PLoS ONE: Nye decapeptider at Bind begærligt og Deliver Radioisotopaffald til Colon Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Den hastigt voksende område af målrettede tumor terapi ofte udnytter et antistof, undertiden mærket med en tumor -ablating materiale såsom radioisotop, rettet mod en bestemt molekyle.

Metode /vigtigste resultater

Denne rapport beskriver opdagelsen af ​​ni nye decapeptider, kan radioaktivt mærket, binder sig til, og levere

32P til kolon kræftceller. De decapeptider varierer fra hinanden med en til tre aminosyrer og demonstrere vidt forskellige bindende evner. Den mest ivrigt bindende decapeptid kan permanent levere meget høje niveauer af radioisotop til adenocarcinom cancercellelinier med en effektivitet 35 til 150 gange større end for en række andre celletyper, herunder cellelinjer afledt af andre typer af cancer eller fra normalt væv.

konklusioner /betydning

Denne eksperimentelle tilgang repræsenterer en ny eksempel på en strategi, der betegnes peptid bindende terapi, til potentiel behandling af kolorektal og andre adenokarcinomer

Henvisning:. Abraham JM, Sato F, Cheng Y, Paun B, Kan T, Olaru A, et al. (2007) Nye decapeptider at Bind begærligt og Deliver Radioisotopaffald til Colon Cancer Cells. PLoS ONE 2 (10): e964. doi: 10,1371 /journal.pone.0000964

Academic Redaktør: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA

Modtaget: 11. juli, 2007; Accepteret: 12. september 2007; Udgivet: 3 oktober 2007

Copyright: © 2007 Abraham et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 og 7R21 /R33CA106763 fra National Cancer Institute

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Sygdom og død på grund af kolorektal og kræft i spiserøret udgør en monumental sundhedsvæsen udfordring i USA og i hele verden [1], [2]. Aktuelle behandlinger omfatter strålebehandling, kirurgi og kemoterapi. Der er en række immunterapier godkendt til anvendelse i behandlingen af ​​forskellige cancertyper (

e.g.

Herceptin, Rituxin til behandlingen, Avastin, og andre.) [3] – [6]. Alle disse immunoterapi anvender et monoklonalt antistof rettet mod en specifik cellulær molekyle [7], [8]. Destruktiv handling mod tumorceller menes at involvere ADCC (antistof-afhængig cellulær cytotoksicitet), cellelysis via komplement pathway, eller induktionen af ​​apoptose [9], [10]. Avastin er et monoklonalt antistof rettet mod VEGF (vaskulær endotel vækstfaktor) og er godkendt til behandling af colorektal cancer [11] – [13].

Desuden Non-Hodgkins lymfom (NHL) er for tiden behandles med to godkendte radioimmunotherapeutic regimer: Bexxar og Zevalin. Begge anvender et monoklonalt antistof rettet mod det B-celle-markør CD20 og kan levere enten

131I (Bexxar) eller

90Y (Zevalin) isotoper at målrette lymfomceller [14], [15]. Beta-partikler (elektroner), der genereres af disse isotoper kan dybt trænge celler og skader DNA, hvilket fører til celledød. Men der er i øjeblikket ingen radioimmunotherapies godkendt til behandling af patienter med tarmkræft.

De heri beskrevne decapeptider binde sig til og overførsel isotop (

32P) til celle linjer afledt fra flere kolorektale karcinomer. Under identiske eksperimentelle betingelser, meget lidt (

viz.,

Mindre end 1% af coloncancer cellelinier kurser “) af den mest effektive

32P-mærkede decapeptider binder til cellelinjer etableret fra en række andre kræftformer eller til normal colon, nyre, eller esophageal celler.

Resultater

Vi har identificeret ni decapeptider, der afviger fra hinanden med kun nogle få aminosyrer, at når de er mærket med

32P kan binde til en række kolorektale carcinom-cellelinier. Alle decapeptider indeholder en proteinkinase A substrat sekvens og er betegnet som storbyområder (Modified adjuvans). Figur 1 er en skematisk repræsentation af fremstillingen af ​​de

32P-mærkede peptider og det eksperimentelle design af assays til at måle binding af peptider til cellelinier.

