PLoS ONE: Anvendelse af en to-delt Test strategi for Samtidig detektering af små EGFR mutationer og EGFR Amplification i Lung Cancer

Abstrakt

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Der er opnået de seneste fremskridt i lungekræft diagnosticering og behandling på grund af en bedre forståelse af de molekylære mekanismer i sygdommen og identifikation af biomarkører, der giver mere specifikke kræftbehandling. En af de bedst kendte eksempler på personaliseret terapi er brugen af ​​tyrosinkinaseinhibitorer, såsom gefitinib og erlotinib, for en vellykket behandling af ikke-småcellede lungecancerpatienter vælges baseret på specifikke

EGFR

mutationer. Derfor er den pålidelig detektion af mutationer er kritisk for anvendelsen af ​​passende behandling. I denne undersøgelse testede vi en tostrenget mutation afsløring strategi ved hjælp af real-time PCR-analyser som en godt valideret høj følsomhed metode og multiplex ligation-afhængig sonde forstærkning (MLPA) -baseret EGFRmut + assay som en andenrangs standard-følsomhed metode. En yderligere fordel ved den anvendte MLPA metode er, at det giver mulighed for samtidig påvisning af EGFR-mutationer og kopi-nummer ændringer (dvs. amplifikationer) i

EGFR, MET

ERBB2

. Vores analyse viste høj overensstemmelse mellem disse to metoder. Med brugen af ​​denne todelt strategi, vi pålideligt hyppigheden af ​​

EGFR

mutationer og

EGFR, MET

erbB2

amplifikationer i over 200 lungekræft prøver. Derudover udnytter samtidig kopi nummer og lille mutation analyser viste vi en meget stærk sammenhæng mellem EGFR mutationer og EGFR amplificeringer og en gensidig eksklusivitet af EGFR mutationer /amplificeringer med MET og ErbB2 amplificeringer. Vores resultater viste sig pålideligheden og anvendeligheden af ​​de to-delt EGFR teststrategi

Henvisning:. Lewandowska MA, Czubak K, Klonowska K, Jozwicki W, Kowalewski J, Kozlowski P (2015) Brug af en To- differentieret Test strategi for samtidig påvisning af små

EGFR

Mutationer og

EGFR

Amplification i lungekræft. PLoS ONE 10 (2): e0117983. doi: 10,1371 /journal.pone.0117983

Academic Redaktør: Rafael Rosell, catalansk Institute of Oncology, SPANIEN

Modtaget: Maj 16, 2014; Accepteret: 5 Januar 2015; Publiceret: 26 feb 2015

Copyright: © 2015 Lewandowska et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsstøtte 2011/01 /B /NZ5 /02.773 fra National Science Centre (https://www.ncn.gov.pl /). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Behandlingen af ​​lungecancer er traditionelt baseret på en histopatologisk bedømmelse, der adskiller to hovedtyper af lungekræft: småcellet lungecancer (SCLC) og ikke-småcellet lungecancer (NSCLC), hvoraf sidstnævnte kan opdeles i squamous cellecarcinom, storcellet carcinom, adenocarcinom og kræft med blandet histologi. Betydelig seneste fremskridt i behandlingen af ​​lungekræft (især adenokarcinomer) er opnået ved fremskridt i vores forståelse af dens patologi; de nuværende behandlingsmuligheder omfatter specialiserede agenter baseret på tilstedeværelse eller fravær af specifikke genetiske biomarkører ( “personlige terapi”), såsom mutationer i epidermal vækstfaktor receptor (

EGFR

) [1] eller vinde-of- funktion translokationer eller inversioner involverer anaplastisk lymfom receptortyrosinkinase (

ALK

) [2].

det blev vist, at visse somatiske mutationer i kinasedomænet af

EGFR

sensibilisere kræftformer til behandling med

EGFR

-specifikke tyrosinkinasehæmmere (TKI’er), såsom erlotinib eller gefitinib (revideret i [3]). Blandt de mest almindelige sensibiliserende

EGFR

mutationer er L858R i exon 21 og i-frame deletioner i exon 19, som tilsammen tegner sig for over 80-85% af alle

EGFR

mutationer. Men forekomsten af ​​det sekundære T790M mutation i exon 20 forårsager erhvervet resistens over for TKI’er og forårsager progressionen af ​​cancere behandlet med TKI’er [4,5]. Derfor er den pålidelig detektering af

EGFR

mutationer er en vigtig faktor, der gør det muligt at personlig behandling af lungekræftpatienter.

