PLoS ONE: fordele og risici ved de Hormetic Effekter af kosten isothiocyanater på Cancer Prevention

Abstrakt

isothiocyanat (ITC) sulforaphane (SFN) blev vist på et lavt niveau (1-5 uM) at fremme celledeling til 120-143% af kontrollerne i en række humane cellelinjer, mens ved høje niveauer (10-40 uM) det hæmmede sådan celleproliferation. Lignende dosis respons blev observeret for celle migration, dvs. SFN på 2,5 uM øget celle migration i blærekræft T24 celler til 128%, mens høje niveauer hæmmede celle migration. Denne hormetic sag blev også fundet i en angiogenese assay hvor SFN på 2,5 uM forfremmet endotel rør formation (118% af kontrol), der henviser til 10-20 uM det forårsagede betydelig hæmning. Den præcise mekanisme, hvormed SFN påvirker fremme af cellevækst og migration er ikke kendt, men sandsynligvis involverer aktivering af autophagy da en autophagy inhibitor, 3-methyladenin, ophævede virkningen af ​​SFN på celle migration. Endvidere lave doser af SFN tilbudt en beskyttende virkning mod frie radikaler medieret celledød, en effekt, der blev forstærket ved samtidig behandling med selen. Disse resultater antyder, SFN enten kan forhindre eller fremme tumorcellevækst afhængigt af dosis og arten af ​​målcellerne. I normale celler, kan fremme af cellevækst være en fordel, men i transformerede eller cancerceller, kan det være en uønsket risikofaktor. Sammenfattende ITC’er har en bifasisk effekt på cellevækst og migration. De fordele og risici ITC’er er ikke kun bestemt af de doser, men er påvirket af interaktioner med Se og den målte endepunkt

Citation:. Bao Y, Wang W, Zhou Z, Sun C (2014) Fordele og Risici i Hormetic effekter af kosten isothiocyanater på Cancer Prevention. PLoS ONE 9 (12): e114764. doi: 10,1371 /journal.pone.0114764

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: April 1, 2014 Accepteret: November 13, 2014; Udgivet: 22 December, 2014

Copyright: © 2014 Bao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af en bevilling fra National Natural Science Foundation of China (NSFC nr 81.128.011) og en pris fra Cancer Prevention Research Trust, United Kongerige. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

udtrykket “hormesis” er ofte brugt af toksikologer til at henvise til en “tofaset dosis respons på en miljømæssig agent karakteriseret ved stimulation lav dosis og ved høj dosis hæmmende eller toksisk virkning« [1], [2]. Den hormesis koncept er den mest grundlæggende dosis-respons forhold i den biomedicinske, ernæring og toksikologiske videnskaber [1]. I en omfattende gennemgang, Calabrese bevis for, at mere end hundrede antitumormidler forbedret spredning af humane tumorceller ved lave doser i fuld overensstemmelse med den hormetic dosis-respons forhold [2]. En af de interessante egenskaber ved sådanne dosisresponser var, at de fandt sted i de fleste typer af tumorceller og var uafhængige af orgel. Nylige resultater antyder, at nogle fytokemikalier udviser bifasisk dosisreaktioner i celler med lave doser aktiverende signalveje, som resulterer i øget ekspression af gener, der koder cytobeskyttende proteiner og antioxidantenzymer [3]. De kosten hormetic forbindelser identificeret hidtil omfatte resveratrol, epigallocatechingallat (EGCG), curcumin, quercetin, allicin, capsaicin, carnosinsyre og sulforaphane (SFN) [4] – [8]. Fra et evolutionært perspektiv, de skadelige egenskaber fytokemikalier har en vigtig beskyttende rolle i afskrække insekter og svampe mod skadelige planter. Men de relativt små doser af fytokemikalier indtages af mennesker, der forbruger disse planter er ikke giftige og i stedet fremkalde milde cellulære stressreaktioner. Dette fænomen er blevet bredt beskrevet som “hormesis« eller adaptiv dosis respons inden for biologi og medicin [4], [9], [10].

