc) reporter blev genereret til dette formål ved kloning af

TMEFF2

5′-UTR, herunder fire uORFs, opstrøms for de gluc sekvenser (pTM1234-Gluc, figur 1B).

TMEFF2

-Gluc fusion blev placeret under kontrol af CMV-promotoren. Den regulatoriske bidrag uORFs til

TMEFF2

oversættelse blev evalueret ved at mutere start codon (AUGs) af de fire potentielle uORFs (AUG til GUG, figur 1B) og bestemme deres virkning på gluc udtryk i androgen-afhængige prostatacancer LNCaP og dets knogle-metastatisk, androgen-uafhængig derivat C4-2B cellelinie. En seks til syv gange stigning i Luciferaseekspression blev observeret, når de AUGs fra alle fire uORFs blev muteret (pTMXXXX-Gluc, figur 1C). Enkelte mutationer på AUGs af andet, tredje eller fjerde uORFs fremmet en 3-4 ganges stigning i gluc ekspression, mens mutere AUG af den første uORF havde en meget lille effekt, hvilket tyder på en minimal rolle, om nogen, i reguleringen af ​​TMEFF2 udtryk. Følgelig kombinerede mutationer af uORFs 2, 3, og 4 resulterede i en fem- til seks gange stigning i Luciferaseekspression af reporteren, svarende til den observeret, når alle fire uORFs var muteret (figur 1C). Lignende resultater blev opnået i andre androgen-responsive (22Rv1) og -uafhængige (PC3) prostata cancercellelinjer. Mutation af de uORFs resulterede i øget Luciferaseekspression af gluc reporter, om end i varierende gange induktion (figur 1D). I konstruktionerne anvendt til disse eksperimenter blev ekspression af fusionsgenet instrueret af CMV-promotoren, og luciferaseaktiviteten blev normaliseret til mRNA-niveauer. Alt i alt tyder disse resultater på, at uORFs i 5′-UTR af

TMEFF2

mRNA funktion synergistisk at undertrykke translation af de vigtigste nedstrøms ORF.

A) Skematisk repræsentation af 394 nt opstrøms for

TMEFF2

vigtigste kodende region og relativ lokalisering af fire potentielle uORFs (aa = aminosyre) i 5′-UTR. B) Skematisk afbildning af TMEFF2-Gaussia Luciferase reporter og mutant konstruktioner. X angiver mutation af AUG til en GUG at forhindre translation af de muterede uORFs. Enkelt- og multiple mutationer blev indført. C) luciferaseaktivitet demonstreret ved pTM1234-Gluc og de forskellige mutante konstruktioner i LNCaP og c4-2 celler. D) Luciferaseaktivitet demonstreret ved pTM1234-Gluc og konstruktionen med alle uORFs muterede (pTMXXXX-Gluc) i PC3 og 22Rv1 celler. I C) og D) blev luciferaseaktivitet målt i supernatanten og beregnes ved først normaliserende til mRNA-niveauer for hver konstruktion og derefter til luciferaseaktiviteten demonstreret ved pTM1234-Gluc reporterkonstruktion, som ikke har mutationer i uORFs, betragtes vilkårligt som 1. viste data er gennemsnit ± SD af mindst to uafhængige forsøg med flere gentagelser. *,

s

0,05 og **,

s

. 0,01

Oversættelse af en TMEFF2-Luciferase Reporter reguleres af androgener gennem en mekanisme, der kræver tilstedeværelse af de uORFs i mRNA Leader Region

Transskription af

tmeff2

gen reguleres af androgener [8]. Det er dog blevet antydet, at androgener også påvirke

TMEFF2

udtryk på post-transkriptionelle niveau [10], hvilket fik os til at undersøge, om

TMEFF2

oversættelse var påvirket af androgener. 22Rv1 celler blev selekteret til disse eksperimenter siden: i) de har vist sig at være en værdifuld model for AR-medierede reportergenassays [18], ii) de demonstrerede den største stigning fold i Luciferase reporter-genekspression, når de uORFs var muteret ( se figur 1 D), og iii) de udtrykker detekterbare niveauer af endogent TMEFF2 protein. 22Rv1 celler blev transficeret med pTM1234-Gluc reporter, dyrket i phenolrødt-frit medium suppleret med trækul-strippet (CS) FBS – at fjerne steroid hormones- og behandlet med forskellige koncentrationer af dihydrotestosteron (DHT). Luciferaseaktivitet blev målt fra supernatanterne og normaliseret til mRNA-niveauer. Tilsætning af DHT forøget Luciferaseekspression på en dosis-afhængig måde (figur 2A), hvilket indikerer, at androgener stimulere oversættelse af de vigtigste ORF. Vigtigt er det, denne effekt blev observeret ved DHT koncentrationer inden de fysiologiske niveauer, der findes i humant serum [19]. Luciferaseaktivitet fra celler, der bærer pTMXXXX-Gluc reporter konstrukt, hvor AUGs fra alle fire uORFs blev muteret, ændrede sig ikke som reaktion på DHT, selv om, som forventet, var meget højere (figur 2A). Disse resultater indikerer, at translation af den vigtigste ORF nedstrøms for

TMEFF2

5’UTR reguleres af androgener i en uORF-afhængig måde.