En bakteriel rekombinant ekspressionssystem produceret forskellige gluthathion-S- transferase decapeptid fusionsproteiner der var bundet til gluthation og mærket med

32P udnytte proteinkinase A. efter vask blev de mærkede decapeptider udvundet efter thrombin fordøjelse og inkuberet ved forskellige tidspunkter med flere forskellige cellelinjer.

Figur 2 viser antallet af

32P tæller per minut (cpm) resterende bundet til atten forskellige cellelinjer og tomme brønde efter en to timers inkubation med MA5, den mest effektive bindende decapeptid (se nedenfor). Caco-2 colonadenocarcinomcellelinje bibeholdt det største antal radioaktive tællinger efter en to timers inkubation og efterfølgende vaske med komplet medium, gennemsnitsværdien af ​​tredobbelte brønde svarende 298.639 cpm pr 10.000 celler. HCT116 colonadenocarcinom celler bibeholdt en gennemsnitsværdi på 131.998 cpm pr 10.000 celler. Blanke brønde og ikke-bindende cellelinjer havde middelværdier af mindre end 550 cpm; stænger repræsenterer disse værdier ikke er synlige på skalaen anvendes i figur 2. For eksempel HeLa S3 cervikal cancerceller kun bevaret i gennemsnit 534 cpm pr 10.000, HT1080 fibrosarcomceller beholdt 367 cpm, og den humane embryoniske nyrecellelinie 293H beholdt 429 cpm per 10.000 celler.

32P mærket decapeptidet MA5 blev inkuberet i to timer med 10.000 celler, vasket tre gange, og de radioaktive tællinger af cellerne bestemt ved scintillationstælling. Syv cellelinjer demonstrerede ivrig binding af MA5 og er vist som søjlediagrammer af middelværdien og én standardafvigelse i tredobbelte brønde. De resterende elleve cellelinjer, sammen med en blank brønd i gennemsnit kun 365 CPM. Disse værdier er så små, at de ikke kunne ses på den skala, der anvendes i denne figur. Yderligere oplysninger om de enkelte cellelinjer findes i supplerende Information.

Syv af de atten cellelinjer demonstrerede meget stærk fastholdelse af radioaktivitet, når de inkuberes med MA5 (modificeret Adjuverende radioaktivt peptid) med fem af disse er kolon adenocarcinom cellelinier (Caco-2, HCT15, HCT116, LoVo, HT29), det ene er en esophageal adenocarcinom cellelinie (SEG1), og det ene er en Barretts øsofagus cellelinie (QHTRT). I modsætning hertil elleve-bindende cellelinjer var hovedsagelig skællede cellelinier afledt fra carcinomer i cervix (HeLa S3), colon (RKO), lunge (1271, A549), spiserør (Kyse-70), en fibrosacroma (HT1080), eller celler dyrket fra normal nyre (293H), colon (1459), eller spiserøret (HEEpiC). Ikke-bindende cellelinier inkluderet T84, afledt af et kolon adenocarcinom metastatisk til lungen, og SK-BR-3, isoleret fra et brystadenocarcinom. Forholdet mellem cpm tilbageholdes af Caco-2 (298.639) til gennemsnittet af de elleve-bindende cellelinier (365) var 818:1. Caco-2-celler bibeholdt ca. 18% af de totale radioaktive tællinger til stede i inkubationen godt efter to timers inkubation.

Ni MA varianter blev analyseret for tilslutning til Caco-2-celler efter to timers inkubation. Den relative binding niveau og aminosyresammensætningen af ​​hver MA variant er vist i figur 3A. Ændring af kun en til tre aminosyrer i peptidet resulterede i fastholdelse forskelle så store som 70-fold,

f.eks

i variant MA2

vs.

Variant MA5.

(A) Ni

32P-mærket forskellige decapeptider, varierende fra hinanden ved kun et til tre aminosyrer, blev inkuberet med Caco-2 celler til to timer, cellerne vasket tre gange, og tæller forblive bundet til cellerne vist som en procentdel af det samlede tællinger for hver decapeptid anvendes. Aminosyresubstitutioner for hver variant (i forhold til MA1) er understreget og fed. (B) De varianter, MA1, MA4, og MA5 blev inkuberet med Caco-2 celler til intervaller varierende fra fem minutter til to timer, vaskes, de adhærente celler opløst i gelloadningspuffer og en alikvot kørt på en 10% -20% gradient polyacrylamid-SDS-gel. De tre baner mærket “24h” (bane 5, 10 og 15) blev inkuberet med de respektive mærkede decapeptider (MA1, MA4, MA5) i to timer, vasket og cellerne inkuberet med komplet medium i 24 timer. Cellerne blev behandlet som beskrevet for de andre baner i denne figur.