isothiocyanat (ITC), SFN (4-methylsulfinylbutylisothiocyanate ), blev først isoleret fra almindeligt forbruges korsblomstrede grøntsager, broccoli og er en af ​​de mest potente naturligt forekommende inducere af Kelch-lignende ECH-associeret protein 1 (Keap1) -nuclear faktor erythroide 2-relateret faktor 2 (Nrf2) -antioxidant responselementer (ARE) pathway [11]. Induktion af Nrf2 beskytter normale celler fra frie radikaler medieret oxidativ stress via opregulering af kemoprotektive gener, og virkningen af ​​SFN er baseret på dets evne til at fremkalde en Nrf2-drevet enzym quinonreduktase (NQO1) [12]. I de 20 år senere til dens opdagelse har de beskyttende virkninger af SFN er påvist i forskellige cellekultursystemer og dyremodeller, med det resultat, at SFN er langt den mest omfattende undersøgt ITC fra korsblomstrede grøntsager. De anti-kræftfremkaldende mekanismer ITC er også blevet veldokumenteret, herunder opregulering af fase II-afgiftning enzymer, anti-inflammation, fremme af cellecyklus og apoptose [13] – [17]. I det sidste årti, har Keap1-Nrf2-ARE været betragtet som en kritisk anti-cancer vej hos kemoforebyggelse [18] – [20]. På det seneste har der været nogle skadelige rapporter om Nrf2, herunder fremme af tumorcellevækst og kemoresistens [21] – [25]. For at overleve, kan kræftceller kapre Nrf2 vej som opregulerer et batteri af antioxidant enzymer, og dermed bevare en gunstig redox balance for at erhverve maligne egenskaber [26]. Overekspression af Nrf2 kunne øge celledeling og forårsage resistens over for kemoterapeutiske interventioner i nogle typer af kræft, herunder human lunge og pancreascancer [27], [28]. Enkelte tidligere undersøgelser har vist, at SFN udviser en dosisafhængig virkning på celleproliferation i dyrkede tumorcellelinier og normale celler, herunder humane mesenkymale stamceller [29] – [31]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at SFN udviste en hormetic dosisrespons på cellevækst, migrering og angiogenese. Hvorvidt hormetic virkning er gavnlig eller skadelig, afhænger af den valgte endpoint og /eller arten af ​​cellerne (normal eller tumor). Selv om udtrykket hormesis er ansat af toksikologer at beskrive en klokkeformet dosisreaktion, kendetegnet ved en fordelagtig virkning ved lave doser og en toksisk (eller hæmmende) aktivitet ved høje doser, kan dette udtryk til gavn lavdosis ikke være sandt for effekten af ITC i kræft kemoforebyggelse. Da hormesis viser lidt selektivitet, vil de biologiske virkninger af ITC på normale celler og tumorceller forskellige. Fra dette perspektiv må en lav dosis effekt af ITC i at fremme tumorcelleproliferation og migration i dyremodeller vurderes forsigtigt. Således bør en præcis strategi, der har til formål at optimere de gavnlige virkninger og minimere risikoen for ITC udvikles med omhu i forhold til forebyggelse og behandling af kræft.

Resultater

Virkninger af ITC på cellevækst

på grund af karakteren af ​​den hormetic dosisrespons, er der ingen selektivitet ITC på cellevækst, så det er sandsynligt, at ITC kan fremme tumorcellevækst ved lave doser. I flere

in vitro

cellekultur studier, lave koncentrationer af SFN har vist sig at fremme tumorcellevækst, men ingen detaljeret diskussion eller forslag til opfølgende undersøgelser for at undersøge de mekanismer, blev leveret [32] – [34 ]. Ved lave koncentrationer, er ITC blevet vist at inducere proliferation og /eller beskytte celler mod et toksisk middel, H

2O

2, i Caco-2-celler [30], og i hepatocytter [29]. Fig. 1A viser virkningerne af SFN på cellevækst, med lavere doser (1-5 uM) fremmer cellevækst (20-43% større end kontrollen) og høje doser (10-40 uM) inhiberer cellevækst i en række tumorcelle linjer, nemlig, blærecancer T24, hepatom HepG2, og coloncancer Caco-2. Lignende dosis-respons effekter blev fundet i normale cellelinjer, herunder immortaliserede hepatocyt HHL-5, colon epithelial CCD841 og hud fibroblast CCD-1092SK cellelinjer (fig. 1B).

