PLoS ONE: EZH2 Fremmer Ondartede opførsel via Cell Cycle Dysregulering og dens mRNA Level Associates med Prognose for Patient med ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Baggrund

epigenetisk inaktivering er en fælles mekanisme til at inaktivere tumorsuppressorgener under carcinogenese. Enhancer af Zeste 2 (EZH2) er den histon methyltransferase underenheden i Polycomb undertrykkende kompleks 2, der medierer transkriptionel repression gennem histon methylering. EZH2 overekspression er blevet forbundet med aggressive fænotyper af visse kræftformer. Men den mekanisme, EZH2 spiller for fremme malignitet i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er fortsat uklar. Hertil kommer, at korrelationen mellem EZH2 overekspression og prognosen for NSCLC patienter i ikke-asiatisk kohorte skal fastlægges.

Metode /vigtigste resultater

opregulering af EZH2 blev fundet i NSCLC celler sammenlignet med normale humane bronchiale epitelceller ved Western blot-assay. Ved EZH2 knockdown hjælp små interfererende RNA (siRNA), blev den spredning, forankringsuafhængig vækst og invasion af NSCLC celler bemærkelsesværdigt undertrykt med dyb induktion af G1 anholdelse. Endvidere blev ekspressionen af ​​cyklin D1 især reduceret mens p15

INK4B, p21

WAF1 /Cip1 og p27

Kip1 blev forøget i NSCLC celler efter EZH2-siRNA levering. For at bestemme om EZH2 ekspression bidrager til sygdomsprogression hos patienter med NSCLC, blev Taqman kvantitativ real-time RT-PCR anvendes til at måle ekspressionen af ​​EZH2 i parrede tumor og normale prøver. Univariate analyse viste, at patienter med NSCLC, hvis tumorer havde en højere EZH2 udtryk havde signifikant ringere samlet, sygdomsspecifikke og sygdomsfrie overlevelse sammenlignet med dem, hvis tumorer udtrykte lavere EZH2 (P = 0,005, P = 0,001 og P = 0,003, henholdsvis ). I multivariat analyse, EZH2 udtryk var en uafhængig prædiktor for sygdomsfri overlevelse. (Hazard ratio = 0.450, 95% CI: 0,270-0,750, P = 0,002)

Konklusioner /Betydning

Vores resultater viser, at EZH2 overekspression er kritisk for NSCLC progression. EZH2 mRNA niveauer kan tjene som en prognostisk indikator for patienter med NSCLC

Henvisning:. Cao W, Ribeiro RDO, Liu D, Saintigny P, Xia R, Xue Y, et al. (2012) EZH2 Fremmer Ondartede opførsel via Cell Cycle Dysregulering og dens mRNA-niveau Associates med Prognose for Patient med ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (12): e52984. doi: 10,1371 /journal.pone.0052984

Redaktør: Qing-Yi Wei, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: Juli 17, 2012; Accepteret: November 22, 2012; Udgivet: December 31, 2012

Copyright: © 2012 Cao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet er støttet af NIH tilskud R01 CA126818 og R01 CA136635. WC understøttes delvist af National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.202.130). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA, det dræber mere at 160.000 amerikanere hvert år [1], hvoraf, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for mere end 85% af tilfældene. Trods løbende forbedringer i kirurgiske teknikker og chemoradiation terapi blev den 5-års overlevelsesraten for patienter med fremskredne stadier NSCLC ikke dramatisk forbedret på grund af manglende effektive behandlinger [2]. Ligner andre kræftformer, blev flere trin, der resulterede i ophobning af genetiske og epigenetiske vekslen involveret i initiering og progression af lungekræft [3], [4]. Derfor forstå den molekylære mekanisme for kræft progression er kritisk for at fremme behandlingen af ​​lungecancer [5], [6], [7].