I de sidste 10 år, mange metoder med forskellige følsomheder og specificiteter er blevet brugt at opdage

EGFR

mutationer i prøver kræft. Disse metoder omfatter Sanger-sekventering, enkeltstrenget konformation polymorfisme (SSCP) [6], co-amplifikation ved lavere denatureringstemperatur-PCR (COLD PCR) [7], immunhistokemi med

EGFR

-mutation specifikke antistoffer [8] , peptidnukleinsyre-låst nukleinsyre (PNA-LNA) PCR clamp-assays, real-time PCR (RT-PCR) metoder [9] og næste generation sekventering [10]. Men ingen af ​​de metoder, der er blevet anvendt hidtil er ideelle, og hver af disse metoder har begrænsninger, der for det meste vedrører følgende karakteristika prøver kræft: (i) diversificeret typer af tumor prøver til rådighed for analyse (kirurgisk, biopsi), (ii) kontaminering med normale celler, (iii) den genetiske heterogenitet af tumorer, (v) ofte lave frekvens af de analyserede mutationer, (iv) nedbrydning af DNA, og (v) tab eller modifikation af DNA [de to sidstnævnte faktorer også gælde for formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) prøver, som er de hyppigst tilgængelige prøver]. De alvorligste problemer som følge af de begrænsninger af tumor analysen er falsk negative og falsk positive fejl, der kan føre til misklassifikation og utilstrækkelig behandling af cancer. Derfor, for at reducere den del af forkert klassificerede prøver, det blev for nylig foreslået i evidensbaseret retningslinje af tre faglige selskaber (College of American Pathologists, internationale foreninger for Studiet af lungekræft, og Foreningen for Molekylær Patologi), at hvis det er muligt,

EGFR

mutation test bør udføres med to metoder (en to-delt test strategi). Denne guideline repræsenterer molekylære lungekræft test state-of-the-art og blev i fællesskab udgivet i tre tidsskrifter [11-13]. For enkelhed vil vi efterfølgende kun henvise til [11]. Dette todelt metode bør baseres på forskellige mutation afsløring principper og bør dække forskellige intervaller af følsomhed, som består af standard-følsomhed og høj følsomhed metoder.

I denne undersøgelse testede vi over 200 NSCLC prøver med brug af to komplementære metoder, en rutinemæssigt anvendes kommercielt RT-PCR assay (en høj følsomhed metode) [9] og en ny multiplex ligation-afhængig sonde forstærkning (MLPA) -baserede EGFRmut + assay (en standard-følsomhed, andenrangs metode ) [14]. Vores analyse viste en høj overensstemmelse mellem disse to metoder, og dermed bevist pålidelighed og nytten af ​​EGFRmut + analysen som en andenrangs metode til

EGFR

mutation test. Med brugen af ​​disse metoder, vi karakteriseret og anslået frekvensen af ​​somatiske

EGFR

mutationer i et sæt prøver lungekræft fra det centrale Polen. En yderligere fordel ved EGFRmut + assayet er, at det tillader en mutation analyse og relative kopiantal bestemmelse (dvs. opformering detektion) parallelt. Vi brugte denne metode til at finde en meget stærk sammenhæng mellem

EGFR

forstærkning og forekomsten af ​​

EGFR

mutationer og til at bestemme den ru hyppighed af mutant alleler i vores analyserede prøver.