Når celler voksede til 70-80% konfluens, en række doser af SFN (0-160 uM) blev tilsat til cellekulturmediet i 24-48 timer. Kontrolcellerne blev behandlet med DMSO (0,1%), og cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT celleproliferationsassay (CCD-1092SK cellelevedygtigheden blev bestemt ved WST-1 assay ifølge producentens anvisninger [88]). Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af mindst 5 gentagelser. Statistisk signifikans fra kontrol, * p 0,05, eller ** p 0,01. A: resultater fra blærekræft T24, hepatoma HepG2, og tyktarmskræft Caco-2 celler. B:. Resultater fra udødeliggjort hepatocyt HHL-5, colon epitel CCD841 og hud fibroblast CCD-1092SK cellelinjer

Effekter af SFN på celle migration

Fig. 2A viser en klokkeformet dosis respons af SFN på blærekræft T24 celle migration. SFN på 2,5 og 3,75 uM øget tumor celle migration til 128 og 133% i forhold til tilsvarende kontroller. Sådan SFN-induceret cellemigration er forbundet med evnen hos SFN at aktivere autofagi. Når en autophagy inhibitor, 3-methyladenin (3-MA), blev anvendt det afhjælpes SFN (2,5 uM) -induceret celle migration fra 128 til 26%, selv om den har mindre inhibitorisk virkning på SFN behandlinger på 5 eller 10 uM (fig. 2B ). Desuden 3-MA faldt også migreringen af ​​ikke-SFN behandlede celler til 12% af kontrollen

A:. Efter sult natten over blev blærekræft T24 celler behandlet med SFN ved de angivne koncentrationer i 24 timer, cellemigration blev målt ved en cellemigrationsassay hjælp af ThinCert cellekultur skær (Greiner Bio-One Ltd.). Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af 3 replikater. B: Virkning af forbehandling af 3-MA den cellemigrering. DMSO (0,1% blev anvendt som en kontrol). Statistisk signifikans fra kontrol, * p 0,05, eller ** p 0,01

ITC og aktivering af Nrf2

SFN er en aktivator af Nrf2 via hvilken den kan op-. regulere mere end hundrede beskyttende gener, herunder de fleste antioxidant og kemoforebyggende enzymer [11], [35]. Der er ingen tvivl om, at opregulering af Nrf2-ARE pathway er gavnligt i normale celler, dvs. aktivering af Nrf2 og dens drevne cytobeskyttende enzymer kan være beskyttende mod oxidativ skade og det er blevet foreslået at aktivering af Nrf2-signalvejen kan således være en lovende strategi i forebyggelse af kræft [36]. Men, ITC’er har nogen selektivitet over enten normale eller tumorceller med hensyn til Nrf2 aktivering. Nrf2 kan kapret af tumorceller [26], og en nylig rapport viser, at Nrf2 er en protoonkogenet der modulerer tumorcellevækst [37]. I transformerede celler, kan Nrf2 fremmer cellevækst eller forårsage kemoresistens [38]. I denne undersøgelse SFN (2,5-10 uM) inducerede tilsvarende niveauer af translokation af Nrf2 i kernen i normale humane hepatocytter HHL-5 (4,1-7,1 gange), og hepatom HepG2 (4,1-5,9 fold) celler (fig. 3) .

Nrf2 blev påvist i kerneekstrakter fra celler udsat for SFN (0, 2,5, 5 og 10 uM) i 24 timer, ved anvendelse af et Western blot assay. Kontrolceller blev behandlet med DMSO (0,1%). A: immortaliseret human hepatocyt HHL-5; B:. Menneskelig heptoma HepG2-celler

Beskyttende rolle lav dosis ITC behandling mod oxidative skader

På områderne biologi og medicin, hormesis er defineret som en adaptiv respons af celler og organismer til en moderat belastning. En mild stress inducerer aktivering af signalveje som Nrf2, NF-kB, sirtuin, FOXO, hypoxi-inducerbare faktor (HIF) og dermed føre til iboende ændringer (f.eks induktion af antioxidant enzymer), der kan give resistens til mere alvorlig stress [4 ], [6]. Fig. 4A og 4B viser, at forbehandling af HHL-5 og MCF-7-celler med 5 uM SFN tilbudt beskyttelse mod H