Methylering af CpG-øer i promotorregionerne er en fælles epigenetisk mekanisme til inaktivere tumorsuppressorgener, såsom

p16, PTEN, DAPK

[8], [9]. Polycomb gruppe proteiner (PCG proteiner) er vigtige epigenetiske regulatorer af gener involveret i celledeling, differentiering, mønsterdannelse og stamceller fornyelse [10], [11], [12]. EZH2 er medlem af PCG-proteiner og en del af Polycomb repressor kompleks (PRC) 2, som methylerer histon H3 ved lysin 27 (H3K27me3). H3K27me3 gengæld vil tjene som et vartegn for rekruttering af andre protein komplekser, såsom PRC1, at mægle epigenetisk inaktivering [13]. Det blev vist, at PRCs kan rekruttere DNA methyltransferaser direkte og inducere DNA-methylering [14], [15]. Overekspression af EZH2 er blevet observeret i flere forskellige tumortyper [16] – [25], og forbundet med dårlig prognose. imidlertid tilsyneladende EZH2 at have særskilte biologiske roller i forskellige cancertyper, eftersom den er forbundet med mere foretrukne prognosen hos nogle kræftformer [26], [27].

Selvom EZH2 proteinniveauer blev vist at være en negativ prognostisk indikator i NSCLC [17], [18], den underliggende mekanisme af EZH2 at fremme malignitet i NSCLC er ikke blevet godt karakteriseret. I denne undersøgelse, vi søgte at bestemme den biologiske virkning af EZH2 ovexpression i NSCLC og vurdere muligheden for at anvende EZH2 mRNA-ekspressionsniveauer som en potentiel biomarkør forudsige kliniske resultater hos patienter med NSCLC.

Materialer og metoder

cellelinjer og Patienter

NSCLC cellelinjer (H157, H226, H292, H358, H460, H522, A549, H596, H1299, H1792, H1944, Calu-1, og SK-Mes- 1) anvendt i undersøgelsen blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og blev dyrket i DMEM medium med 10% føtalt bovint serum (Mediatech, Manassas, VA). De normale humane bronchieepithelceller cellelinier HBE1, HBE2 og HBE3 (venligst tilvejebragt af Dr. John Minna af The University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas TX) blev dyrket i keratinocyt serumfrit medium med 25 ug /ml oksehypofyseekstrakt og 0,2 ng /ml rekombinant epidermal vækstfaktor (Invitrogen, Carlsbad, CA) som beskrevet tidligere [28], [29].

Kliniske prøver inkluderet i studiet består af primære tumorer og deres tilsvarende ikke-maligne lungevæv danner 94 individer med patologisk stadie i-IV NSCLC. Alle patienterne blev behandlet med kirurgisk resektion af de primære tumorer, undtagen dem med stadium III og IV tumorer, der måske også modtage postoperativ strålebehandling og adjuverende kemoterapi, i MD Anderson Cancer Center fra 1995 til 2000. Prøverne blev straks frosset og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Udvælgelsen af ​​disse patienter var baseret på tilgængeligheden af ​​arkiverede frisk tumor og tilsvarende normale lungevæv for efterforskerne. Klinisk information og opfølgning oplysninger til undersøgelsen var baseret på diagrammet gennemgang og fra rapporter fra M.D. Anderson tumor registreringsdatabasen service. Informeret samtykke til brug af resterende resektion væv til forskning blev opnået fra alle patienter, der deltog i undersøgelsen, og alle deltagere, forudsat at deres skriftligt informeret samtykke til at blive inddraget i dette arbejde. Undersøgelsen blev gennemgået og godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelsen af ​​The University of Texas MD Anderson Cancer Center.