Materialer og metoder

Valg og behandling af NSCLC prøver til molekylær analyse

Vi retrospektivt revideret en kohorte af 239 patienter med histopatologisk bekræftet NSCLC diagnosticeret 2011-2012 på Franciszek Lukaszczyk Oncology center i Bydgoszcz (centrale Polen). Alderen af ​​patienterne varierede fra 35 til 81. I alt 239 prøver, der bestået kvalitetskontrol trin (mikroskopisk analyse og tumor indhold kvalifikation samt kvalitative og kvantitative DNA-analyse) blev opnået efter 143 operationer, 91 fine-nål aspiration ( FNA) procedurer, og fem endobronkial ultralyd med guidede transbronkial nål aspiration (eBUS-TBNA) procedurer eller pleurale fluid prøvetagninger. Prøverne blev farvet med hæmatoxylin og eosin til kvalitativ og kvantitativ analyse af tumorceller i det analyserede materiale (herunder macrodissection i afmærkede prøver). Kvalifikationen af ​​biologisk materiale til molekylær analyse var baseret på de tidligere beskrevne kvalitative og kvantitative skalaer for cytologiske [9] og histologisk [15] materiale. Informeret skriftligt samtykke til gentest, der er godkendt af F. Lukaszczyk Oncology Center i Bydgoszcz blev opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af vores lokale etiske komité, Bioetik Komité Ludwig Rydygier Collegium Medicum i Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University i Torun . Data blev analyseret anonymt.

DNA isolation

DNA isolation blev udført efter macrodissection i en region angivet af pathomorphologist. Genomisk DNA blev isoleret fra FFPE adenocarcinom væv eller cytologiske udstrygninger ved anvendelse af en QIAamp FFPE Mini Kit (QIAGEN) i overensstemmelse med producentens instruktioner med de følgende modifikationer. Vi resuspenderet pellet i 180 pi Tissue Lysis Buffer med 20 pi proteinase K, og derefter hvirvlet og kontinuerligt rystede cellepelleten med korte intervaller under inkubation natten over ved 56 ° C. DNA mængde og kvalitet blev vurderet ved NanoDrop absorbans analyse og agarosegelelektroforese.

Mutation analyse af Real-Time PCR

RT-PCR metode bruger mutationsspecifikke sonder til at evaluere 29 punktmutationer , herunder T790M-mutationen (EGFR-RT52, Entrogen, Inc., Tarzana, CA). En DNA-mængde af 200-650 ng var passende til påvisning af 29 mutationer i prøver af interesse; de interne kontrol VIC fluorescerende prober og

EGFR

fluorescerende prober blev FAM farvestof-mærket. De forstærkning kurver blev evalueret i overensstemmelse med anbefalingerne fra producenten.

Mutation og forstærkning analyse af MLPA

MLPA analyse blev udført med anvendelse af en specialdesignet EGFRmut + assay, som tidligere har været beskrevet mere detaljeret [14]. Denne analyse samtidigt tillader påvisning af onkogene

EGFR

mutationer og en analyse af kopien nummer (forstærkning detektion) af

EGFR

,

MET

, og

ERBB2

. Alle reagenser undtagen EGFRmut + probe mix blev indkøbt formular MRC-Holland Amsterdam, Holland (www.mlpa.com). De MLPA reaktioner blev kørt ifølge producentens generelle anbefalinger (MRC-Holland), som beskrevet tidligere i [16,17]. Kort beskrevet blev 5 pi af genomisk DNA (i en koncentration på ca. 20 ng /nl) inkuberet ved 98 ° C i 5 minutter, afkølet til stuetemperatur og blandet med 1,5 pi EGFRmut + prober mix og 1,5 pi SALSA hybridiseringspuffer. Reaktionen blev derefter denatureret ved 95 ° C i 2 minutter og hybridiseret ved 60 ° C i 16 timer. De hybridiserede prober blev ligeret ved 54 ° C i 15 minutter ved tilsætning af 32 pi ligeringsblanding. Efter varmeinaktivering blev ligeringsreaktionen afkølet til stuetemperatur, blandet med 10 pi PCR-blanding (polymerase, dNTP’er og universelle primere, hvoraf den ene blev mærket med fluorescein) og udsat for PCR-amplifikation i 35 cykler. De MLPA produkter blev efterfølgende fortyndet 20x i Hidi formamid indeholdende GS Liz600, der blev anvendt som en DNA dimensionering standard, og separeret via kapillær elektroforese (POP7 polymer) i en ABI Prism 3130XL apparat (Applied Biosystems). De opnåede elektroferogrammer blev analyseret under anvendelse GeneMarker software v1.91 (2.4.0). De signalintensiteter (tophøjderne) blev hentet og overført til forberedt Excel-ark (kan rekvireres). For hver enkelt prøve blev signalintensiteten af ​​hver probe divideret med den gennemsnitlige signalintensitet af kontrol prober til at normalisere de opnåede værdier og at udligne run-to-run variation, og den normaliserede værdi for hver top blev derefter opdelt af en tilsvarende værdi i referenceprøverne og ganges med 2. den endelige MLPA resultat af hver prøve præsenteres på bar-plot, hvor søjler viser det relative kopi talværdi af de efterfølgende sonder.