2O

2-induceret celledød, dvs. cellelevedygtigheden steg fra 36.6 til 63,9%; og fra 50,3 til 83,7% med 400 uM H

2O

2 behandlinger hhv. Desuden den beskyttende virkning af forbehandling med SFN (2 uM) på H

2O

2-induceret celledød kunne styrkes ved samtidig behandling med selen (Se) i HHL-5-celler (fig. 4C), dvs. H

2O

2 faldt cellelevedygtighed til 34,8% i HHL-5-celler, men når celler blev forbehandlet med SFN (2 uM) eller Se (0,1 uM) i 24 timer, cellelevedygtigheden øget til 41,7 og 51% og samtidig behandling SFN og Se forøget cellelevedygtighed til 65,5%. Denne beskyttende virkning kan være involveret i enten chemoprotection eller kemoresistens, afhængigt af naturen af ​​cellerne.

Celler blev dyrket i 96 brønds plader. Når de nåede 70-80% konfluens, blev cellerne forbehandlet med SFN (5 uM) i 24 timer (HHL-5, A) eller 48 timer (MCF-7, B). Celledyrkningsmediet blev erstattet med H

2O

2 ved de angivne koncentrationer i yderligere 24 timer. C: HHL-5 celle blev forbehandlet med SFN (2 uM) og Se (0,1 uM) i 24 timer før eksponering for H

2O

2 (400 uM) i yderligere 24 timer. Cellelevedygtigheden blev målt under anvendelse MTT assay. Statistisk signifikans fra tilsvarende kontroller: * p 0,05; ** P. 0,01

bifasisk effekt af SFN på angiogenese

angiogenese (ny blodkar vækst) er afgørende i udviklingen og udbredelsen af ​​forskellige humane cancerformer. Det er derfor vigtigt at undersøge de antiangiogene virkninger af potentielle anticancermidler. I modsætning hertil utilstrækkelig blodforsyning til hjertet og andre væv, som er resultatet af utilstrækkelig ny blodkarvækst, er et træk ved mange cardiovaskulære sygdomme. SFN er blevet vist at inhibere angiogenese ved høje koncentrationer [39]. I denne undersøgelse, SFN på 2,5 uM forfremmet rør dannelse til 118% af den kontrol, dvs. samlede rørlængde var 4,78 mm /mm

2 i kontrol og 5,65 mm /mm

2 i SFN (2,5 uM) behandlede celler (fig. 5). SFN ved 5 uM viste en mindre signifikant promotion (111% i forhold til kontrollen), mens 10 og 20 uM SFN inhiberede dannelse rør signifikant (nedsat til 61 og 20% ​​af kontrollen, henholdsvis). SFN ved lav dosis fremmet dannelsen af ​​en kontinuerlig basalmembran omkring endotheliale rør; henviser ved høje doser af SFN blev fragmenterede basalmembraner fundet (fig. 5A). Disse data tyder på, at for anti-angiogenese bør anvendes en relativt høj dosis af SFN eftersom en lavere dosis kan fremme angiogenese. den stimulerende virkning af lave doser på dannelse af nye blodkar, kan dog være en fordel for patienter med cardiovaskulære sygdomme.

Kultur medium suppleret med SFN (0-40 pM) blev tilsat til toppen af ​​3-D kollagengeler og derefter ændret hver 24 timer med frisk SFN tilføjet. 3-D-geler blev fikseret på dag 5, immunfarvet med CD31 (rød) og collagen type IV (grøn), og modfarvet med DAPI (blå). (A): lav forstørrelse billeder blev taget fra fem tilfældige felter i hver prøve, og beregnet for gennemsnitlige rørlængde. (B) Repræsentative billeder vises i triple farvning med større forstørrelse. Data er udtrykt som middelværdi ± SD (n = 5) (C). * P 0,05; ** P 0,01 i forhold til ubehandlet kontrol