RNA Extraction og Taqman Gene Expression Analysis

Total RNA fra vævsprøver blev ekstraheret ved hjælp af Trizol reagens ifølge producentens anvisninger. Ca. 1 til 2 ug totalt RNA fra hver prøve blev omdannet til cDNA under anvendelse SuperScript II revers transkriptase (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) i 20 volumen pi. CDNA produkt blev fortyndet til 100 pi med sterilt vand. For Taqman genekspression assay blev 2,5 pi fortyndet cDNA blandet med primer begrænset glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) endogen kontrol probe (Cat # 432.631) og EZH2 probe (Assay ID Hs001016789_m1, cat # 4.331.182) i alt 25 pi reaktionsvolumen og analyseret på et 7500 Fast Real-Time PCR-system (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ifølge anbefalet fremstilling tilstand. Den GAPDH-normaliseret udtryk niveau af EZH2 i tumorvæv eller tilstødende normale lungevæv blev beregnet som ACt (dCt_Tumor eller dCt_Normal) = Ct

EZH2-Ct

GAPDH. Duplikerede kørsler blev udført, og den gennemsnitlige ACt blev anvendt til analyse. Brug af ekspressionsniveauer i forhold til de tilsvarende normale væv, blev individuelt EZH2 niveau bestemmes. Den fold forskel på EZH2 ekspression i en tumorvæv sammenlignet med den tilsvarende normale væv beregnes ved 2

-ΔΔCt (sammenlignende Ct metode) hvor ΔΔCt = ACt-Tumor (dCt_Tumor) -ΔCt Normal (dCt_Normal) (25). En fold forskel . 1 anses for høj EZH2 udtryk i tumorvæv

SiRNA transfektion

Da EZH2 har to store splejsning varianter, kemisk syntetiserede siRNA’er var designet til at målrette både EZH2 splejsning varianter og købt fra Ambion Inc. (siRNA ID: si-4916 og si-4917). Sekvenserne for disse siRNA er 5’GCUGACCAUUGGGACAGUATT-3 ‘(si-4916) og 5′-GUGUAUGAGUUUAGAGUCATT-3’ (si-4917). FAM mærket Scrambled siRNA blev også opnået fra Ambion Inc. In vitro transient transfektion blev udført under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved at følge fabrikantens protokol.

Western blot-analyse

Proteiner blev høstet fra dyrkede celler med RIPA-buffer plus proteasehæmmere (Complete proteasehæmmer, Roche Bioscience). Tyve mikrogram totalt protein fra hver prøve blev separeret i natrium dodecyl sulfatreducerende polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse af en Bio-Rad Mini-Protean II-apparat. De separerede proteiner i gelen blev overført til nitrocellulosemembran (Schleicher 0,1 mm i diameter blev talt under et mikroskopisk felt ved × 20 forstørrelse. De gennemsnitlige kimtal blev beregnet ud fra 6 tilfældigt udvalgte felter for hver behandling tilstand.

In Vitro

Cell Invasion Assay

In vitro invasion assay blev udført i BD BioCoat Matrigel invasion kamre (Falcon 354.480, BD Biosciences). Efter rehydrering af kamrene, 1 x 10

5 forbigående transficerede celler i 500 pi DMEM indeholdende 1% FBS blev tilsat til hver af de øvre kamre og 750 pi DMEM indeholdende 10% FBS blev anbragt i det nedre kammer. Efter 20 timers inkubation blev cellerne fikseret i 4% formaldehyd og farvet med 0,5% krystalviolet. Ikke-invaderende celler på den øvre side af kammeret, blev fjernet under anvendelse vatpind. Invaderende celler blev fotograferet og talt i 8 tilfældigt udvalgte felter (forstørrelse, × 20). Alle forsøg blev udført i to eksemplarer og gentaget 3 gange.

Statistisk analyse

Kliniske data blev opsummeret ved hjælp af standard deskriptiv statistik og frekvens tabulering. Kruskal-Wallis test og Wilcoxon rank sum test blev udført for at vurdere forskellen i kontinuerlige variabler mellem /blandt patienternes kliniske-patologiske parametre. Korrelationer mellem EZH2 mRNA-ekspression og kliniske parametre blev vurderet ved anvendelse af Pearsons korrelationskoefficient. Overlevelseskurver blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Univariate Cox proportional hazard model blev anvendt til at vurdere effekten af ​​kovarianter på den samlede overlevelse, sygdomsspecifikke overlevelse (dvs. dem, der døde af lungekræft-relaterede årsager specifikt) og sygdomsfri overlevelse (dvs. dem, der udviklede recidiv og /eller metastase). Multivariate Cox model blev anvendt til at vurdere effekten af ​​EZH2 til tiden til begivenheden resultat, justeret for andre kovariater vist statistisk signifikans i univariate analyser. Alle statistiske tests er tosidede og en P

– Drømmeholdet værdi på 0,05 eller lavere blev betragtet som statistisk signifikant.

t

test for parrede data blev anvendt til analyse af

in vitro

studier. Alle beregninger blev udført i SAS (Cary, NC) og S-plus 7.0 til Windows (Insightful Corp.).