EGFR kopi nummer analyse af kvantitativ PCR (qPCR) og dråbe digital PCR (ddPCR)

qPCR-analyse blev udført med anvendelse af MESA GREEN qPCR MasterMix Plus for SYBR Assay (Eurogentec, Seraing, Belgien), ifølge producentens generelle anbefalinger. ddPCR blev udført med anvendelse af QX200 systemet og EvaGreen Supermix (BIO-RAD, CA, USA) ifølge producentens generelle anbefalinger, som tidligere beskrevet [18,19]. Den ddPCR analyse blev udført i en multiplex-format med co-forstærkning af kontrol-amplikon og en af ​​de test-amplikoner i en reaktion. For at opnå en korrekt adskillelse af dråber typer, blev intensiteten af ​​test og styresignal differentieret efter ‘længde og primere’ amplikoner koncentrationer. For begge metoder det samme sæt af PCR primere blev anvendt: (i) test-amplikon for

EGFR

exon 2: fremad primer GCAGTTGGGCACTTTTGAAG, reverse primer TTCCAAATTCCCAAGGACCA (koncentration i qPCR-300 nM, koncentration i ddPCR-100 nM , amplicon længde 83 bp); (Ii) test-amplikon for EGFR exon 18: fremad primer TTGTGGAGCCTCTTACACCC, revers primer CCTTCAAGATCCTCAAGAGAGC (koncentration i qPCR-300 nM, koncentration i ddPCR-100 nM, amplicon længde 64 bp); (Iii) kontrol-amplicon: forward primer GCTGACCTGTTGGCTGAAAA, revers primer GAATCGCTGTGGCCTTGATG (koncentration i qPCR-300 nM, koncentration i ddPCR-200 nM; amplicon længde 113 bp). De amplikoner enten overlappede, eller var tæt placeret til følgende MLPA sonder: EGFR_e2, EGFR_e18 og ctrl_1 hhv. Den optimerede annealingstemperatur blev sat til 59 ° C og 58 ° C, i qPCR og ddPCR henholdsvis

Resultater

Alle 239 prøver blev analyseret som blinde prøver ved to metoder:. (I) en kommerciel RT-PCR-analyse (EGFR-RT52, Entrogen Inc.), der dækker 29 af de mest almindelige onkogene mutationer i exon 18, 19, 20 og 21 i

EGFR

(for detaljer, se fabrikanter hjemmeside; https://www.entrogen.com/web2/egfr-mutation-analysis-kit) og (ii) en specialdesignet MLPA assay (EGFRmut +), som samtidig muliggør påvisning af amplificeringer og små mutationer i

EGFR

(for detaljer se [14]) (fig. 1). Kort fortalt, ud over de faste doseringsformer-sensitive (DS) prober, den EGFRmut + analyse er også sammensat af to typer mutation-følsomme prober. Mutation-følsom (MS) sonder er typer af DS sonder, der er specifikke for vildtype-sekvens, men overlapper de steder følgende mutationer: G719A /S /C (G719X) i exon 18 (sonde E18), in- frame deletioner i exon 19 (sonde E19), S768I og i-frame indsættelser i exon 20 (probe e20-1), T790M i exon 20 (probe e20-2) og L858R i exon 21 (sonde E21). Forekomsten af ​​en af ​​disse mutationer i en analyseret prøve forårsager et fald i signalet i den tilsvarende MS probe. Den EGFRmut + analysen indeholder også tre mutation-følsom (MS +) sonder, der er specifikke for mutant sekvenser. Signalerne fra disse prober kun forekomme, hvis den tilsvarende mutationen er til stede. To af disse prober genkender sekvenserne af de mest almindelige

EGFR Salg mutationer (den mest almindelige i ramme deletion i exon 19, c.2235_2249del15 (probe E19 +) og L858R (probe E21 +)), og den tredje erkender den T790M-mutationen, som er forbundet med TKI modstand (probe e20-2 +). Derudover EGFRmut + indeholder et par DS prober, som er specifikke enten til

MET

eller

ERBB2

der tillader amplifikationer af disse gener, der skal påvises.