For at undersøge, hvor hurtigt

32P isotop kunne overføres fra peptidvarianter og indarbejdet i cellulære proteiner, de tre mest begærligt bindende storbyområder (se figur 3A) blev tilsat til replikere brønde indeholdende Caco-2-celler, derefter vasket væk med varierende tidsintervaller og cellerne og supernatanten analyseres. Som vist i figur 3B, betydelige procentdele af disse

32P-mærket variant decapeptider bundet til celler inden for kun et par minutter, med store mængder af radioaktivt mærkede cellulære proteiner, der opstår i to timer efter eksponering af celler for de mærkede peptider. Især blev et parallelt forsøg, hvor betingelserne beskrevet i figur 3 duplikeres, men vaskede celler blev inkuberet

overnight

i komplet medium (data ikke vist), afslørede stadig tilsvarende niveauer af

32P-decapeptid frigivelse og fastholdelse for alle ni forvaltningsmyndigheder, som beskrevet for MA5 i Figur 2.

peptid binding, vask og assay eksperiment beskrevet for figur 2 blev derefter gentaget i de syv mest begærligt bindende cellelinjer bruger MA5, bortset fra, at efter tre vasker medium, blev 200 ul komplet medium tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet

overnight

ved 37 ° C. Figur 4A viser cpm tilbageholdt af celler eller frigives i mediet efter dette inkubation natten over. Ca. 88% af MA5 radioaktive tællinger oprindeligt tilbageholdt af tyktarmskræft cellelinjer blev frigivet ud i mediet, mens ca. 12% af oprindelig bevaret radioaktive tællinger blev tilbageholdt af celler. De to esophageal cellelinier, der oprindeligt tilbageholdte store mængder af radioaktive tællinger, QH-TRT og SEG1, beholdt 39% og 37% af deres oprindelige tæller, henholdsvis efter inkubation natten over. Caco-2-celler bibeholdt det største antal tællinger, gennemsnitligt 58.305 cpm i tredobbelte brønde indeholdende 10.000 celler hver. Dette tal udgør ca. 5,8 cpm, eller 348 tællinger i timen, per celle (

dvs.

når ekstrapoleres over en potentiel eksponering periode 2-ugers, svarende til mere end 87.000 tællinger per celle).

(A)

32P-mærket decapeptid MA5 blev inkuberet i to timer med syv forskellige cellelinier, blev cellerne vasket, og komplet medium blev tilsat. Efter en 24 timers inkubation, forbliver antallet af tællinger per minut frigives til mediet (R) såvel som antallet af tællinger bundet til cellerne (B) blev bestemt. Hver søjle viser den gennemsnitlige og én standardafvigelse af tredobbelte brønde. (B) Tidsforløb for frigivelse og fastholdelse af den

32P-mærket decapeptid MA5. MA5 blev inkuberet i to timer med Caco-2-celler, cellerne vasket, og cpm frigjort (stiplet linie) samt resterende bundet (optrukket linje) til cellerne bestemt for tidsintervaller efter vask. Hvert punkt viser middelværdien plus /minus en standardafvigelse af tredobbelte bestemmelser. C) radioaktive brøndindholdet beskrevet som bundet (optrukket linje) i figur 4B blev kørt på en 16,5% polyacrylamid-SDS-gel og eksponeret for film. Umiddelbart efter vask (

dvs..,

Ved 0 timer), blev størstedelen af ​​tællingerne visualiseret som

32P-peptid. Løbet af de næste 48 timer, tæller peptidet stærkt formindsket, med størstedelen af ​​bundet radioaktivitet inkorporeret i cellulære proteiner. (D) Aliquoter af medium indeholdende den frigivne (stiplet linje)

32P-peptid MA5 blev analyseret ved tidsintervaller efter vask, som beskrevet i figur 4B. Som tiden skred frem, mere af det

32P-peptid blev frigivet, nåede et plateau ved 24 timer efter vask.

