PLoS ONE: Identifikation af Novel AR-Målrettet MikroRNA’er Mediating Androgen Signalering gennem Kritiske Pathways at regulere Cell Levedygtighed i prostatakræft

Abstrakte

MikroRNA’er (miRNA) er blevet anerkendt som væsentligt involveret i prostatakræft (PCA). Da androgen receptor (AR) spiller en central rolle i PCa carcinogenese og progression, er det bydende nødvendigt at systematisk belyse årsagssammenhæng mellem AR og miRNA, der fokuserer på de molekylære mekanismer, som miRNA medierer AR signalering. I denne undersøgelse udførte vi en serie af tidsforløb microarrays at observere de dynamiske genom-dækkende udtryk for mRNA’er og miRNA parallelt i hormon-sensitive prostatacancer LNCaP-celler stimuleret med androgen. Derfor introducerede vi Reaktion Score til at identificere AR target miRNA, samt Modulation Score til at identificere miRNA target mRNA. Baseret på teoretisk identifikation og eksperimentel validering, blev nye mekanismer rettet cellernes levedygtighed i PCa unraveled 3 miRNA nyligt anerkendt som AR mål. (1) miR-19a er direkte opreguleret af AR, og undertrykker SUZ12, RAB13, SC4MOL, alarmcentral og ABCA1 hhv. (2) miR-27a er direkte opreguleret af AR, og undertrykker ABCA1 og PDS5B. (3) miR-133b er direkte opreguleret af AR, og undertrykker CDC2L5, PTPRK, RB1CC1, og CPNE3 hhv. Endvidere fandt vi MIR-133b er afgørende for PCa celleoverlevelse. Vores undersøgelse giver visse fingerpeg om miRNA medierede AR signalering til celle levedygtighed ved at påvirke kritiske veje, især ved at bryde gennem androgen vækst begrænsning effekt på normal prostata væv

Henvisning:. Mo W, Zhang J, Li X, Meng D , Gao Y, Yang S, et al. (2013) Identifikation af Novel AR-Målrettet MikroRNA’er Mediating Androgen Signalering gennem Kritiske Pathways at regulere Cell Levedygtighed i prostatakræft. PLoS ONE 8 (2): e56592. doi: 10,1371 /journal.pone.0056592

Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: September 7, 2012; Accepteret: 11 januar 2013; Publiceret: 22 feb 2013

Copyright: © 2013 Mo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes delvist af to bevillinger 31071142 og 31171246 fra National Natural Science Foundation of China, og ved Shanghai Key Laboratory af Intelligent Information Processing Kina (nr IIPL-2010-002). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er 20~24 nt endogene protein-nonencoding RNA, og er dukket op som en vigtig klasse af regulatoriske molekyler involveret i pattedyr fosterudvikling og patogenese [1]. For nylig har et stigende antal undersøgelser påpeget, at miRNA spiller stærke roller i prostatakræft (PCA) initiering, progression og metastase [1], [2], [3]. Prostata er afhængig af androgener for vækst og udvikling, i mellemtiden dens normale væv styres af visse vækst begrænsning mekanismer til at afværge androgen-induceret over-vækst, er det bydende nødvendigt at afsløre, hvordan androgen receptor (AR) medierer disse handlinger og bryder gennem vækst begrænsning til føring PCa carcinogenese. Således har vi forsøgt at systematisk at identificere miRNA som bro veje fra AR stimulation til cellulære fænotypisk effekt i PSA.