A) Map of the

EGFR

gen med placeringen af ​​de RT-PCR amplikoner (EGFR-RT52) og MLPA prober (EGFRmut + assay) angivet (lodrette linjer under kortet). De mutation-følsomme EGFRmut + sonder er angivet med rødt. Positionerne af onkogen

EGFR

mutationer er angivet over kortet. B) RT-PCR resultater, der afspejler (fra toppen) (i) referenceprøven (en prøve uden mutationer eller amplifikation), (ii) en prøve med den mest almindelige i ramme deletion i exon 19 (c.2235_2249del15) , (iii) en prøve med både L858R i exon 21 og T790M i exon 20, og (iv) en prøve med en i-ramme deletion i exon 19 (c.2235_2249del15) og

EGFR

amplifikation. I hver graf, de overlappende resultater af de 8 RT-PCR-reaktioner, der dækker 29

EGFR

mutationer er vist. De røde linjer angiver de positive forstærkning-kurver for specifik

EGFR Salg mutationer (pegede på grafen), og den grønne basislinie betegner den ikke-forstærkede signal på grund af manglen på den evaluerede mutation i den analyserede prøve. C) MLPA elektroferogrammer af prøver analyseret ved RT-PCR (panel B). De probe id’er er angivet under elektroferogrammer. Stjernerne viser kontrol- sonder; de lyserøde pilespidser indikerer reduceret signal af MS-sonder og øget signal af MS + sonder henholdsvis; og de sorte pilespidser indikerer forstærkede signaler fra

EGFR

-specifikke prober. D) Bar plots svarende til Elektroferogrammerne vist i panel C og repræsenterer det normaliserede kopital værdi (y-aksen) af hver probe (x-aksen). De lyserøde pilespidser indikerer et reduceret kopi talværdi af MS-sonder og et øget kopi talværdi af MS + sonder, henholdsvis.

Karakteristik af den fundne mutationer

I alt vi opdaget 30 mutationer i 29 ud af 239 prøver (12,1%). Både L858R og T790M blev fundet i en prøve. Blandt de identificerede mutationer var 16 i-ramme-deletioner i exon 19 (53%), 9 substitutioner L858R (30%), 2 substitutioner L861Q (7%), en substitution G719X, en in-frame insertion i exon 20 og en substitution T790M (S1 tabel; opsummeret i tabel 1). De mutationer var langt hyppigere hos kvinder 22/68 end hos mænd 7/142 (24,4% versus 4,7%, henholdsvis; p 0,0001). En lagdeling af mutationen frekvens efter alder [ 55 (13%), 55 (11,9%)] og prøvetype [FFPE (11,9%), cytologiske prøver (12,5%)] viste ikke signifikante påvirkninger af disse faktorer på mutation frekvens (tabel 1). Vi også observere et fald i mutationsfrekvensen i prøver med en lavere procentdel af tumorceller (PTC). Bemærk dog, at kun en lille fraktion (ca. 5%) af de analyserede prøver havde PTC≤30%.