Resultater

Fænotypiske Virkninger af EZH2 Nedregulering på NSCLC Cells

EZH2 protein blev påvist som et enkelt 91 kDa bånd på Western blot i alle 13 NSCLC cellelinjer og i immortaliserede humane bronkiale epiteler celler (HBES). Udtrykket i NSCLC-celler var generelt højere end i HBES (fig. 1A). EZH2 farvning blev udelukkende lokaliseret i kernerne i lungecancerceller (fig. 1B). H1299 og A549, som havde høje og moderate niveauer af EZH2 ekspression henholdsvis blev udvalgt til yderligere undersøgelse af forholdet mellem EZH2 niveau og maligne fænotyper.

(A) EZH2 ekspression i NSCLC lungecancerceller og human bronchial epiteler celler (HBES) blev bestemt ved Western blot under anvendelse helcellelysat. Blottet blev først probet med anti-EZH2 antistof og re-undersøgt med anti-GAPDH-antistof for at indikere loading mængde. (B) Immuncytokemi farvning af dyrkede NSCLC celler. A549 og Calu-1-celler blev fikseret med 1% formaldehyd derefter farvet med anti-EZH2 antistof, efterfulgt af påvisning med anti-muse-sekundært antistof og DAB som kromogent middel. Sekundær-antistof kun anvendes som negativ kontrol. (C) Eksempel på nedregulering af EZH2 ekspression ved siRNA transfektion. H1299 og A549-celler blev transficeret med EZH2 målretning siRNA si-4916 og SI-4917 siRNA’er eller et kodet si-RNA kontrol. Hele cellelysat blev høstet 72 timer efter transfektion og analyseret som beskrevet i A.

To ikke-overlappende siRNA’er (si-4916 og si-4917) blev anvendt til at lukke munden på EZH2 udtryk i H1299 og A549 celler. Transfektion af si-4916 i disse NSCLC celler resulterede i 10-60% reduktion af EZH2 udtryk, hvorimod transfektion med si-4917 reduceret EZH2 proteinniveauet med 70-80% (Fig. 1C). Reduktion EZH2 ekspression formindskede signifikant proliferation af H1299 og A549-celler (fig. 2a og 2b). For at afgøre, hvilken population af celler blev foruroliget i cellecyklus, flowcytometri analyse blev udført i disse transfekterede lunge kræftceller. Resultaterne viste, at en reduktion EZH2 ekspression fører til akkumuleringen af ​​cellerne i G1-fasen og reduktion af celler i S-fase (fig. 2C og 2D).

(A, B) Proliferation plot af celler med ned -regulated EZH2. A549 eller 1299 blev transficeret med EZH2-targeting siRNA eller krypteret siRNA kontrol i 6 timer, derefter podet i 96-brønds plade i tre eksemplarer per behandling. Spredningen af ​​cellerne blev vurderet ved WST-1 assay ved 24 timers mellemrum. (C, D) Fordeling af cellepopulation i EZH2 knockdown NSCLC celler. A549 eller 1299 celle blev transficeret med siRNA eller krypteret kontrol. Cellerne blev høstet 72 timer senere, fikseret og farvet med propidiumiodid. Cellulært DNA-indhold blev bestemt ved flowcytometri og fordelingen af ​​cellerne analyseres ved FlowJo software.