I øjeblikket identificeret flere rapporter miRNA i AR signalering i prostatacancer [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. miR-21 var direkte opreguleret af AR i androgen-responsive PCA celler [6], på grund af AR bindende for definerede promotor. J. Ribas et al. yderligere fundet inhibering af MIR-21 kan formindske androgen-induceret PCa celleproliferation og MIR-21 var tilstrækkeligt for androgenafhængige tumorer at overvinde kastreringsinduceret vækststandsning [6]. MIR-125b var direkte stimuleret af AR, og fremmes androgen-uafhængig PCa vækst ved at undertrykke ekspressionen af ​​BAK1 som regulerede apoptotisk signalering i PCa [7]. J. Ribas et al. [6] udførte microarray analyse for miRNA-ekspression i to androgenafhængige PCA cellelinier LNCaP og LAPC-4 for at finde AR-regulerede target miRNA. Det kan dog ikke klart skelne mellem de direkte og indirekte mål for AR siden miRNA udtryk profil blev opnået ved 72 timer efter androgen stimulering. For nylig, K. Takayama et al. har udført en genom-dækkende screening af AR målgener ved at integrere CAGE og chip-chip analyse for at identificere AR bindingssteder (ARBSs) i det menneskelige genom i LNCaP celler [4]. De besluttede genom-dækkende ARBSs i 100 kb nærhed af miRNA gener. Baseret på kromosomet binding, K. Takayama et al. givet nyttige oplysninger til at belyse miRNA-medieret AR signalering netværk. Men under de særlige biologiske forhold, ikke alle targets identificeret af chip-chip-analyse er de reelle mål for AR; blandt alle de AR-målrettede miRNA, de kritiske miRNA bidrager til AR-signalering, kan ikke findes kun gennemføres via kromosom-bindingsanalyse.

På den anden side, for at studere, hvordan miRNA medierer AR signalering, er det nødvendigt at identificere miRNA target mRNA. Seed-sekvens-baserede forudsigelser af miRNA mål, såsom TargetScanS, Miranda og miRDB databaser, giver de nødvendige informative spor; anvendelse af disse forudsigelse database i den konkrete sammenhæng kan identificere miRNA faktiske mål. I de fleste tilfælde til dyr, selv om miRNA og målrette mRNA ikke helt basis-matchet kan miRNA stadig forårsage target mRNA nedbrydning via exonukleaser eller P-body [8]. Nemlig, kan udtrykket ændring af target mRNA primært afspejler miRNA regulering. Derfor er det ideelt til samtidigt observere udtryk for både miRNA og mRNA i en tidsserie måde for at effektivt at identificere miRNA regulering på mål i et væv-specifik kontekst. For nylig, V. Jayaswal et al. [9] har givet en dynamisk data samtidigt observere miRNA og mRNA udtryk i en myelom cellelinje U266. Baseret på de matchede miRNA-mRNA tid-retters data, de beregnede odds statistik [9] for hver miRNA-mRNA par opnået fra sekvens-baserede forudsigelse. Desuden kan miRNA udtryk ændring ikke nødvendigvis producere en hurtig ændring i target mRNA udtryk [9], denne tidsforskydning effekt bør overvejes ved bestemmelse miRNA regulering. I V. Jayaswal et al. Metode [9], blev betydningen af ​​odds statistik ikke vurderet af falsk opdagelse sats, som er standarden for vurdering betydning og lang reaktionstid med forskellige intervaller for at repræsentere miRNA s forsinket effekt var lige behandlet, at er ikke i overensstemmelse med faktiske omstændighed. Derfor er en forbedret algoritme til præcist at identificere miRNA mål i en specifik kontekst dybest set krævet.

I princippet de kritiske miRNA som spiller stærke roller i mediering af AR veje i androgen-afhængige PCA celler vil være betydeligt opreguleret efter androgen stimulering, og sandsynligvis holde de høje udtryk i relativt lang tid. I denne undersøgelse har vi udført en tidsserie microarray til samtidigt observere genom-dækkende miRNA og mRNA udtryk under dihydrotestosteron (DHT, et typisk androgen) stimulering i LNCaP-celler, som er androgen-afhængige. For at bestemme miRNA ‘roller i AR signalering, vi introducerede Reaktion Score til at identificere AR target miRNA, samt Modulation Score til at identificere miRNA target mRNA. Efter biologisk eksperimentel validering, er flere interessante mekanismer for miRNA ‘medierende i AR signalering nyligt afsløret, som i væsentlig grad bidrager til PCa celle overlevelse og patogenese, og undersøgelsen afslørede også nogle mulig mekanisme for at bryde gennem androgen vækst begrænsning.