Diskussion

Hormetic effekt af ITC på cellevækst, migration og angiogenese

De hormetic koncentrationer zone (ca. 1. -5 uM) af ITC, der er tilføjet i cellekultur kan let opnås i humant plasma efter indtagelse af et måltid rigt på korsblomstrede grøntsager, eller fra ekstrakter eller kosttilskud [40] – [44]. Tabel 1 viser plasmaniveauerne af ITC målt i adskillige humane studier (se også referere [45]). SFN er afledt fra virkningen af ​​det endogene enzym, myrosinase på glucosinolater, glucoraphanin, som findes i korsblomstrede grøntsager. De glucosinolatindhold af fælles Brassica er tilgængelige fra en database, der er udviklet af McNaughton og Marks [46]. Den højeste glucosinolater værdi var fra karse (389 mg /100 g frisk vægt), mens den laveste værdi, var fra kinakål (20 mg /100 g frisk vægt), selv om sort type og vækstbetingelser både indflydelse disse tal. Broccoli indeholder 61,7 mg /100 g (19,3 til 127,5 mg glucoraphinin /100 g) [46], hvilket svarer til 141,3 pmol SFN /100 g (44,2 til 292,1 pmol /100 g frisk vægt), hvis omdannelsen er 100% effektiv. Fødevarer forarbejdning og madlavning er afgørende faktorer i at påvirke aktiviteten af ​​myrosinase og efterfølgende dannelse af ITC [47]. Den vigtigste indflydelse på den efterfølgende produktion af ITC

in vivo

er, hvordan kål er blevet kogt [48]. Omfattende undersøgelser af SFN har tilvejebragt overbevisende dokumentation for, at SFN er et kemoforebyggende middel [49], [50]; og mekanismerne i søgsmålet indebærer induktion af fase II-enzymer, cellecyklusstop og apoptose [16], [51].

Generelt resultater fra epidemiologiske undersøgelser af sammenhængen mellem grønt og kræftrisiko er uforenelige. Et højt indtag af korsblomstrede grøntsager har imidlertid vist sig at nedsætte risikoen for flere typer af kræft, herunder colon og lunge [52], [53]. Hvis hormetic effekter af ITC er involveret i væksten af ​​kræft, den samlede biologiske virkning af korsblomstrede grøntsager på kræftrisikoen bliver meget mere kompliceret. Men hvis en lav dosis af ITC fremmer cancercellevækst det kan bidrage til at forklare, hvorfor epidemiologiske undersøgelser ikke viser et konsistent sammenhæng mellem korsblomstrede grøntsager indtag og risikoen for kræft. Derfor er det afgørende at forstå de virkningsmekanismer af de hormetic virkninger af ITC. I

in vitro

cellekulturer, kan de mekanismer, hvormed lave doser af SFN fremmer cellevækst være relateret til virkningen SFN har på aktiveringen af ​​vækstfremmende molekyler (såsom HER2, RAS, RAF, MEK, ERK , PI3K, AKT og mTOR), signaltransduktionsveje såsom NF-kB, FOXO, HIF, Nrf2, autofagi og receptorer [54] -. [56]

autophagy involverer dannelsen af ​​dobbeltstrengede membraned vesikler ( autophagosomes), som indkapsler cytoplasmaet og organeller og sikring med lysosomer, hvilket fører til nedbrydning af indholdet af vesikel [57]. SFN er kendt for at være en inducer af autofagi [58], men det er uklart, hvordan induktion af autofagi er associeret med undertrykkelse af cellemigrering. Andre potentielle mål for SFN kan omfatte matrixmetalloproteinaser (MMP’er), mikrotubuli, collagener og integriner, survivin og zinkfinger E-box binding homeobox 1 (ZEB1) [59]. En meget nylig undersøgelse viser, at aktivering af autofagi er forbundet med kemoresistens, og at histon deacetylase (HDAC) 10 beskytter neuroblastomceller fra cytotoksiske midler ved mediering autofagi [55]. Dette arbejde indikerer, at samtidig behandling med HDAC10 hæmmer og et kemoterapeutisk lægemiddel (doxorubicin) er en lovende måde at forbedre behandlingen respons. En anden undersøgelse viser, at Notch-aktivering er stort set undværlige for SFN-medieret inhibering af cellemigration i humane prostatacancer [60], og dette kunne være en terapeutisk fordel, da Notch aktivering er almindelig i humane prostatakræft. Høje konstitutive niveauer af Nrf2 forekommer i mange tumorer, mens overekspression af Nrf2 i cancerceller beskytter dem mod de cytotoksiske virkninger af anticancer terapier, hvilket resulterer i kemoresistens [22], [61]. Der er interaktioner mellem ITC og Se i opregulering af thioredoxin reduktase (TR-1) og glutathionperoxidase 2 (GPx2) [30], og det er klart, at ITC og Se udviser et væld af multi-målrettede effekter i kræft kemoforebyggelse. Interessant, Se fremmer også migration og invasion af prostatakræft PC3 celler [62].