Sammenligning af RT-PCR og MLPA mutation påvisningsmetoder

Der er ingen gold standard metode til mutation påvisning i kræft prøver, hvor en bestemt mutation kan tegner sig for en meget lille brøkdel af den analyserede DNA. Derfor, for at evaluere kvaliteten af ​​MLPA-baserede EGFRmut + assay vi sammenlignet det med rutinemæssigt anvendt og godt validerede RT-PCR-metoden. En direkte sammenligning af resultaterne af RT-PCR og MLPA viste en meget høj overensstemmelse mellem disse to metoder (98,7% overensstemmende resultater) samt 100% specificitet (ingen falske positive) og 90% følsomhed (27 af 30 mutationer detekteret) af EGFRmut + test. Blandt de 3 mutationer, der ikke blev opdaget af EGFRmut + analysen var to tilfælde med L861Q substitution, som ikke er omfattet af EGFRmut + prober (fig. 1A), og én G719X mutation i en prøve med en lav PTC (15%). Derudover blandt de analyserede ved MLPA prøver var 4 blinde dubletter med 3 forskellige mutationer. I alle tilfælde er resultaterne fra de to prøver var overensstemmende. Desuden skal det bemærkes, at MS + prober (signal forekomst) detektere mutationer lettere og med en højere tillid end MS prober (signal fald). De MS + sonder tillod selvsikker påvisning af mutationer, selv når disse mutationer udgør en meget lille brøkdel af den analyserede DNA (~ 10%) i prøverne med PTC≤30%. For eksempel kunne L858R mutation, som er dækket af både MS + og MS prober, i tre prøver, ikke detekteres ved et fald i signalet fra MS-probe men blev let detekteret ved forekomsten af ​​en lav, men klart signal af MS + probe. Den lavere følsomhed MS sonder hovedsagelig kom fra den relativt høje signal variation af DS sonder i prøver kræft. Jo større MLPA signal variation i prøver kræft er blevet observeret tidligere og resultater for det meste fra den genetiske heterogenitet af prøver kræft [20] og lavere kvalitet og hyppige nedbrydning af DNA-prøver isoleret fra FFPE væv [21-25].

Amplifikation af EGFR, MET og ERBB2 og dens relation til mutationsfrekvens

den yderligere fordel ved MLPA assayet er, at der ud over detektion af mutationer, det giver også oplysninger om en relativ kopitallet af alle analyserede sekvenser /prober . Det giver et groft skøn over den del af fundne mutationer i analyserede prøver og tillader påvisning af kopi nummer ændringer (amplifikationer) i de analyserede gener:

EGFR

,

MET

og

ERBB2

. Definition relative kopi nummer 3-4 som en “gevinst” og ≥4 som en “forstærkning”, identificerede vi 12 (5%), 17 (7%) og 2 (1%) prøver med gevinster og 7 (3%) , 11 (5%) og 3 (1%) prøver med amplifikationer af

EGFR

,

MET

, og

ERBB2

henholdsvis (S1 tabel og fig. 2 ). Fordelingen af ​​kopiantal amplitude var ens for alle 3 gener, med de største amplifikationer over 10 kopier. Som i tilfælde af mutationerne, vi observerede en meget højere frekvens af

EGFR

gevinster /amplifikationer hos kvinder end hos mænd (18% versus 2%, henholdsvis; p 0,0001). En lignende tendens blev ikke observeret for

MET Hotel (13% mod 11%), og en omvendt, men blev observeret ikke signifikant tendens til

ERBB2

(1% mod 3%).

A) Eksempler på

EGFR

(prøver v-vi),

MET

(prøver vii-viii) og

ERBB2

(prøver ix-x) amplifikation detekteres af EGFRmut + assayet. B) Karakteristik af prøver med

EGFR

,

MET

og

erbB2

gevinster /amplifikationer. Prøverne i fig. 1D (ii-iii) og fig. 2A (vi-x) er angivet i den første kolonne. Den sex og

EGFR

mutation status for hver prøve er angivet i den anden og den tredje kolonne, hhv. Kolonner 4-6 viser kopi talværdier af

EGFR

,

MET

ERBB2

hhv. De mørke blå celler indikerer amplifikationer (kopi nummer ≥4), og de lyseblå celler indikerer gevinster (kopi nummer 3-4). C) Hyppigheden af ​​

EGFR

mutationer i prøver med

EGFR

forstærkning,

EGFR

gevinst og normal

EGFR

kopi nummer.