materialer og metoder Salg

Celledyrkning og androgenbehandling

hormon-følsomme human prostatacancer LNCaP-cellelinje blev opnået fra ATCC og opretholdt i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin (100 enheder /ml) -streptomycin (100 g /ml) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 celleinkubator. LNCaP-celler blev dyrket i phenolrødt-fri RPMI 1640 (GIBCO /BRL) suppleret med 10% trækul-dextran-strippet FBS i 3 dage før androgen behandling, derefter blev induceret med DHT i en koncentration på 10 nM. Genomet-bredt dynamisk respons til DHT blev analyseret på ti tidspunkter – 0 timer, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h, 24 timer og 48 timer, hvor ‘0 h’ repræsenterer staten før androgen handling. I denne undersøgelse er de 10 tidspunkter nummereret som

k

= 0, 1, 2, … 9. For hvert tidspunkt, totalt RNA blev ekstraheret og oprenset under anvendelse af RNeasy Mini kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA).

genom-dækkende Expression Profil af Illumina BeadArray

i alt RNA ved hvert tidspunkt blev hybridiseret til Illumina Sentrix Menneskelig WG-6_V2 udtryk BeadChip arrays (til mRNA) og MicroRNAExpression profilering Paneler (for miRNA) separat. De rå microarray data blev overført til Gene Expression Omnibus offentlig repository (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/;. Genekspression Omnibus serien nej GSE21245).

Data Pre-behandling

Vi normaliseret microarray data ved hjælp af fraktil metode, og behandlet de uægte data. For et gen, ‘Detection

P Drømmeholdet værdi «vurderer ægtheden af ​​detekterede signal data. Hvis ‘Detection

P Drømmeholdet værdi’ 0,01 signalet betragtes som autentisk; ellers er unauthentic. Vi foreslog et kriterium for ændring af unauthentic data. I hvert microarray, er den mindste værdi af autentiske signal indstillet som tærskel, og benævnes Min

au. For en unauthentic signal data,

en

er den oprindelige værdi, og den ændrede værdi = max {a, Min

au}. Gener med mere end 5 unauthentic signaler blev udelukket. Bagefter blev de hele data betragtes som troværdige.

Identifikation af AR Kandidat Primære Mål

1) Androgen-responsive gener.

For gen

g

, repræsenterer dens transkript vektor, hvor

N

er antallet af tidspunkter dog ikke 0 timer og

N

= 9 i dette studie. (

k

= 0, 1, 2, …,

N

) angiver udskrift værdi på tidspunkt

k

, og fungerer som kontrol for DHT stimuli. For genet ved hvert tidspunkt, ‘Diffscore’ betegner differentiel ekspression signifikans sammenlignet med 0 timer. Vi betragter som nedreguleret, og som opreguleres, svarende til. betegner en mRNA’erne diskretiserede ekspressionsvektor, dvs. (

k

= 1, 2, …,

N

) = 1, -1 eller 0 på grund af opregulering, nedregulering eller undifferentiation på tidspunktet

k

; og betegner en miRNA s diskretiserede ekspressionsvektor. Hvis et gen væsentligt er differentielt udtrykt på et tidspunkt i forhold til 0 timer, det er defineret som »androgen-responsive gen” i denne undersøgelse.

2) Tid diskriminator for tidlige og sene-respons.

for at systematisk at identificere AR direkte regulerede mål, udvikler vi en strategi til at opdage “tid forskelsbehandler”, som primært adskiller efterløns- og sene-respons etaper. Ved hvert tidspunkt, antallet af forskellen udtrykte gener (sammenlignet med 0 h) blev talt. Vi trækker en kurve af differentielt udtrykt miRNA gen nummer sammen tidsforløbet. Da antallet af differentielt udtrykte gener på et sent tidspunkt er absolut meget større end på et tidligt tidspunkt på grund af den kaskade forstærkning virkning [10], definerer vi tid diskriminatoren som den tid punkt, når det andet burst af differential gen nummer vises, dvs. fra, at forskellen udtryk er på et sent tidspunkt.