A) Luciferaseaktivitet demonstreret ved pTM1234-Gluc og pTMXXXX-Gluc mutant-konstruktionen i 22Rv1 celler i nærvær af forskellige koncentrationer af DHT. B) Luciferaseaktivitet demonstreret ved pTM1234-Gluc konstruktion i 22Rv1 celler i nærvær af forskellige koncentrationer af DHT og DHT +20 uM bicalutamid (BIC), en AR-agonist. C) Luciferaseaktivitet demonstreret ved pTM1234-Gluc konstruktion i PC3-celler i nærvær af forskellige koncentrationer af DHT. Af alle disse eksperimenter blev celler hormon-udsultet i phenolrødt-frit medium indeholdende trækul strippet serum. Luciferaseaktivitet blev normaliseret til mRNA-niveauer for hver konstruktion og derefter til luciferaseaktiviteten demonstreret ved hver af konstruktionerne er udtrykt i celler dyrket i fravær af DHT, som blev sat til 1. Den viste data er gennemsnit ± S.D. af mindst tre uafhængige forsøg med flere gentagelser. *,

s

0,05 og **,

s

. 0,01

For at bestemme, om DHT effekt på oversættelse er medieret af AR de ovenfor beskrevne forsøg blev gentaget i nærvær af bicalutamid til at blokere AR aktivering. Tilsætning af dette stof reducerede DHT-medieret induktion af pTM1234-Gluc reporter Luciferaseekspression til nær basalniveauer, selvom kunne observeres en lille to- til tre-gange induktion ved 10 nM DHT (figur 2B). Disse resultater indikerer, at virkningen af ​​DHT ved omregning af reporterkonstruktet kræver AR signalering. I overensstemmelse med disse resultater, vi ikke observere DHT-induceret oversættelse af pTM1234-Gluc reporter i PC3 prostata cancer celler, som ikke udtrykker AR (Figur 2C). Tilsammen indikerer disse resultater, at DHT-induceret translation af

TMEFF2

kræver aktivering af AR og medieres af uORFs i lederen region af mRNA’et.

Oversættelse af Endogen TMEFF2 Protein er reguleret af androgener

blev også analyseret Ændringer i ekspressionen af ​​det endogene TMEFF2 proteinet som respons på androgener. Til dette formål blev 22Rv1 celler dyrket i phenolrødt-frit medium suppleret med CS-FBS behandlet med forskellige koncentrationer af DHT og lysater blev analyseret for TMEFF2 ekspression ved Western blotting. I fravær af androgener, ekspression af TMEFF2 var knap detekterbar. Tilsætning af DHT forøget TMEFF2 ekspression (figur 3A), og resulterede i de højeste niveauer i række fysiologiske DHT-koncentrationerne. DHT-induceret ekspression af endogent TMEFF2 blev også observeret i androgen-responsive prostata cancer LNCaP-celler (figur 3A). Ekspressionen af ​​prostataspecifikt androgen (PSA), en AR target anvendt som kontrol for androgen transkriptionel aktivitet, blev forbedret ved tilsætning af DHT (figur 3A). Behandling af cellerne med bicalutamid især hæmmede DHT-induceret TMEFF2 og PSA udtryk, der kun blev observeret ved de højeste koncentrationer af DHT (figur 3A). Inhibering af DHT-induceret TMEFF2 ekspression blev også opnået efter banker ned ekspression af AR hjælp siRNA (figur 3B). Tilsammen indikerer disse resultater, at ekspressionen af ​​det endogene TMEFF2 proteinet reguleres af AR signalering.

A) Repræsentative Western blots indikerer en stigning i TMEFF2 ekspression i respons til DHT tilsætning i 22Rv1 og LNCaP-celler (α = antistof ). Samtidig tilsætning af 20 uM bicalutamid til 22Rv1 celler (midterste panel) forhindrede stigning i TMEFF2 ekspression observeret ved fysiologisk koncentration af DHT. PSA blev anvendt som positiv kontrol, da dets ekspression induceres af androgen i en AR-afhængig måde. β-tubulin blev anvendt som en loading kontrol. B) Western blot indikerer effektiv knock down af de to former af AR i 22Rv1 celler under anvendelse af siRNA (højre). Repræsentative western blot indikerer, at tilsætning af DHT har ingen virkning på ekspressionen af ​​TMEFF2 i celler, i hvilke AR niveauer blev reduceret med RNAi. PSA blev anvendt som kontrol, og som forventet blev dets ekspression ikke påvirkes af DHT i AR-siRNA behandlede celler. β-tubulin blev anvendt som en loading kontrol. C) Ændringer i

TMEFF2

mRNA-niveauer i LNCaP og 22Rv1 cellelinjer i respons til DHT målt ved QRT-PCR. Værdier blev normaliseret til p-tubulin-mRNA. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange, og for de repræsentative billeder, der præsenteres, blev membranerne strippet og igen probet med de forskellige antistoffer eller de samme prøver blev igen kørt på en anden gel. β-tubulin blev anvendt som en loading kontrol, hver gang de prøver blev kørt.