Desuden H1299 eller A549-celler med nedreguleret EZH2 ekspression viste en signifikant reduceret kolonidannelse kapacitet. NSCLC-celler transficeret med si-4916 eller si-4917 resulterede i 1,5 til 2,8 gange reduktion i kolonier dannet i blød agar sammenlignet med celler transficeret med scrambled siRNA kontrol i blød-agar forankringsuafhængig kolonidannelse assayet (fig. 3A). Endvidere evnen af ​​disse NSCLC celler at invadere gennem ekstracellulær matrix var også signifikant reduceret ved EZH2 nedregulering som bestemt ved en matrigel belagt Boyden kammer invasion assay (fig. 3B).

A549 eller 1299 blev transficeret med EZH2-targeting siRNA eller krypteret siRNA kontrol i 6 timer. (A) For forankringsuafhængig kolonidannelse assayet blev de transficerede celler udsået i 0,35% agarose i en 6-brønds plade ved 2 × 10

4 /brønd. De dannede kolonier blev talt efter 3-ugers inkuberet med regelmæssig udskiftning af medium. (B) For invasion og migration assay, 1 x 10

5 transficerede celler i 1% serum blev podet på toppen af ​​en BD BioCoat Matrigel invasion kammer med 10% FBS i det nedre kammer. Efter 24 timer blev cellerne fikseret med 4% formaldehyd med 0,5% krystalviolet. Celler invaderet til det nedre kammer, blev talt under lav forstørrelse mikroskop. Forsøgene blev kørt in duplo og gentaget tre gange. Det gennemsnitlige antal og standard afledning af hver behandling blev afbildet her.

Virkningen af ​​EZH2 Nedregulering på cellecyklus Regulators og metastatisk Inhibitor

Korrelation af EZH2 Expression og klinisk resultat i patienter med NSCLC

for at bestemme om EZH2 udtryk bidrager til sygdomsprogression hos patienter med NSCLC, vi målte EZH2 ekspressionsniveauerne i 94 NSCLC tumorvæv og de matchende tilstødende ikke-maligne lungevæv ved Taqman kvantitativ real-time PCR, vi derefter analyseret korrelationen af ​​EZH2 ekspressionsniveauerne med kliniske parametre og behandlingsresultater.

Blandt de 94 patienter, 59 patienter døde og 35 patienter var stadig i live på tidspunktet for sidste opfølgning. Den mediane follow-up tid er 56 måneder. Patienternes alder på tidspunktet for diagnosen varierede fra 41 til 84 år, med en gennemsnitsalder på 63 år. Forty-on (43%) af patienterne var kvinder og halvtreds-tre (56%) var mænd. Treogtres (67%) af patienterne var nuværende eller formelle rygere. De histologiske typer af adenocarcinom, pladecarcinom, og andre blev fundet i 51%, 40% og 9% af patienterne. Fase I og II-patienter udgør 66% af de alle patienter, og de resterende 34% af patienterne havde Stage III og IV sygdom. De generelle kliniske og patologiske karakteristika af patienter er opsummeret i tabel 1.

Vi har ikke observere signifikant sammenhæng mellem EZH2 udtryk i tumor eller tilstødende normal lunge og klinisk-patologiske parametre, ved siden af ​​en statistisk insignifikant sammenslutning af rygning og EZH2 ekspression i tumoren (P = 0,1), og en mindre korrelation mellem kliniske stadium og EZH2 ekspression i tumor i forhold til tilstødende normale lungevæv (P = 0,07, tabel 1). Samlet set fandt vi, ret uventet, at den mediane niveau for EZH2 ekspression i tumorvæv var ligner de tilstødende ikke-maligne lungevæv (DCT = 3,86 vs 3,90; median fold ændring = 1,0, tabel 1).