3) reaktion score for måling genets androgen-respons.

det anses generelt, at det direkte mål for AR skal have en tidlig udtryk reaktion på androgen behandling; endvidere gener med tidlig og durative androgen-respons sandsynligvis ikke kun at blive reguleret direkte af AR, men også spille væsentlige roller i AR signalering. Derfor for at identificere miRNA, der er både tidlige og sene respondenter, dvs. med tidlig og durative androgen-respons, foreslår vi en statistik respons Score (RS) til at måle et gen udtryk respons på androgen stimuli: (1) hvor

I Eq. (1), er den del af diskretiserede ekspressionsvektor af genet, er den første ikke-nul element i korrekt rækkefølge;

jeg

(

x

=

y

) er lig 1, hvis betingelse er opfyldt og 0, ellers; Int (

x

) tager integreret del af

x

at være dens værdi. Den første periode i Eq. (1) er den samlede virkning af androgen-respons påpeget af vægten faktor

N

+ 1-

k

, dvs. forskellen udtryk skete på et tidligere tidspunkt har større bidrag til den rolle . Den anden periode i Eq. (1) er straffen for hyppig ændring af differentieret retning, da gener med oscillerende retningsskift er mindre vigtigt i signal ledning. Reflekteret ved, er det straffet tungere for retningen ændring skete på et tidligt tidspunkt, og straffes slighter for sent, da tidlig reaktion er vigtigere for AR primær regulering. Baseret på RS definition gener med større RS værdier er mere tilbøjelige til at blive reguleret direkte af AR, og er mere tilbøjelige til at spille vigtige roller i udførelsen AR s cellulære virkninger. I denne undersøgelse, er de 10% gener Frygteligt RS teoretisk identificeret som AR kandidat primære mål.

Identifikation af mål Markant moduleres af miRNA

1) ELLER-statistik.

for at se miRNA ‘global modulation på mRNA, vi observere udtryk profiler over tid selvfølgelig, og fokusere på, om der er en ændring i udtrykket i stedet i retning af forandring. Let.where

M

er total antal miRNA, er antallet af sekvens-baserede forudsagt mål for miRNA

jeg

, og betegne udtrykket differentiering på tidspunkt

k

for miRNA

jeg

og mRNA

j

hhv. Den odds ratio (OR) =

annonce

/

bc

. Hvis OR 1, er miRNA betragtes som globalt modulere udtryk for forudsagte mål mRNA

2) Modulation score for en sekvens-baserede forudsagt miRNA-mRNA par

For en forudsagt miRNA.. -mRNA’et par hvis medlemmer er både androgen-responsive, er det nødvendigt at fastslå, om mRNA betydeligt moduleres af miRNA i den konkrete sammenhæng. Pearson koefficient foreningen på en kontinuerlig måde er almindeligt anvendt til at måle udtryk korrelation af miRNA og mRNA [11], der bør ligeledes overvejes mRNA s forskellen udtryk afspejler miRNA s diskret modulation effekt på hvert tidspunkt. Derudover kan en ændring i miRNA udtryk ikke producere en øjeblikkelig udtryk ændring i target mRNA, bør den “tidsforskydning” effekt betragtes. Derfor foreslår vi en statistik – Modulation Score (MS) – at måle miRNA forordning om sekvens-baserede forudsagt target mRNA. For en forudsagt miRNA-mRNA par, (2) hvor der for

j

= 1, 2, …,

N

og for

k

= 2, 3, … ,

N

.

I Eq. (2),

r

er Pearson korrelationskoefficient beregnet ved udtryk data af miRNA og mRNA, (

k

= 1, 2, 3, …,

N

) repræsenterer

N

tidspunkter, og,,, …, i denne undersøgelse. Eq. (2) synes ligner Fishers

r

-til-

z

transformation, som normalt fordelt [12]; howbeit Eq. (2) er avanceret med vægt faktor

E

beskrive miRNA og mRNA er diskrete forskellen udtryk korrespondance. foranstaltninger differential udtryk korrespondance uden tidsforsinkelse; mens supplerer modulation med forsinket effekt på grund af forskellige tidsforskydninger. Betydningen af ​​MS vurderes ved nominel

s Drømmeholdet værdi og justeres

q Drømmeholdet værdi (Supplement). I denne undersøgelse

q

= 0,2 er indstillet som tærskel for signifikans identifikation, dvs. hvis

q

0,2, mRNA, identificeres som direkte mål signifikant moduleres af miRNA i det specifikke kontekst.