Som vist i fig. 2, de gevinster og amplificeringer af

EGFR

,

MET

og

ERBB2

var gensidigt udelukker hinanden. Men vi observerede meget stærk sammenhæng mellem forekomsten af ​​

EGFR

mutationer og

EGFR

forstærkning (Chi square test for trend; p 0,0001). Alle undtagen én kræft prøve (90%) med

EGFR

forstærkning og 7 ud af 12 prøver (58%) med

EGFR

gevinst havde en

EGFR

mutation.

En omhyggelig gennemgang af MLPA resultater med

EGFR

amplifikationer (se eksempler i fig. 1 og fig. 2) viser, at signalet faldet fra MS-sonder og signalet forhøjelse af MS + sonder (fraktion af muterede kopier) er omtrent den samme eller endnu større end stigningen i

EGFR

kopi nummer. Dette resultat antyder, at alle de amplificerede kopier af

EGFR

i de mutante prøver indeholder mutationen (dvs. at kun den mutante allel undergår amplifikation), og at mutationer forekommer som en tidlig udløsende hændelse, hvilket gør

EGFR

forstærkning til gavn for kræft. Bemærk, at alle prøverne indeholder en vis mængde af normalt DNA, som kan tromle de observerede kopital ændringer og maskere effekten i prøver med et lavere niveau af amplifikation.

Denne observation fik os til sekventering exonerne 18-21 (der koder for tyrosin kinase domæne) i prøver med

EGFR

gevinster /amplifikationer, hvor ingen kendte

EGFR

mutation blev fundet. Den sekventering analyse afslørede ingen nye sekvens varianter, der kunne være onkogene mutationer eller udløser

EGFR

forstærkning.

Replikering af EGFR kopi nummer analyse (forstærkning detektion) med brug af qPCR og ddPCR

for at bekræfte resultaterne af

EGFR

kopi nummer analyse, vi analyseres igen et panel af prøver kræft, herunder alle prøver med

EGFR

forstærkning, med brug af qPCR og ddPCR. Begge metoder er baseret på helt andre principper end MLPA. Den qPCR er en metode udnytter real-time kvantificering af PCR-produkt, mest brugt til kontrol af kopital varianter, identificeret i både normal (ikke-kræft) og kræft prøver (fx [26,27]). Den ddPCR er en ny kvantificering metode, baseret på absolut optælling af testede og reference-DNA-molekyler, klonalt opformerede i tusindvis af vand-i-olie-droplet-reaktioner (emulsion PCR). Nytten af ​​ddPCR med EvaGreen dsDNA-bindende farvestof til præcis kopi-nummer estimering blev for nylig påvist i flere undersøgelser [18,19,28]. Med brugen af ​​både qPCR og ddPCR, signalerne fra to test-amplikoner, beliggende i exon 2 og exon 18 af

EGFR

, blev analyseret i forhold til signalet af kontrol-amplikon (svarende til MLPA sonde ctrl_1). Den udførte analyse viste, at resultaterne af både qPCR og ddPCR korrelerer meget godt med de relative kopiantal værdier, bestemt med anvendelse af MLPA (korrelationskoefficient R = 0,941 og R = 0,927, henholdsvis), og at signalerne fra prøver med

EGFR

amplifikation var godt adskilt fra signaler af prøver uden amplifikation (S1 fig.). Det skal dog bemærkes, at det ikke kan udelukkes, at nogle prøver med borderline kopiantal værdier kan fejlklassificeres. Nogle uoverensstemmelser i de absolutte signalværdier, bestemt ved MLPA, og de referencemetoder kan skyldes forskellige sæt kontrol regioner, der anvendes til normalisering og af, at MLPA er en multiplex metode, og det måler antal kopier i flere punkter i et gen af interesse. Lignende resultater blev opnået for

MET

ERBB2

(data ikke vist).