Vi analyserede derefter sammenhængen mellem EZH2 udtryk og kliniske resultater af patienterne. I univariate analyse, observerede vi, at den høje EZH2 ekspression i tumorvæv i forhold til matchede tilstødende normale lungevæv (høj EZH2-gange ændring) var stærkt associeret med total overlevelse, sygdomsfri overlevelse, og sygdomsspecifik overlevelse af patienter med NSCLC (hazard ratio = 0,477, 0,414, 0,468 og P = 0,006, 0,002, 0,004 henholdsvis tabel 2). Klinisk fase havde en marginal tilknytning til sygdomsfri overlevelse (P = 0,090). Kaplan-Meier analyse viste, at patienter, hvis tumorer havde høj tumor EZH2 udtryk i forhold til parret tilstødende normale lungevæv havde en signifikant ringere klinisk resultat i forhold til dem, hvis tumorer havde lav EZH2 udtryk. Ved 5-års postoperativt, sandsynligheden af ​​overlevelsen, sygdomsspecifik overlevelse og sygdomsfri overlevelse var 25%, 27% og 15%, henholdsvis for den høje ekspression gruppen, sammenligne til 57%, 59% og 47% for den lave ekspression gruppen (P = 0,005, P = 0,001 og P = 0,003 henholdsvis log rank test;. figur 5A). Interessant EZH2 ekspressionsniveau i tumorvæv (dCt_Tumor) i sig selv er utilstrækkelig til at forudsige prognosen for patient med NSCLC (fig. 5B). I multivariate Cox proportional analyser med sygdom scene som co-faktor, EZH2 udtryk i tumorvæv i forhold til matchede tilstødende normale lungevæv var de uafhængige prædiktorer for sygdomsfri overlevelse (hazard ratio = 0,045, 95% CI: 0,270-0,750, P = 0,002) (tabel 2).

diskussion

Polycomb gruppe proteiner er vigtigt for at opretholde de rumlige mønstre af homeotiske genekspression, der blev etableret i begyndelsen af ​​fosterudviklingen ved at holde tavshed tilstand af homeotiske gener [30], [31]. Unormal ekspression af Polycomb gruppe proteiner kan omforme cellulær genekspression mønster. Overekspression af EZH2 har vist sig at forårsage epitelial hyperplasi i mælkekirtler [32], og for at fremme malign transformation af præcancerøse læsioner til cancere i forskellige epitelvæv [33] – [36]. Desuden stigende beviser tyder på, at overekspression af EZH2 i kræft bidrage til en mere aggressiv klinisk adfærd [16], [25], som er sandsynligvis medieret dels gennem tavshed udtryk for cellecyklusinhibitorer p15

INK4B og p16

INK4a [37], [38]. Men den præcise rolle EZH2 spillet i lungekræft progression fortsat uklart.

I pattedyrceller, CDK4 /6-cyclin D og CDK2-cyclin E er den primære G1 /S cellecyklus checkpoint faktorer styrer engagement af celler til transit fra G1 fasen og træde i DNA-syntese. Mens CDK4 /6-cyclin D og CDK2-cyclin E-komplekser fremmer celle ind S fase gennem lindre hæmning af pRb om transskription af S-fasen fremmer gener, p15

INK4B, p16

INK4a og p21

WAF1 /Cip1, p27

Kip1 er negative regulatorer af disse to komplekser henholdsvis [39], [40]. I denne undersøgelse viste vi, at EZH2 overekspression er nødvendig for væksten af ​​NSCLC ved at fremme G1-S overgang; banke-down ekspressionen af ​​EZH2 i NSCLC-celler inducerede cellerne til at akkumulere i G1-fasen og samtidig reducere cellerne i S-fasen. Fænomenerne svarede til hvad observeret i andre typer af transformerede øvre aerodigestive spor epiteler celler [33], [41]. Ændringerne i cellecyklusfordeling er ledsaget af reduceret ekspression af cyclin D1, og forøget ekspression p15

INK4B, p21

WAF1 /Cip1 og p27

Kip1 på en af ​​NSCLC cellelinjer eller begge, sammenlignelige med resultaterne ved andre tumorer [33], [42], [43], [44], hvilket indikerer EZH2 kan fremme malignitet ved tilsvarende mekanisme i forskellige tumortyper. Den samlede virkning af EZH2 nedregulering formindskes aktiviteter af CDK4 /6-cyclin D og CDK2-cyclin E-komplekser, hvilket reducerer celleproliferation. Dette antyder en af ​​de vigtigste virkninger af EZH2 dysregulering i NSCLC er til ændret cellecykluskontrol.