kvantitativ real-time RT-PCR for miRNA og mRNA

kvantificering af miRNA blev udført ved hjælp af Bulge-LoopTM miRNA qPCR (Ribo). Lille nukleare RNA U6 var endogen kontrol. For mRNA kvantificering, blev cDNA syntetiseret ud fra total RNA ved anvendelse PrimerScript ™ RT reagens kit (Takara). RT-PCR blev udført under anvendelse af SYBR PREMIA Ex Taq ™ kit (Takara) på 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystem). Primere er angivet i tabel S5 af File S1. Alle prøveværdier blev normaliseret til GAPDH. De 2

– ΔΔCt metode blev anvendt som relativ kvantificering mål for differentiel ekspression

chromatin immunoprecipitation (chip) Assay

chip assays blev udført som beskrevet i ref.. [13]. Kort fortalt celler efter ønskede behandling blev fikseret med 1% formaldehyd ved 37 ° C i 7 min, hvorefter cellerne blev høstet i SDS lysepuffer [50 mM Tris.Cl, pH 8,1, 10 mM EDTA, 1% SDS] og sonikeret til forskyde kromatin (200~500 bp). For hver chip, den opløselige fraktion fra 2 × 10

6 celler blev opsamlet og inkuberet med 4 ug kanin-anti-AR-antistof (PG-21, Upstate) eller kontrol normalt kaninserum (IgG) ved 4 ° C natten over. Immunkomplekserne blev indfanget med 20 ul af protein A /G plus-agaroseperler (Santa Cruz). Efter omfattende vask blev bundne DNA-fragmenter elueret og oprenset. Primerne til qPCR analyse af DNA-fragmenter indeholdende ARE blev noteret i tabel S3 og S4 tabel af File S1, især KLK3 (PSA) enhancer virker som den positive kontrol, hvorimod XBP-1-promotoren fungerer som den negative kontrol. Hver chip assay blev biologisk gentaget tre gange.

miRNA transfektion

Til effektiv overekspression af miRNA blev efterligner miRNA precursor molekyler og negativ kontrol (Ambion) transficeret i LNCaP celler ved hjælp Neon ™ transfektion systemet (Invitrogen) i en koncentration på 30 nM. For transfektion under sult situationen blev LNCaP celler sat i hormon-strippet medium i 3 dage før transfektion.

Cell Proliferation /levedygtighed Assay

For at teste miRNA bidrag til PCa celledeling, LNCaP celler efter transient transfektion blev podet i 24-brønds plade ved en koncentration på 15.000 celler /brønd. Efter 1, 2, 3, 4 dages transfektion, 80 ul af MTT (5 mg /ml stamopløsning) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 3 timer. Behandlede celler var lysised af DMSO og absorbansen ved 450 nm blev målt. Hver transfektion ved hver dag blev gentaget 3 gange.

Western Blotting

Western blot blev udført som tidligere beskrevet [14] anvendelse af antistoffer mod AR (Millipore), alarmcentral (Santa Cruz) og actin ( Sigma). Til ekstraktion nuklear protein, blev LNCaP-celler lysised med puffer A (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCI, 0,1 mM EDTA, 0,1 mMEGTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF). Kerner blev opsamlet ved centrifuge og lysised med puffer C (20 mM HEPES pH 7,9, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mMEGTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF). Nuklear lysat opsamles ved centrifuge og kvantificeres.

Luciferase Assay

En reporter plasmid indeholdende formodede miRNA bindingssted i 3′-UTR af target mRNA blev klonet fra pGL3-promotor Luciferase vektor. Anvendte primere er tilvejebragt i tabel S6 af File S1. Plasmidet blev verificeret ved DNA-sekventering. For luciferase assay blev LNCaP-celler (7,5 x 10

4 per brønd) udsået i 24-brønds plader og dyrket i 2 dage. Cellerne blev derefter cotransficeret med miRNA, pGL3-promotor Luciferase vektor og pRL-TK Renilla luciferase plasmid (Promega) under anvendelse af X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent (Roche). Luciferaseaktivitet blev målt ved 48 timer efter transfektion ved dobbelt luciferase reporter assay kit (Promega).