Diskussion

Det er velkendt, at frekvensen af ​​

EGFR

mutationer varierer betydeligt mellem befolkningsgrupper. Mutationsfrekvensen er højest i asiater (45-52%); lavere i europæere (24%), afroamerikanere (20%) og latinamerikanere (17%); og lavest i White australiere (7%) ([11,29] og referencer inden for). Også blandt europæerne, forskellige frekvenser af

EGFR

mutationer blev rapporteret: f.eks 17% i Spanien [30] og 10% i det sydlige Tyskland [31]. I denne undersøgelse, baseret på en omfattende analyse af et væsentligt antal lunge adenocarcinom prøver, vi karakteriseret og bestemt hyppigheden af ​​

EGFR

mutationer i polske patienter (12,1%). Vores analyse viste en meget højere (4,8x) hyppigheden af ​​

EGFR

mutationer i kvinder end hos mænd (24% vs. 5%, henholdsvis). Vi observerede en lignende tendens for

EGFR

gevinster /amplifikationer, som viste endnu større overrepræsentation (9x) hos kvinder end hos mænd (18% vs. 2%, henholdsvis). Selvom den højere frekvens af

EGFR

mutationer i kvinder end hos mænd er blevet observeret mange gange før, at overrepræsentation af

EGFR

mutationer i observeret i vores undersøgelse kvinder er ifølge vores viden, en af den højeste rapporterede hidtil (bortset undersøgelserne med en meget lille antal prøver /mutationer) ([11,29] og referencer inden for). Oplysningerne om befolkningens specifikke kendetegn og hyppigheden af ​​mutationer er vigtige epidemiologiske faktorer, der kan påvirke gennemførelsen af ​​passende diagnostiske og behandlingsmæssige procedurer optimale for bestemt befolkningsgruppe.

Molekylær kræft bilinspektionsteknikere fat diversificeret heterogen tumor materiale på daglig basis. DNA isoleres fra kirurgisk resektion tumorer (friske eller FFPE) og fra fin nål og endobronchiale ultralyd transbronkial nål indsugning celler. Hvert af disse histologiske eller cytologiske prøver kan have forskellige og undertiden meget lav PTC, og de viser ofte en betydelig grad af DNA-nedbrydning (især FFPE prøver). Derudover kan formalinfiksering beskadige DNA og føre til sekvensmodifikationer. Alle disse faktorer forårsager forskellige typer artefakter, der kan føre til både falsk-positive og falsk-negative resultater.

I denne undersøgelse testede vi en EGFRmut + MLPA assay (en standard-følsomhed metode) som en anden- tier metode og sammenlignet vores resultater med dem af et godt valideret kommerciel RT-PCR-analyse (en højfølsom metode). Disse to metoder er baseret på helt andre principper. I RT-PCR, er mutationsdetektion baseret på hybridiseringen af ​​TaqMan mutationsspecifikke prober, men i MLPA, er mutationsdetektion baseret på ligering og efterfølgende amplifikation af vildtype eller mutationsspecifikke prober. Vores resultater viser, at EGFRmut + er en robust assay, der udviser høj reproducerbarhed, specificitet og følsomhed. Et lille antal uopdagede mutationer blev enten ikke er omfattet af MLPA prober (n = 2) eller forekom i en prøve med en lav PTC (n = 1). Den EGFRmut + assayet tilladt os at påvise mutationer i alle typer af prøver (cytologiske og histologiske, frisk frosset og FFPA) og tilladt os at påvise mutationer i prøver med forskellige PTC’er (20-90%). Dog skal det bemærkes, at MS + sonder tillade mere robust mutation afsløring end MS sonder gøre, og at kvaliteten af ​​MLPA resultater er generelt lavere for prøver kræft end for kim-line DNA-prøver. Den lavere kvalitet af kræft MLPA resultater skyldes de førnævnte karakteristika prøver kræft og er blevet rapporteret og diskuteret tidligere [23-25,32]. Yderligere faktorer, der gør MLPA analysen attraktiv som andenrangs

EGFR

mutation påvisningsmetode er den lave mængde DNA (50-100 ng), der kræves til analyse (ingen ekstra prøve udvinding eller tilberedning er påkrævet, og det samme DNA-prøve kan bruges til både RT-PCR og MLPA analyse), en kort turn-around tid ( 2 dage), og lave omkostninger (omkring $ 5 plus de indledende udgifter til sonde syntese, ca $ 3000). I tilfælde af rutinemæssigt anvendte assays, kan omkostningerne til probesyntese ignoreres, fordi mængden af ​​de syntetiserede prober er tilstrækkelig for hundredtusindvis af analyser.

Udover

EGFR

mutationsdetektion