Vi observerede en stigning i

TMEFF2

mRNA-niveauer som respons på DHT som målt ved QRT-PCR ( figur 3C), i overensstemmelse med en tidligere rapport indikerer, at androgener stimulerer

tmeff2

transskription [8]. Men den beskedne stigning i mRNA-niveauer ikke sandsynligt forklare den observerede DHT-medieret forøgelse i proteinekspression. For at udelukke den mulighed, at stigningen i endogene TMEFF2 protein observeret som reaktion på DHT udelukkende skyldes øget transkription, vi bruges actinomycin D til at blokere transkription og vurderet niveauerne af TMEFF2 protein og mRNA i 22Rv1 celler på forskellige tidspunkter efter tilsætningen af DHT, at inducere

tmeff2

ekspression og /eller actinomycin D. tMEFF2 proteinniveauer steget dramatisk 60-120 minutter efter tilsætningen af ​​DHT, men ikke DMSO, vehikelkontrollen (figur 4A). Vigtigt er det, i nærvær af actinomycin D, tilsætning af DHT stadig fremmet en stigning i TMEFF2 proteinekspression, end på et lavere niveau end observeret i fravær af den transskriptionsinhibitor. Som angivet ved analyse af

TMEFF2

mRNA-niveauer ved QRT-PCR, tilsætning af actinomycin D inhiberede basal og DHT-induceret

tmeff2

transkription (figur 4B). Tilsætning af DHT alene fremmet en svag indledende stigning i transkription (1,2 gange efter 20 minutter), der gradvis faldt til basale niveauer efter 60 minutter af behandling (ikke vist). Derfor er disse resultater viser, at androgener regulerer ikke kun transskription af

tmeff2

gen, men også oversættelse af det endogene

TMEFF2

mRNA, understøtter resultaterne præsenteret ovenfor under anvendelse af en TMEFF2-Luciferase reporter.

A) repræsentative western-blot der viser den TMEFF2 protein ved de angivne tidspunkter efter tilsætning af 10 nM DHT i nærværelse eller fravær af 5 nM actinomycin D (Act D) for at blokere transkription. Enten DMSO eller DHT og actinomycin D blev tilsat samtidigt. Kvantificering af blottene er præsenteret nedenfor western blot. Bandet intensiteter af prøver behandlet med DHT blev normaliseret først til p-tubulin og derefter med værdierne opnået for de DMSO prøver ved de tilsvarende tidspunkter. B) Ændringer i

TMEFF2

mRNA-niveauer i 22Rv1 celler i respons på DHT eller DMSO og actinomycin D behandling som målt ved QRT-PCR. Værdier blev normaliseret til

GAPDH

. De viste data er repræsentative for to uafhængige forsøg.

Andre proteiner, herunder β-catenin og occludin translokere til kernen eller områder af cellulære kontakt efter androgen behandling. vores resultater viste dog, at androgen behandling ikke ændrede subcellulære lokalisering af TMEFF2 (figur S1).

Androgen Signaling Fremmer eIF2α Phosphorylering

Phosphorylering af eIF2α reducerer den globale oversættelse, men også giver en mekanisme, der selektivt øger oversættelse af uORF-holdige mRNA [13], [20]. Vi hypotese derfor, at DHT fremmer endogene

TMEFF2

oversættelse gennem fosforylering af eIF2α. Virkningen af ​​DHT på eIF2α phosphorylering blev undersøgt ved western blot-analyse i prostatacancer 22Rv1 og PC3-celler dyrket i phenolrødt-frit medium suppleret med CS-FBS og behandlet med forskellige koncentrationer af DHT. Forøgede niveauer af eIF2α-P blevet klart påvist, på en dosis-afhængig måde, i lysater fra DHT-behandlede 22Rv1 celler, men ikke i lysater fra DHT-behandlede AR-null PC3-celler (figur 5A), hvilket indikerer, at androgener fremme eIF2α-P og at denne effekt er afhængig af tilstedeværelsen af ​​et funktionelt AR. I overensstemmelse med disse resultater, forbehandling af 22Rv1 celler med AR antagonist bicalutamid forhindrede DHT-medierede stigninger i eIF2α fosforylering (figur 5B). DHT tilsætning fremmes også en stigning i ekspressionen af ​​ATF4 protein, en transskriptionsfaktor reguleres af eIF2α phosphorylering (figur 5A).

A) Repræsentative Western blots indikerer en stigning i eIF2α-P som reaktion på DHT tilføjelse i 22Rv1 celler. Denne virkning blev ophævet i PC3-celler, som ikke udtrykker AR (højre). ATF4 proteinniveauer blev målt som en positiv kontrol, da det induceres af eIF2α-P. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. B) Tilsætning af 20 pM bicalutamid til 22Rv1 celler forhindrede stigning i eIF2α-P observeret efter tilsætning af DHT.