Resultater Salg

Strategien for konstruktion af miRNA-medierede AR signalnet i denne undersøgelse er illustreret i fig . 1. Den trinvise Resultaterne præsenteres som følger.

Dette er omridset af hele proceduren til analyse af microarray data til at konstruere AR netværk i denne undersøgelse. Detaljerede trin findes i de metoder og resultat sektioner.

Screening Androgen-responsive miRNA

For at identificere AR målrettet miRNA ved en gevinst af funktion tilgang, vi udførte tids- selvfølgelig microarray til samtidig observere miRNA og mRNA udtryk i de androgenafhængige LNCaP-celler under DHT-stimulering i en tidsserie af 0 timer, 20 min, 40 min, 1 time, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 16 timer, 24 timer og 48 t. Den “0 h ‘fungerer som kontrol, der repræsenterer cellulære status før DHT-stimulering. LNCaP-celler blev dyrket i en hormon-depleteret medium i 72 timer før DHT-stimulering. Efter præ-proces med de oprindelige data, der var 16.172 mRNA og 241 miRNA tilbage. Vi screenede først disse data til at finde “androgen-responsive gen« ( »ARG): Hvis et gen har væsentlig ændring udtryk på et tidspunkt i forhold til 0 timer, er det betegnes” androgen-responsive “. Den differentielle ekspression sammenlignet med 0 timer måles ved »DiffScore ‘, som repræsenterer betydningen af ​​differentiel ekspression. Følgelig blev 5.203 mRNA’er og 137 miRNA androgen-responsiv. Det skal bemærkes, at, at være androgen-responderende ikke midler bliver direkte reguleret af AR; i stedet kan nogle gener reguleres ved visse mediatorer i AR pathways. Vores vigtigste mål er at gå efter de miRNA direkte reguleret af AR, som spiller en vigtig rolle i at mediere AR netværk ved at modulere mål mRNA.

Blandt de 137 androgen-responsive miRNA, 22 miRNA var veldokumenteret i PCa [11 ], [15], [16] [17]. Deri, miR-101, miR-145, miR-34a, miR-182, miR-375, miR-181a, miR-92b og miR-125a er opreguleret af DHT stimulation. Disse miRNA blev rapporteret som meget overudtrykt i PCa [11], [17], [18], [19]. miR-16, miR-126 *, miR-23b, miR-100, miR-222, miR-133a-1, miR-499 og miR-340 er nedreguleret, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter [11], [15], [16].

De androgen-reagerende mRNA fundet i denne undersøgelse er meget i overensstemmelse med tidligere rapporter. Vi har tidligere etableret en specificeret database betegnes ARGDB database [20], som fokuserede på AR regulerede gener ved at integrere litteratur op til år 2009. For de 5.203 androgen-responsive mRNA fundet i denne undersøgelse, 80% ramte androgen-responsive gener i ARGDB database . Den overensstemmelse indebærer rigtigheden af ​​vores eksperimentelle resultater for at observere genom dynamiske udtryk i LNCaP celle under DHT stimulering. Interessant, nogle gener involveret i miRNA behandling opreguleret af androgener (Figur S1 i File S1). F.eks

DICER

, et RNA-bindende protein, som behandler præ-miRNA til modne miRNA, opreguleres. Dette stemmer overens med den tidligere rapporterede opregulering i PCa [21].

DGCR8

, partner af nuklear RNase III drosha, som spalter stammen-loopes pri-miRNA i den flankerende-fri pre-miRNA, er også markant opreguleret.

Identifikation Tid diskriminatoren for Early – og Late-respons

Genekspression respons på androgen stimulation kan ske når som helst tidspunkt efter DHT behandling; således, afhængigt kun på androgen lydhør kan ikke give mere refleksion over at bestemme, hvilke lydhør gen er kritisk. Vi spekulere, at gener med signifikant udtryk ændring sker på et tidligere tidspunkt kan spille en mere central rolle i at mediere AR signalering, og kan have bedre chance for at være den direkte mål for AR. Derfor, for at identificere de kritiske miRNA som formentlig AR mål, vi klassificeret miRNA respons i tidlige og sene stadier i denne undersøgelse ved at bestemme en tid forskelsbehandler

τ

, der markerer begyndelsen på sene reaktion. Antallet af differentielt udtrykte miRNA spænder over tidsforløbet blev afbildet. Som vist i fig. 2A,

τ

= 6, svarende til den tid punkt 8 timer er identificeret, hvilket betyder, at for miRNA »Angivelse reaktioner på androgen, [20 min, 8H) er den tidlige fase, mens [8 timer, 48 h] er den sene fase.