Desuden observerede vi EZH2 nedregulering væsentligt påvirket andre aggressive adfærd af NSCLC celler, såsom evnen til at danne kolonier i en ankerplads-uafhængig mode og invaderende gennem ekstracellulære matrix. Vi observerede, at ekspressionen af ​​DIAB2IP, en metastase undertrykker og et mål på EZH2-medieret epigenetisk inaktivering i prostatacancer [45], [46], var signifikant forøget ved EZH2 knockdown, hvilket antyder en potentiel rolle DIAB2IP i regulering Ras-signalering i lung epiteler celler og dets inaktivering som en del af den onkogene proces i lungen.

desuden har vi også observeret, at ekspression af caspase 3, apoptotiske markører spaltet PARP Asp214 og spaltes caspase-3 Asp175 blev forøget i A549-celler med EZH2 knockdown (fig. 4B), kunne tyder EZH2 overekspression har anti-apoptose funktion i nogle NSCLC-celler.

H1299 (A) eller A549 (B) celler blev transficeret med EZH2-targeting siRNA eller krypteret siRNA kontrol som angivet. 72 timer efter transfektion blev cellerne høstet, og totalt protein blev ekstraheret. Tyve mikrogram protein pr brønd blev separeret på SDS-PAGE og overført til nitrocellulose-membran. Blottet blev probet med det angivne antistof og visualiseret ved HRP-konjugeret sekundært antistof og ECL. Billeder på film blev scannet ved hjælp af Canon film scanner. Ekspressionsniveauet blev kvantificeret ved digitaliseret pixeltæthed tæller ved hjælp af Adobe Photoshop og udtrykt som fold ændringer beneath billederne.

Kaplan Meier estimering af den samlede overlevelse, sygdomsspecifik overlevelse og sygdomsfri overlevelse ved ( A) EZH2 ekspression i tumorvæv i forhold til tilstødende normale lungevæv (EZH2-gange ændring); og (B) EZH2 ekspressionsniveauer i tumorvæv i sig selv (dCt_Tumor). Medianen af ​​hver enkelt foranstaltning blev brugt til at dichotomize patientpopulationen.

Forhøjet EZH2 immunoreaktivitet i tumoren var forbundet med negativ kliniske resultat i hvad der synes at være overvejende orientalske NSCLC patientkohorter [17], [18 ]. For at bestemme korrelationen mellem EZH2 udtryk og det kliniske resultat i en amerikansk patient kohorte, vi brugte kvantitativ real-time PCR-metode. Vores data indikerer, at EZH2 ekspression i tumor i forhold til tilstødende normale lungevæv er en stærk og uafhængig prædiktor for det kliniske resultat hos disse patienter. Vi observerede også relativt stærk EZH2 ekspression i tumor tilstødende nonmalignant lungevæv, der kan følge af den kroniske kræftfremkaldende eksponering af hele lungen. I overensstemmelse med denne mulighed, vores undersøgelse viste, at EZH2 udtryk i tumorer i rygere var marginalt højere end i tumorer i ingen rygere.

En væsentlig begrænsning af vores analyse er dens relativt lille stikprøve. Der for, var vi ikke i stand til at se en stærk sammenslutning af sygdom resultat med klinisk fase, heller ikke gjorde vi observerer alle sammenslutninger af EZH2 udtryk med forekomsten af ​​metastaser.

Sammenfattende viste vi, at overekspression af EZH2 bidrager til cellecyklus deregulering og aggressive fænotyper af NSCLC celler, eventuelt ved at ændre cellecyklus kontrolmekanisme og fremme ondartet vækst. Vi viste også, at tumorspecifikt opregulering af EZH2 mRNA-ekspression er en uafhængig faktor for ringe overlevelse hos patienter med NSCLC. Disse resultater antyder også, at en undergruppe af NSCLC patienter, hvis tumor har en høj EZH2 ekspression kan drage fordel af therapys der målretter EZH2 [47].