Vurdering af hormetic effekt af ITC

Forbrug af korsblomstrede grøntsager ville ikke alene give ITC men bidrager også andre næringsstoffer og fytokemikalier, herunder tocopheroler, flavonoider, ascorbat og Se. Disse komponenter kunne modvirke /interagere med prooxidant /antioxidant aktiviteter af ITC. Baseret på den hormetic karakter ITC, forbrug af en mængde korsblomstrede grøntsager, der giver en hormetic niveau af ITC i plasma kan være en risikofaktor for dem, der har transformerede celler i kroppen. En skematisk diagram til at analysere fordele og risici ved kosten ITC foreslås i fig. 6. For alle kosten forbindelser og giftige stoffer, “dosis gør gift” [formulering forenklet fra “alle ting er gift, og intet er uden gift; kun dosen tillader noget ikke at være giftige “(Paracelsus, 1493-1541)]. For kosten ITC’er, bør der være en “no effect level” forud for detektion af eventuelle biologiske effekter. Faktisk niveauet af ITC i plasmaet hos et flertal af befolkningen vil sandsynligvis være meget lavere end sub-uM og kan ikke udøve nogen biologiske virkninger på celler. Men følgende øget indtag, såsom i forsøgene, der er anført i tabel 1 eller for enkeltpersoner tage kosttilskud, plasma ITC-niveauer kunne nå koncentrationer hormetic zone. Typiske karakteristika hormetic zone (dosis A-C) indbefatter lave koncentrationer stimulerer og høje koncentrationer inhiberende virkninger. For SFN er hormetic zone fundet at være 1-5 uM i

in vitro

cellekultur eksperimenter, selv om dosis-effekter fundet

in vitro

eksperimenter bør ikke direkte ekstrapoleres til mennesker . Det er muligt, at den hormetic zone og No Observed Adverse Effect Level (NOAEL, dosis C) hos mennesker er væsentlig forskellig. For at maksimere den gavnlige effekt og minimere risikoen, bør overvejes både genetiske faktorer og samspillet mellem kosten komponenter. For eksempel, genetiske polymorfier af glutathion transferaser (GST’er) påvirker SFN metabolisme og risikoen for kræft [63]. På den anden side, tilskud af korsblomstrede grøntsager steget GSTA1 /2-aktivitet, effekten bliver mest markant i GSTM1-null /GSTT1-null mænd [64]. Selv om der i øjeblikket få epidemiologiske undersøgelser, som anvender genotypebestemmelse vil forskningen af ​​denne art stige i fremtiden, og det er sandsynligt, at nutrigenetics vil danne grundlag for personlig medicin og ernæring. Interaktioner mellem bioaktive fytokemikalier og næringsstoffer kan bidrage til de samlede fordele og risici ved ITC afhængigt sundhedsstatus enkeltpersoner. De induktioner af Nrf2 og antioxidant enzymer, såsom TR-1 kunne også være af enten fordel eller risiko afhængig af beskaffenheden af ​​målcellerne (normal

vs

tumor).

I alle celletyper , dosisområde 0-A er sikkert. I de fleste kostvaner, de indtag af hormetic fytokemikalier sandsynligvis falde ind under denne sikkert område. For normale celler, kunne dosis B benyttes fremme dannelse af nye blodkar eller fremme sårheling; doser C er giftige. For tumorceller, bør undgås doser mellem A og C; og doser C til D kunne anvendes til kemoterapi

Hvor er vi nu.? Hvordan kan vi maksimere fordelene og minimere risiciene?