Figur 2A. Tidsforløb profil differentielt udtrykte miRNA nummer. Den stiplede linie refererer til tid diskriminatoren til at skelne tidlige og sene respons etaper. Figur 2B. Expression profil miRNA ‘tidlige og sene reaktion på DHT stimuli. Differentiel ekspression i forhold til 0 h er repræsenteret af. adskiller miRNA respons i tidlige og sene stadier. miRNA er grupperet i 4 grupper: tidligt opreguleret (1), sent opreguleret (2), tidligt nedreguleret (3) og sent nedreguleret (4). Figur 2C. Venn-diagram for antal distribution af tidlige responsive miRNA og sene responsive miRNA. Den røde del betegner androgen-resonsive miRNA med respons skete udelukkende på det tidlige stadium, den blå del betegner miRNA med respons udelukkende på det sene tidspunkt, og den lilla del betegner miRNA med respons på både de tidlige og sene stadier. Figur 2D. Forudsagt ER berigelse i tidlige og sene responsive miRNA gener. ARE’er er i de ± 10 kb, der flankerer 5’-start site af pre-miRNA.

For at vurdere pålideligheden af ​​tiden forskelsbehandler

τ

, vi undersøgte miRNA ‘differential udtryk profil , og analyseret ER berigelse forskel mellem tidlige og sene responsive miRNA. Profilen af ​​androgen-responsive miRNA ‘differentielle ekspression observeres ved anvendelse som en ikke-konservativ kriterium for at illustrere differentiel ekspression. I fig. 2B, tiden diskriminatoren “8 h ‘klart adskiller efterløns- og med sen respons etaper. Derfor vi grupperet miRNA i 4 grupper: tidligt opreguleret, sent opreguleret, tidligt nedreguleret og sen nedreguleret (Fig 2B som en demonstration.). Nogle androgen lydhør miRNA har differentierede udtryk både i de tidlige og sene stadier, og andre har kun differentierede udtryk enten på tidligt eller sent tidspunkt alene. Fig. 2C viste fordelingen af ​​tidlige responsive 83 miRNA (11 miRNA i rød udelukkende har tidlig reaktion), sene lydhør 126 miRNA (54 miRNA i blåt udelukkende har sene reaktion), samt 72 miRNA er krydset (i lilla). Tallet er i form af Venn-diagram [22]. Vi derefter analyseret ER berigelser for efterløns- og sene-responsive miRNA. Det er naturligt at forvente, at gener direkte reguleret af AR (fx de tidlige responsive gener) vil have højere ER berigelse. De opstrøms 10 kb og de efterfølgende 10 kb af 5’-start site af pre-miRNA blev undersøgt for at søge AR-bindende sites (ARBSs). Genomatix database [23] blev anvendt til at detektere Ares, herunder formodet og valideret androgen receptor (AR) og glucocorticoid receptor (GR) responsive elementer, som vist i tabel S1 af File S1. Formodede ER antallet af androgen-responsive miRNA er illustreret i fig. 2D. Det er indlysende, at ER berigelser for tidlig responsive miRNA er betydeligt større end sent reagerende dem (

s

0,01, Suppl.1), hvilket underbygger rationalitet tid forskelsbehandler

τ

.

identifikation Kandidat miRNA som AR Primært

Target

For at identificere miRNA som sandsynligvis direkte reguleret af AR, såvel som at spille en afgørende rolle i formidlingen AR-netværk, vi foreslog og beregnet en ny statistik , reaktion Score (RS) for hver androgen-responsive miRNA. Figur 3A viser RS ​​distribution af androgen-responsive miRNA. miRNA med RS værdier i de øverste 10% er teoretisk identificeret som AR primære mål. Tærsklen for RS for miRNA er 22, derfor 15 miRNA (8 undertrykt og 7 inducerede) blev teoretisk identificeret som kandidat.

3A. RS distribution af androgen-responsive miRNA. miRNA-numre i henhold til forskellige RS værdier præsenteres, den stiplede linje angiver grænsen for at identificere AR kandidat primære mål miRNA. Figur 3B. RT-PCR-analyse for identificerede AR kandidat target miRNA. Fold ændring af DHT-behandlede LNCaP-celler frem kontrolprøver blev præsenteret med signifikans vurdering (i denne undersøgelse, *: p 0,05; **: p 0,01; ***: p 0,001). Gange ændring i kontrolprøver blev anset som 1 for alle RT-PCR-analyser i denne undersøgelse. Dette tal er RT-PCR-analyse af miRNA ved 40 min på DHT-stimulering. Figur 3C. Skematisk diagram af miR-133b, miR-19a, og miR-27a er er placering i de 5 ‘og 3’ regioner. De vandrette pile angiver den omtrentlige ER steder. Figur 3D. Chip-analysen af ​​AR-bindende for kandidatlande mål for miR133b, miR19a, miR27a. “IgG” tjener som negativ kontrol for chip-analysen.

For at vælge miRNA med nye biologiske betydning for følgende dybe igangværende undersøgelse, vi brugte GenMAPP at analysere de påvirkede veje for hver kandidat, afhængigt af vejen berigelse for de forudsagte mål mRNA, som også var androgen-lydhør. I denne undersøgelse blev miRNA ‘forudsagte mål fra miRDB database [24], hvis genom-dækkende miRNA target forudsigelse blev udført med et nyudviklet bioinformatik værktøj, MirTarget2 [25]. MirTarget2 algoritme baseret på support vektormaskine (SVMs) og microarray uddannelse datasæt, det viste højere selektivitet på at identificere nedreguleret gener i forhold til andre algoritmer. Ved udførelse GenMAPP blev veje med z≥1.96 betragtes som væsentlig. Blandt de identificerede kandidat AR primære mål miRNA, miR-19a, miR-27a og miR-133b, blev fundet med betydelige pathway berigelser i kritiske cellulære processer (Tabel S2 i File S1). Disse 3 miRNA vedvarende betydelig opregulering i hele tidsforløbet ifølge microarray data, og vi validerede deres udtryk data med RT-PCR-analyse. Vi valgte microarray prøven ved 40 min for miRNA RT-PCR-analyse da de 3 miRNA viste ekspression ændring så tidligt som 40 min i microarray eksperiment. RT-PCR resultatet var overensstemmende med microarray data (fig. 3B). I det følgende, vi studerede mekanismerne i miR-19a, miR-27a og miR-133b i mediering af AR signalering til PCa carcinogenese.

Bekræftelse AR s Binding til miR-19a, miR-27a og miR-133b

kromatin Immunfældning (chip) analyser blev udført for at kontrollere AR-binding til de forudsagte ar de udvalgte 3 miRNA. Vi brugte Genomatix databasen [23] til at registrere Ares opstrøms og nedstrøms 15 kb af præ-miRNA s 5′-startstedet. ARE’er med ‘Core lighed = 1’ blev udvalgt til chip assay validering, der repræsenterer den højeste match mellem mål-DNA-sekvens og er konserverede baser. ARE’er påvist i de opstrøms og nedstrøms regioner af miR-19a, miR-27a og miR-133b henholdsvis blev illustreret i fig. 3C. Baseret på chip analyseresultater, fandt vi, at behandlingen af ​​10 nM DHT i LNCaP-celler i 4 timer, resulterede i en signifikant AR-binding til kromatin med forudsagte ARE’er i MIR-19a, MIR-27a og MIR-133b, sammenlignet med kontrollerne (fig. 3D). QPCR analyse af KLK3 promotoren (tjener som positiv kontrol for AR-binding), og XBP-1 promotoren (tjener som negativ kontrol for AR-binding) blev vist i figur S2 i File S1. Fig. Som vist i fig. Som vist i fig.