Figur 4B viser tidsforløbet af frigivelsen af ​​MA5 fra Caco-2 adenocarcinom cellelinie over en 48-timers periode. De fleste af de totale tællinger der frigives i løbet 48 timers tidsperiode frigives af ni timers inkubation. Figurerne 4C og 4D består af to autoradiogrammer der viser placeringen af ​​de radioaktive molekyler er beskrevet i figur 4B på polyacrylamid-SDS-geler. Størrelserne af de cellulære radioaktive proteiner i celler er vist i figur 4C;

32P-mærket MA5 frigivet i mediet er vist i figur 4D. Der er tilsyneladende enighed om fordelingen og den samlede radioaktivitet i at sammenligne figur 4B og figur 4C og 4D. Så snart som to timer efter indførelsen af ​​det radioaktive peptid, vises en væsentlig del af isotopen at have været overført til højere molekylvægt proteiner.

Diskussion

Denne rapport beskriver opdagelsen af ​​decapeptider der kan mærkes med en højenergi (1,7 MeV) beta emitter (

32P) og kan binde ivrigt til flere forskellige adenocarcinom cellelinier, effektivt levere dette potentiale tumor-ablation materiale til cellerne. De decapeptider, betegnet MA for Modificeret adjuvans, er protein kinase substrater. Tidligere havde det aldrig blevet påvist, eller mistanke om, at dette substrat, når de er mærket med et tumor-ablation materiale såsom

32P, kunne binde til og overføre den radioaktive isotop til en cellelinje efter en til to timers inkubation. Desuden har vi vist for første gang, at overførslen af ​​isotop fra disse decapeptider er begrænset til celle typer afledt af den primære kolon og esophageal adenokarcinomer. For eksempel eksponering af visse tyktarmskræft cellelinjer

(f.eks

. Caco-2) til den mest begærligt bindende mærket peptid, MA5, for en to-timers periode resulterede i overdragelsen af ​​en radioaktiv dosis på over 29 tællinger per minut per celle efter en to timers inkubation vaskes, og øjeblikkelig bestemmelse af det tilbageholdte radioaktivitet.

inkubation af

32P-mærket decapeptid med visse cellelinier resulterede i store mængder af peptid tilbageholdes efter en to timers inkubation, men en væsentlig andel af denne bundne peptid blev frigivet efter inkubation natten over. For eksempel, efter inkubering af det mærkede variant MA5 med Caco2-celler i to timer, tre vasketrin, og inkubation natten over i medium, 88% af det oprindeligt bibeholdt

32P isotop blev frigivet. Men den 12%, der blev tilbageholdt af celler stadig repræsenterede 5,8 cpm per celle, ekstrapolere til mere end 8300 tællinger per celle per dag. Desuden blev radioaktiviteten, der stadig blev tilbageholdt af celler efter natten over medium inkubation permanent inkorporeret i en række cellulære proteiner, som påvist ved polyacrylamidgelelektroforese af efter eksponering cellelysater Salg

Blandt 18 cellelinier analyseret for deres evne at binde decapeptider, syv demonstrerede meget høj retention af isotop efter to timers inkubation. Selvom alle syv af disse linjer frigivet fra 63% til 88% af denne radioaktivitet efter inkubation natten over, mængden af ​​isotop, der blev bibeholdt natten over er stadig væsentlig. Af disse syv cellelinjer, blev fem afledt fra colorektale adenocarcinomer, en fra en esophageal adenocarcinom, og en fra en Barretts metaplasi prøve. De 11 cellelinier, som ikke bandt det radioaktivt mærkede decapeptidet MA5 blev afledt fra en række forskellige væv oprindelser. Disse omfattede pladecellecarcinomer i cervix, lunge, bryst, og en fibrosarcom, samt normal nyre, tyktarm, og esophageale væv.

Størstedelen af ​​godkendte immunterapeutiske behandlingsplaner for cancer involverer et antistof rettet mod et specifikt cellulære molekyle [16]. Disse midler kan fungere ved at binde til celleoverfladen og kan anvende ADCC, komplementaktivering eller cellulær apoptose. Antistofferne kan også kobles til et tumor-ablation middel, såsom toksiner eller radioisotoper [17] – [21]. Tilsætningen af ​​isotopen med peptider, og deres anvendelse til både diagnostiske og terapeutiske formål, er et aktivt område af biomedicinsk forskning [22] – [25]. Vores arbejde udnytter protein kinase A substrater mærket med

32P isotop. En højenergi beta-emitterende radioisotop resulterer i en elektron vejlængde på op til 5 mm, tillader væsentlig indtrængning af faste tumorer. På grund af en forudsagt “tilskuer” -effekt, vil man beta partikel trænge hundredvis eller tusindvis af celler i tumoren, selv dem ikke direkte bindende decapeptidet. Da molekylvægten af ​​disse meget små decapeptider proteiner er langt lavere end den ekskluderende molekylvægt grænsen for filtrering nyrer, disse peptider skal elimineres hurtigt i urinen, hvilket fører til reduceret systemisk toksicitet. Derved bør det være muligt for både en radioaktiv dosis og ubundet radioaktivitet fjernes nemt og på relativ kort tid. Vi forventer, at yderligere kendte enzymsubstrater sidste ende kan identificeres som potentielle køretøjer til specifikke levering af anti-tumor agenter til kræftceller, og at potentielle kræft behandlingsregimer anvender dette peptid eller andre lignende stoffer kan være den nyeste strategi for peptid binding terapi.

Materialer og metoder

Produktion af

32P-mærkede decapeptider: forskellige DNA-oligomerer blev klonet ind i pGEX-4T-1 (GE Healthcare), som giver forskellige decapeptider efter thrombinspaltning udpeget MA1 gennem MA9 (ændret adjuvans). Proteinsekvenserne er: MA1, GSRRASVGSA; MA2, GSRGASVGGA; MA3, GSRRGSVGSA; MA4, GSRRGSVASA; MA5, GSRRASVASA; MA6, GSRRASVGSG; MA7, GSRGGSVGSA; MA8, GSRGGSVASA; MA9, GSRGGSVGSG. DH5-a bakterier indeholdende disse kloner blev dyrket natten over i LB (indeholdende 100 ug /ml ampicillin), fortyndet 1/10 i LB-Amp og dyrket ved 37 ° C i to timer. IPTG blev tilsat til 1 mM, og kulturen dyrkes ved 37 ° C i fem timer. Ti ml af hver kultur blev centrifugeret, og cellepelleten resuspenderes i 1 X TBS indeholdende 100 ug /ml lysozym. Efter to cykler af frysning-optøning blev lysatet centrifugeret, og supernatanten blev blandet med 100 pi Sepharose-Glutathion i to timer ved stuetemperatur. Hver pellet blev vasket tre gange med 1 X TBS, og de bundne rekombinante fusionsproteiner blev mærket med

32P anvendelse af protein kinase A og

32P-γ-ATP ifølge producentens instruktioner (Sigma, St. Louis, Mo .). . Pelleten blev vasket fire gange med 1 x PBS, og det mærkede decapeptid blev spaltet og frigives til supernatanten med thrombin (GE Healthcare)

Assay af bindingen af ​​

32P-mærkede decapeptider til cellelinier: cellelinier blev dyrket i komplet medium indeholdende 10% bovint føtalt serum (varmeinaktiveret). I hver brønd i en plade med 96 brønde blev 10.000 celler fra forskellige cellelinjer dyrket natten over i komplet medium. Ti pi af det mærkede peptid i 1 X PBS, og 90 pi komplet medium blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C på forskellige tidspunkter af op til to timer. Peptid-mediet fjernet og en pi tilsat til 100 ul gelloadningspuffer og talt ved scintillationstælling for sonden bekæmpelse eller kørt på en polyacrylamid-SDS-gel (Biorad) .De adhærente celler blev kortvarigt og forsigtigt vasket med komplet medium tre gange og nogle brønde blev analyseret umiddelbart ved tilsætning af 100 pi gel loading buffer til hver brønd og kørt på en gel eller talt i en scintillationstæller. Andre brønde havde 100 pi komplet medium tilsat og inkuberet i en yderligere tidsperiode. Prøver blev enten talt i en væskescintillationstæller eller køre på polyacrylamid-SDS-geler, udsat for røntgenfilm, og filmen udviklet.

Tak

Vi takker Dr. Yutaka Shimada (Hyogo College of Medicine, Japan) til gave cellelinie Kyse-70.