Tredive år siden, forskerne fokuseret på de potentielle toksiske (goitrogenic) egenskaber af glucosinolat nedbrydningsprodukter [65]. I 1992 blev sulforafan isoleret fra broccoli og anti-kræftfremkaldende undersøgelser baseret på dens potente aktivitet i induktion af fase II enzymer [12], [66]. I det seneste årti er der blevet rapporteret mange Nrf2 inducere herunder ITC, resveratrol, catechin, cucurmin og quercetin [67], [68] med både kemoforebyggende og onkogene aktiviteter [69] – [71]. For nylig, to Nrf2 hæmmere, brusatol (fra frø af

Brucea sumatrana

) og trigonellin (fra kaffe) blev rapporteret til at forbedre effektiviteten af ​​anticancer-terapi [72], [73]. Desuden har Nrf2 knockdown vist sig at hæmme tumorvækst, øge effektiviteten af ​​kemoterapi i livmoderhalskræft [74], og hæmme angiogenese af rotte kardiale mikro-vaskulære endotelceller under hypoxiske betingelser [75]. Derfor er det klart, at den rolle Nrf2 i udviklingen af ​​kræft er et emne af kontroverser og Nrf2 aktivatorer som SFN og andre ITC kan bidrage både fordele og risici i udviklingen af ​​kræft.

En forståelse af de komplekse overflod og divergerende natur af ITC og andre kosten Nrf2 aktivatorer og deres hormetic dosis respons, kombineret med en præcis diagnose (stadium af kræft), og genetisk analyse kan i en ikke alt for fjern fremtid, indleder det betydelige potentiale, der skræddersyet medicin kan have. Nye diagnostiske teknikker udnytter guld nanopartikler kan få øje på tumor-lignende masser så lille som 5 mm i leveren [76]. Guld nanopartikler med en polyelektrolyt overtræk kan gøre selv mindre tumorer synlige gennem X-ray scatter imaging, hvorved tidligere diagnose. Når tumorer kan diagnosticeres på sådan et meget tidligt stadium, kunne en potentiel terapeutisk tilgang være nanoencapsulation af kræft-bekæmpelse fytokemikalier eller narkotika gennem overvåges og målrettet levering [77]. Men, skal det erindres, at ITC ved høje koncentrationer er også giftige over for normale celler. Bivirkninger er blevet rapporteret i

in vitro

undersøgelser med anvendelse 10-30 uM SFN, herunder induktion af DNA, RNA og skade på mitokondrier [78] – [80]. Desuden var der også en case-rapport for levertoksicitet i en person, der forbruges 800 ml broccoli suppe en dag i 4 uger [81]. Lave niveauer af ITC kan generere reaktive ilt arter (ROS), og aktivere Nrf2-ER at tænde antioxidant enzymer. Selvom høje niveauer af ROS kan beskadige protein, lipider og DNA i celler, kan lave niveauer af ROS spiller en vigtig rolle i immunforsvaret, antibakteriel virkning, vaskulær tonus, og signaltransduktion [82]. For nylig, James Watson hypotese, at diabetes, demens, hjerte-karsygdomme og visse kræftformer er alle knyttet til en manglende generere tilstrækkelig ROS [83]. Udfordringen er at definere en balance mellem dannelsen af ​​ROS og antioxidant kapacitet i hver type celler. For kosten ITC, er det vigtigt at definere det optimale område af indtag til fremme af sundhed. Ikke desto mindre er yderligere humane undersøgelser der kræves for at etablere de personlige optimale doser, sikkerhed og virkning profiler bruger mere følsomme biomarkører.

Materialer og metoder

Materialer

Sulforaphane blev købt fra Enzo Life Sciences (UK). Natriumselenit, dimethylsulfoxid (DMSO), hydrogenperoxid, Bradford reagens, methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid (MTT), phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), og alle andre materialer og reagenser blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (UK). Kanin polyklonale primære antistoffer til Nrf2, Sam68 og peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret gede-anti-kanin IgG som sekundære antistoffer blev alle opnået fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Tyskland). Anti-collagen IV og anti-humant CD31 /PECAM-1 blev erhvervet fra Millipore og BD Biosciences (UK), hhv. Sekundære antistoffer konjugeret med Cy2 og Cy3 blev erhvervet fra Jackson Immuno Research (UK). Mini-komplet proteinase inhibitor og WST-1 reagens blev købt fra Roche Applied Sciences (UK). Elektroforese og Western blotting forsyninger blev leveret af Bio-Rad (UK). Den forbedrede kemiluminescens (ECL) kit blev købt fra GE Healthcare (UK).

Cell kultur

Immortaliserede humane hepatocytter (defineret som HHL-5), blev venligt leveret af Dr. Arvind Patel, medicinsk forskning Rådet (MRC) Virologi Unit (Glasgow, UK) [84]. Alle andre cellelinier blev indkøbt fra ATCC. Celler blev rutinemæssigt dyrket i DMEM suppleret med føtalt bovint serum (10%), 2 mM glutamin, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) under 5% CO

2 i luft ved 37 ° C.

Celleproliferationsassay

celleproliferation MTT-assayet blev anvendt til at påvise toksicitet SFN (1-160 uM) på dyrkede celler. Når cellerne var på ca. 70-80% konfluens, blev celler udsat for forskellige koncentrationer af SFN for forskellige tidspunkter under anvendelse af DMSO (0,1%) som kontrol. Efter alle behandlinger blev mediet fjernet, 5 mg /ml MTT blev tilsat og inkuberet ved 37 ° C i 1 time for at tillade MTT at blive metaboliseret. Derefter produceret formazan blev resuspenderet i 100 pi DMSO per brønd. Den endelige absorbans i brøndene er optaget med en mikropladelæser (BMG Labtech Ltd., UK) ved en bølgelængde på 550 nm og en reference bølgelængde på 650 nm.

cellemigrationsassay

Cell migration blev kvantificeret under anvendelse af en ThinCert cellekultur indsætter cellemigrationsassay (Greiner Bio-One Ltd.). Efter natten over sult i serumfrit medium, blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af SFN i 24 timer blev cellerne migrerer gennem en PET-membran mærket fluorescerende med Calcein-AM og kvantificeres ved mikropladelæser (BMG Labtech Ltd, UK) med en excitationsbølgelængde på 485 nm og emissionsbølgelængde på 525 nm.

protein ekstraktion og Western blot-analyse

for total protein, HHL-5-celler blev vasket to gange med iskold PBS, høstet ved skrabning i 20 mM Tris-HCI (pH 8), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Nonidet P40 (NP-40) indeholdende mini-komplet proteinase inhibitor. Cellesuspensionerne blev anbragt i et isbad i 20 minutter og derefter centrifugeret ved 12.000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatant blev opsamlet, og proteinkoncentrationen bestemmes ved Bradford Brilliant Blue G-farvestof-bindingsassay af anvendelse af BSA som en standard. For det nukleare protein, blev ekstraktionen udføres ved anvendelse af et kerneekstrakt Kit (Active Motif, UK) ifølge producentens instruktioner.

Proteinekstrakter blev opvarmet til 95 ° C i 5 minutter i påsætningsbuffer og fyldt på 10% SDS-polyacrylamidgeler sammen med en molekylvægtmarkør. Efter rutinemæssig elektroforese og overførsel blev polyvinyliden (PVDF) membran blokeret med 5% fedtfrit mælk i PBST (0,05% Tween 20) i 1 time og inkuberet med et specifikt primært antistof i 5% mælk i PBST i 1 time. Membranen blev vasket tre gange i 45 minutter med PBST og derefter inkuberet med det sekundære antistof fortyndet med 5% mælk i PBST i 1 time. Efter yderligere tre vaske i 45 minutter med PBST, antistoffet binding blev bestemt ved anvendelse af en ECL-kit (GE Healthcare, UK) og densitometri blev målt ved Fluor Chem Imager (Alpha Innotech, San Leandro, CA).

Angiogenese assay – rør-dannelse i en 3-D model

Humane navlevene-endotelceller (HUVEC) og pericytes (PVC) blev co-dyrket i collagen type i gel som tidligere [85] beskrevne. SFN (0-40 pM) blev tilsat til mediet (toppen af ​​3-D kollagengel) og mediet blev ændret hver 24 h med frisk SFN tilsat. På dag 5 blev prøver fikseret, immunofarvet med CD31 og collagen type IV og modfarvet med DAPI. Forstørrelse billeder blev taget fra fem tilfældige felter i hver prøve, og gennemsnittet rørlængde målt.

Statistik

Data er repræsenteret som gennemsnittet ± SD. Forskellene mellem grupperne blev undersøgt ved hjælp af en-vejs ANOVA test, eller t-test. En

s

værdi 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant.