PLoS ONE: Detection Live cirkulerende tumorceller ved en klasse af Near-Infrarød Heptamethine carbocyaninfarvestoffer i patienter med lokaliseret og metastatisk Prostata Cancer

Abstrakt

Tumor celler er i sagens natur heterogene og ofte udviser mindsket friktion, hvilket resulterer i udgydelse af tumorceller i kredsløbet at danne cirkulerende tumorceller (CTCs). En brøkdel af disse er levende CTCs med potentiale metastatisk kolonisering, mens andre er på forskellige stadier af apoptose gør dem tilbøjelige til at være mindre relevante for at forstå sygdommen. Isolering og karakterisering af levende CTCs kan forstærke oplysninger givet af standard opregning til at hjælpe læger til mere præcist at etablere diagnose, vælger terapi, overvåge respons, og give prognose. Vi har tidligere rapporteret om en gruppe af nær-infrarøde (NIR) heptamethine carbocyaninfarvestoffer, der specifikt og aktivt transporteret ind levende kræftceller. I denne undersøgelse var dette levedygtig tumor cellespecifik adfærd anvendes til at detektere levende CTCs i prostatacancerpatienter. Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) fra 40 patienter med lokaliseret prostatacancer sammen med 5 patienter med metastatisk sygdom blev farvet med IR-783, prototypen heptamethine cyaninfarvestof. Farvede celler blev underkastet flowcytometrisk analyse for at identificere levende (NIR

+) CTCs fra puljen af ​​totale CTCs, som blev identificeret ved EpCAM-farvning. Hos patienter med lokaliseret tumor, levende CTC tæller svarede med samlede CTC numre. Højere levende CTC tællinger blev set hos patienter med større tumorer og dem med mere aggressive patologiske funktioner, herunder positive margener og /eller lymfeknude invasion. Endnu højere CTC-numre (levende og total) blev påvist i patienter med metastatisk sygdom. Levende CTC tæller faldt, når patienterne modtog effektive behandlinger, og omvendt optællingerne tendens til at stige på tidspunktet for sygdomsprogression. Vores undersøgelse viser mulighederne for at anvende denne farvning teknik til at identificere levende CTCs, skaber mulighed for yderligere molekylær forhør af en mere biologisk relevant CTC befolkning

Henvisning:. Shao C, Liao CP, Hu P, Chu CY , Zhang L, Bui MHT, et al. (2014) Detection Live cirkulerende tumorceller ved en klasse af Near-Infrarød Heptamethine carbocyaninfarvestoffer i patienter med lokaliseret og metastatisk prostatacancer. PLoS ONE 9 (2): e88967. doi: 10,1371 /journal.pone.0088967

Redaktør: Joseph Najbauer, University of Pécs Medical School, Ungarn

Modtaget: September 19, 2013; Accepteret: 14 januar 2014; Udgivet: Februar 14, 2014

Copyright: © 2014 Shao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra prostatakræft Foundation, National Institutes of Health /National Cancer Institute (2PO1CA098912 og 1RO1CA122602) og styrelsesrådet Cancer Research Chair (LWKC), og af programmet for International Videnskab og Teknologi Samarbejde Kina (Nej . 2011DFA33110). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Solide tumorer er i en konstant tilstand af evolution med progressiv heterogenitet [1], [2]. Processen med metastatisk progression er ledsaget af flere fænotypiske vekslen, der resulterer i nedsat klæbeevne og forøget cellulær motilitet blandt andre forandringer [3]. Nogle bevægelige cancerceller har kapacitet til at formidle til fjerne steder via vaskulaturen og lymfatiske kanaler og invadere væv fører til dannelse af en metastatisk læsion [4]. Cirkulerende tumorceller (CTCs) danner således en vigtig forbindelse mellem primære tumorer og deres fjerne metastaser og afgrænser irreversibel progression af sygdommen. Isolering og karakterisering af disse levende og aktive kræftceller kan forbedre sygdommen prognose, som er blevet påvist i prostatakræft (PCA) [5].

nedlæggelsen af ​​CTCs er en dynamisk proces, der forekommer med både primær og metastatisk tumorer. kan detekteres det faktum, at dissemineret tumorceller i blodet hos PCA patienter efter prostatektomi [6], at CTCs kan spredes fra enten residual tumor i prostata seng eller fra metastatiske aflejringer. Molekylær undersøgelse af disse celler kan give real-time information om status for ondartet progression. Som indsamling af CTCs typisk kræver lav volumen standard tapning, har nogle foreslået, at CTCs kan udnyttes som en ideel surrogat væv eller væske biopsi at måle sygdomsstatus [7]. En sådan kilde til væv ville give en enkel, minimalt invasiv væv kilde, der kunne tilgås serielt til at levere høj tidsmæssig definition af udviklingen i underliggende sygdom.

Den prædiktive værdi af CTCs afhængig tekniske fremskridt for at muliggøre pålidelig detektion og isolering. CTCs udgør kun en brøkdel af perifere mononukleære blodceller (PMBC’erne). Mange nye teknologier er ved at blive testet for CTC påvisning og isolation [8]. Den mest almindeligt anvendte strategi er afhængig af epitel afstamning markører såsom EpCAM [9] eller på størrelse forskelle i forhold til PBMC’er [10]. Det eneste FDA-godkendte CTC-analysen anvender en immunomagnetisk adskillelse teknik baseret på ekspressionen af ​​epitheial overflademarkører [11], [12]. Den relativt lave følsomhed af assayet, kombineret med kravet om præ-fiksering gør isolaterne uegnede til molekylær analyse ud immunofluorescens. Afhængigheden af ​​markør-ekspression tillader ikke omfattende detektion af den heterogene CTC pool. Det er også kendt, at ikke alle CTC vil resultere i en ny metastatisk læsion. Puljen af ​​CTCs består af levende og aktivt metastaserende celler og omkringstående, der passivt kastet ind i omløb [5], [13] – [15], i kombination med apoptotisk tumorceller vragrester [16] – [18]. Der er behov for alternative CTC-strategier afsløring, at isolere metastaserende fraktion, der er mest sandsynligt at finde i live-CTC pool.

At udvikle en omkostningseffektiv metode til at identificere levende CTCs, vurderede vi muligheden for at benytte en gruppe af syntetiske nær infrarød (NIR) heptamethine carbocyaninfarvestoffer. Vi har tidligere vist, at disse organiske farvestoffer specifikt transporteres ind i tumorceller og kan skelne maligne fra ikke-maligne celler i xenograftmodeller eller spontane tumorer

in vivo,

i kirurgisk tumor prøver

in vivo

eller

ex vivo

[19], [20]. Disse farvestoffer optages og akkumuleres af cancerceller gennem en aktiv transportsystem uafhængigt af konventionelt anvendes epiteloverfladen markør (EpCAM). Endvidere optagelse af farvestoffet er aktiv (ATP-driven) transport og således kan betragtes som en funktionel analyse for tumor cellelevedygtighed. Resultaterne fra den aktuelle undersøgelse tyder på, at IR-783, prototypen på denne gruppe udvalgte NIR farvestoffer, kan inkorporeres i flere afsløring protokoller for at identificere levende CTCs. Disse levende CTCs kunne isoleres fra kræftpatienter før og under terapeutisk intervention på grund af de relativt ikke-invasive midler indkøb. Yderligere molekylær forhør kunne så opstå selv ved enkelt-celle niveau [21].

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

fluorescein (FITC) -konjugeret mus monoklonalt antistof (mAb) over for human EpCAM (klon 9C4) og phycoerythrin (PE) -konjugeret muse-mAb til CD45, sammen med oprenset isotype-matchet IgG1 og IgG2b blev fremskaffet fra BioLegend (San Diego, CA). Kilden og anvendelse af andre antistoffer er tidligere blevet rapporteret, herunder dem mod human RANKL, HIF-1α, NRP-1, og VEGF, såvel som dem til phosphoryleret c-MET og p65-underenheden af ​​NFKB [22]. Kilderne og oprensning af heptamethine carbocyaninfarvestoffer er tidligere blevet beskrevet [19], [20]. Ficoll-Paque PREMIUM 1,084 blev købt fra GE Healthcare (Piscataway, NJ), og Histopaque-1077 blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cell Culture

Menneskelig PC -3-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cellerne blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS, Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA), penicillin (100 enheder /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Celler blev løsnet med 0,05% trypsin /EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA), vasket i Ca

2 + – og Mg

2 + -fri phosphatbufret saltvand (PBS, Invitrogen), og resuspenderet i komplet dyrkningsmedium . Celler blev talt på en TC10 Automated Cell Counter (Bio-Rad, Hercules, CA), med udelukkelse af trypanblåt for at bekræfte cellelevedygtighed.

Kliniske blodprøver

Patient blodprøver blev anvendt med skriftlig informeret samtykke gennem Cedars-Sinai Medical center institutionelle anmeldelse board-godkendte bio-banking protokoller (IRB # Pro00025217 og # Pro00030418). Kliniske blodprøver blev opsamlet præoperativt fra 40 PCA patienter, der undergår radikal prostatektomi på Cedars-Sinai Medical Center. Multiple blodprøver blev opnået fra gentagne besøg af 5 patienter med androgen uafhængig sygdom. Yderligere blodprøver fra 34 raske mandlige donorer i alderen mellem 32 og 70 år blev opnået. Ca. 7,5 ml venøst ​​blod blev opsamlet i et EDTA-indeholdende lavendel overrør (BD, Franklin Lakes, NJ) og centrifugeret ved 1.500 rpm i 20 minutter ved stuetemperatur på en Heraeus CLINIFUGE centrifuge (Thermo Scientific, Logan, UT). Efter fraktionen plasma blev høstet til diagnostiske formål, blev pakket blodlegemer fraktion transporteres på is til forskningslaboratorium inden for 3 timer efter opsamling.

Isolering af PBMC’er

PBMCer blev isoleret med standard tæthed gradientcentrifugering. Den pakkede blodprøve blev fortyndet med et tilsvarende volumen af ​​en balanceret saltopløsning indeholdende 0,01% glucose (vægt /volumen), 5 uM CaC

2, 9,8 uM MgCl

2, 540 pM KCI, 126 mM NaCl, og 14,5 mM Tris, pH 7,6. En 2-ml prøve af den fortyndede prøve blev lagdelt på en 3 ml Ficoll-Paque pude og underkastet centrifugering ved 400 x g ved stuetemperatur i 40 minutter. Celler i den celle med kerne fraktion blev opsamlet og vasket to gange i PBS og resuspenderet i RPMI-1640-medium indeholdende 5% FBS i yderligere analyser.

Tumor Cell Spiking og Farvning

Alikvoter af PBMC’er blev gjort så at hver indeholdt et tilsvarende antal celler fra 1 ml donorblod, ca. 2 × 10

6 celler /prøve. At spike med cancerceller, kendt antal levende PC-3-celler i RPMI 1640 medium indeholdende 5% FBS blev tilsat til PBMC alikvot. I kontrol undersøgelser tilsat døde cancerceller, blev PC-3-celler i enkelt cellesuspension dræbt i 75% ethanol og udvundet i det samme medium. Spidse prøver blev derefter farvet med 20 um NIR farvestoffer ved 37 ° C i 30 minutter. Efter vask to gange i PBS for at fjerne frie farvestoffer blev cellerne fikseret i formalin i 10 minutter ved stuetemperatur, vasket to gange i PBS og resuspenderet i 400 pi cellefarvning Buffer (BioLegend). For yderligere at pletten for overflademarkører blev prøverne inkuberet først med isotype IgG på is i 10 minutter, og derefter omsættes samtidigt med FITC-konjugeret mAb mod EpCAM og PE-konjugeret mAb mod CD45 i 20 minutter. Arbejdsgruppen Forholdet mellem mAbs var 0,1 mg /10

6 celler. Efter vask to gange med cellefarvning Buffer blev cellerne farvet med 4 ‘, 6’-diamidino-2-phenylindol (DAPI, Invitrogen) før det underkastes detektion.

Påvisning af CTC med fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)

To FACS instrumenter (BD Biosciences, MA) blev anvendt i undersøgelsen. Til isolering CTCs blev en FACSAria III bruges til at sortere positivt mærkede celler på en APES-coatet cytologi slide (Bio-World, Dublin, OH). At opregne CTCs blev en LSRII flowcytometer anvendes. anbefalede procedurer afsløring Producent blev fulgt. Parallelt med påvisning af hvert menneske blodprøve blev 1 × 10

4 PC-3 celler bruges til at spike en 1 ml prøve af prøven. Den flowcytometrisk profil af det udtagne prøve blev anvendt til at guide positivitet gating. FACS-data blev yderligere analyseret med FlowJo software.

Fluorescens Imaging

farvede celler isoleret med FACS sorteringsanlæg på objektglas blev udsat for både fluorescens billeddannelse og nær infrarød billeddannelse med vores tidligere rapporteret procedure [19] [20], [22], med et Nikon Eclipse Ti fluorescensmikroskop ophidset af en xenon bue lyskilde. I nærheden af ​​infrarøde billeder blev erhvervet gennem et INDO filter (780-840 nm).

Multiple Quantum Dot Mærkning (mQDL)

farvede celler opsamlet med FACS sorteringsanlæg på objektglas blev udsat for yderligere farvning med mQDL protokol som tidligere beskrevet [22]. Kort fortalt blev prøverne først behandlet med stripning buffer til fjernelse mAb anvendes til CTC isolation, og derefter udsat for successiv farvning med antistoffer reagerer på en gruppe af PCa-relaterede biomarkører, herunder RANKL, HIF-1α, NRP-1, VEGF , pc-MET, og p-p65, som tidligere rapporteret [22], med den samme farvning protokol. Endelig blev prøverne modfarvet med DAPI, før de udsættes for spektral billeddannelse og signal kvantificering på en CRi spektral imaging system med Nuance software (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).

Statistisk analyse

midler, standardafvigelser og medianer blev anvendt til at opsummere kontinuerlige variabler. Frekvenser og procenter blev beregnet for kategoriske variable. Spearman korrelationer blev beregnet mellem kontinuerlige variabler i data på grund af skæve fordelinger. Sammenligninger af levende CTC mellem kategorier af interesse blev gjort ved hjælp Wilcoxon Rank Sum test. En lineær mixed model blev brugt til at vurdere forholdet mellem antallet af celler spidse og hentet, hvor de gentagne målinger på de donorer blev modelleret med en heterogen sammensatte symmetrisk kovarians struktur. Alle analyser blev udført ved hjælp af SAS-version 9.3.

Resultater

Vi har tidligere demonstreret aktiv optagelse og fastholdelse af NIR farvestoffer ved dyrkede humane PCa LNCaP, c4-2, PC-3, DU-145 , ARCaP

E og ARCaP

M-celler [19], [20]. Så få som ti PC-3-celler tilsat til 1 ml humant donorblod kan detekteres ved anvendelse IR-783. Dead PC-3-celler spiket på samme måde ikke udvise nogen IR-783-optagelse. Fordi optagelse af IR-783 kræver anvendelse af et ATP-kræver organisk aniontransporter, farvestofoptagelse selv er et funktionelt assay, der peger mod tumorcelle levedygtighed. For at vurdere anvendeligheden af ​​denne tilgang til at detektere levende CTCs i patientens blodprøver, vi indarbejdet NIR farvestof farvning i FACS-analyse. Den udbredte EpCAM

+ CD45

-profil [9], [12] blev vedtaget for at konsolidere CTC natur af det detekterede NIR

+ celler.

1. Identifikation og isolering af Live (NIR

+) Celler fra humant blod

Patient blodprøver blev underkastet gradientcentrifugering derefter sekventiel farvning: først med NIR farvestof til farvning levende CTCs, derefter med fluorescensmærkede antistoffer mod EpCAM og CD45 for bekræftelse. Endelig blev prøven farvet med DAPI til visualisering af cellekerner.

Som en kontrol for at kalibrere udførelsen af ​​brandvisningsanlægget, vi først testet farvningen protokol med sund donorblod tilsat PC-3 celler på varierende antal. I FACS-analyse blev de farvede prøver sorteret for at isolere EpCAM

+ CD45

– population. Disse celler blev derefter tyet til at bestemme antallet af NIR

+ DAPI

+ -celler (figur 1A). PC-3-celler blev identificeret som celler med kerne (DAPI

+), der udtrykker EpCAM, men ikke CD45 (figur S1). I gentagne forsøg, når den endelige EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ tællinger blev modelleret som en funktion af spidse celletal, en signifikant stigende tendens blev observeret med en korrelationskoefficient på 0,997 ( Figur 1B og tabel S1). Den stærkt lineær sammenhæng foreslået, at denne FACS protokol var brugbare til detektering CTCs med et ubetydeligt antal af ikke-specifikke tællinger. Vi yderligere fastslået, at de udvundne PC-3-celler på objektglas kunne let ses ved fluorescensmikroskopi (Figur 1C). Brug den samme protokol, vi har registreret 2,8 ± 1,7 EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ begivenheder i en række undersøgelser med blodprøver indsamlet fra 34 raske donorer forsøgspersoner (Figur 1B). Denne opdagelse var godt i aftale med andre undersøgelser af EpCAM

+ celler hos raske donor blodprøver analyseres ved hjælp af næste generation CTC platforme [23], og sandsynligvis afspejler baggrundsniveauet af cirkulerende epitelceller. Vigtigere, i parallelle undersøgelser, hvor døde PC-3-celler blev anvendt i spiking, EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ tællinger blev holdt ved baggrundsniveauet, hvilket antyder, at den spiked døde PC-3-celler opfanger ikke farvestoffet (data ikke vist). Disse kontrolundersøgelser kollektivt demonstrere egnethed NIR farvestof til at farve og opdage levende CTCs.

Menneskelig PCA PC-3-celler blev anvendt som positiv kontrol celler. A, PC-3 celler farvet sekventielt med alle fire detektionsmidler blev underkastet FACS-analyse. Overpanel: prøven blev først opdaget for positiv EpCAM (FITC), men negativ CD45 (PE) farvning (gated fraktion). Nederste panel: gated fraktion blev forespurgt til IR-783 (NIR) og nuklear (DAPI) plet. NIR

+ EpCAM

+ DAPI

+ CD45

– tællinger blev betragtet som levende kræftceller. PC-3 detektion blev anvendt parallelt i analysen af ​​hver klinisk prøve som vejledning i gate indstilling. B, Virkningsgraden af ​​påvisningsstrategi blev vurderet ved at sammenligne antallet af spidse og detekteret PC-3-celler ved FACS-analyse. Hvert datapunkt var middelværdien af ​​fundne PC-3 celler spiket til 6 sunde donorprøver. C, Fluorescensmikroskopi blev anvendt til at visualisere PC-3-celler udvundne på en glasplade. Øverste række viser billeder af et repræsentativt felt ved lav forstørrelse (40 x; bar = 250 um), med to celler (markeret med 1 og 2), som foreligger ved stor forstørrelse i de nederste to rækker (400 ×; bar = 25 um) .

2. Påvisning af Levende CTCs i patienter med lokaliseret PCa Gennemgår radikal prostatektomi

Brug af funktionelle FACS analyse efter NIR farvning, vi testede påvisning af EpCAM

+ CD45

-DAPI

+ celler, fremover henvist til som

alt

CTCs, i kliniske PCA patienter med vægt på EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ hændelser (fremover benævnt

lever

eller

NIR

+

CTCs). PBMC’er blev isoleret fra præ-operative blodprøver fra 40 patienter diagnosticeret med lokaliserede sygdomme. Detaljerede karakteristika for disse patienter er sammenfattet i tabel 1.

Denne serie af analyse viste, at levende CTC tæller varieret bemærkelsesværdigt blandt patienter. EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ tæller varierede fra 0 til 439 celler /ml (gennemsnit 25 celler /ml; median 10 celler /ml) for denne gruppe af perioperative patienter (tabel 1). I denne undersøgelse blev en optælling af mindre end 5 betragtes som normal, som vores rask donor pool havde 2,8 ± 1,7 EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ tællinger (figur 1B). Farvningen Fremgangsmåde reproducerbart detekterede mere end 5 levende CTCs /ml i 30 af de 40 patienter. Repræsentative resultater fra flowcytometrisk detektion er vist i figur 2A. Vi endvidere dokumenteret, at CTCs kunne isoleres direkte på mikroskopobjektglas, og kunne visualiseres med fluorescensmikroskopi (Figur 2B). I disse analyser, live CTCs var skelnes fra døde celler baseret på optagelse af NIR farvestof (figur 2B).

Repræsentative detektion resultater er vist. A, øverste række viser CTC afsløring fra patient 6, hvor 10 levende CTCs blev fundet. Lavere række viser påvisningen af ​​148 levende CTCs fra patient 14. For hver prøve blev gate indstilling instrueret af parallelle farvning af PC-3 celler. B, CTCs detekteret fra patient 14 blev isoleret på et objektglas og visualiseret straks ved fluorescens billeddannelse. Lav forstørrelse billeder af et repræsentativt felt (40 ×; bar = 250 um) er vist i den øverste række. Nedenfor er høj forstørrelse billeder af 2 levende CTCs (NIR

+) fra det samme område er vist i de næste to rækker, i forhold til 2 døde CTCs (NIR

-) i de sidste to rækker (400 ×; bar = 25 um).

De levende CTC tæller opdaget fra denne kohorte korrelerede ikke signifikant med præoperativ serum PSA-niveau (r = 0,12,

s

= 0,47, figur S2), patologisk N-stadie (kun gives en knude positiv patient), Gleason score, eller margin status (Figur S3). Sammenligning CTC tæller til Stephenson forudsigende monogram, var der ingen statistisk signifikant sammenhæng mellem levende CTC tæller og den Stephenson prædiktiv monogram.

Der var 10 patienter med 5 eller færre levende CTCs /ml (tabel 1), og alle havde T2 sygdom med negativt kirurgiske margener. Kun en af ​​disse patienter (patient 26) havde en PSA koncentration detekterbart serum 2 uger efter radikal prostatektomi. Hans serum PSA blev målbart på 6 uger efter operationen. Patienten har siden været tilbagefald-fri. Der var 3 patienter med positive kirurgiske margener (patienter 2, 13 og 25, tabel 1). Disse patienter har også været tilbagefald-fri i mere end to år, så langt uden yderligere anti-behandlinger mod kræft.

Der var 3 patienter havde påviselige serum PSA koncentrationer inden 3 måneder efter radikal prostatektomi (tabel 1). Patient 26 havde en pT2cN0 Gleason 3 + 3 kræft med negative marginer. Interessant, han havde kun 3 levende CTCs /ml blod. Serum PSA i denne patient blev målbart senere uden yderligere indgriben. Patient 29 havde en pT3aN0 Gleason 4 + 5 kræft med positive margener, og blev opdaget med 46 levende CTCs /ml. Hans serum PSA-niveau blev upåviselig efter 6 måneders androgen deprivation terapi, der fortsætter indtil dette tidspunkt. Patient 39 havde lymfeknudemetastase på tidspunktet for kirurgi og viste sig at have høje præoperative CTC tællinger (439 /ml). Yderligere tilfælde af tilbagefald skulle undersøges for at afgøre, om præ-operation CTC tællinger kunne bruges som en parameter til at forudsige sygdom tilbagefald.

Vi sammenlignede også levende CTC tæller til kirurgisk status margin. De 25 patienter med negative marginer havde et gennemsnit på 25 levende CTCs /ml (interval 0-148), i forhold til de 15 patienter med positive margener, der havde et gennemsnit på 54 levende CTCs /ml (interval 2-439). Forskellen var ikke statistisk signifikant, sandsynligvis på grund af den markante variation mellem individer og den begrænsede stikprøvestørrelse.

Mens de fleste af patienterne i vores kohorte havde Gleason 6 eller 7 patologier, blev ingen sammenhæng fundet mellem Gleason score og leve CTC numre. På den anden side, patienter med højere levende CTC tællinger trended mod at have mere fremskreden sygdom ved tumor staging. Der var en signifikant sammenhæng mellem levende CTC tæller og T scenen, med PT3 patienter har højere tæller end PT2 tilfælde (median 8 vs. 19,

s

= 0,02). Især den eneste patient med lymfeknude-positiv PN1 sygdom havde den højeste levende CTC count (439 CTCs /ml, patient 39, tabel 1). Høje levende CTC tæller derfor syntes korreleret til avancerede tumor stadier.

3. Vurderinger af Levende CTCs hos patienter med metastatisk Sygdomme

Konsekutive blodprøver blev opnået fra 5 PCA patienter, hvis sygdom var recidiverende og spredt efter indledende behandling. Disse patienter blev undergår forskellige former for systemisk behandling. I modsætning til den levende og samlede CTC tæller i patienter med lokaliseret sygdom, større forskelle mellem de samlede og lever CTC tællinger blev set (tabel 2), mens CTC tæller tværs tilfælde viste ringe korrelation til serum PSA fusion (figur 3). Ikke desto mindre, når de analyseres over tid for de enkelte patienter, vi identificeret interessante tendenser, som lever CTC tæller syntes at korrelere omvendt til den observerede klinisk fordel i respons på behandlinger.

CTC tællinger detekteret fra mCPRC patienter blev analyseret sammen med forløb terapeutisk intervention. To repræsentative resultater er vist. A, den gradvise forøgelse af CTC tæller i patient 41 korreleret med klinisk metastaserende progression. B, den vedvarende lave CTC tæller i patient 42 korreleret med gavnlige anticancer behandlingsformer.

Patient 41 begyndte bicalutamid behandling i starten af ​​prøvetagning for metastatisk kastrationsresistent PCa (mCRPC). Han oplevede asymptomatisk biokemiske (

dvs..

Serum PSA) progression i to måneder, hvor levende CTC tæller oprindeligt faldt, men steg hurtigt. Behandlingen blev ændret til abirateronacetat, som ikke gav en biokemisk reaktion. Patienten udviklede symptomatisk ossøse metastatisk sygdom og krævede strålebehandling. Under sygdomsprogression, blev de samlede CTC tællinger vedvarende, men den levende CTC andelen steget sammen med serum PSA-niveau (tabel 2 og figur 3A).

Patient 42 blev udsat for CTC påvisning, før den første cyklus med docetaxel, hvilket resulterede i en fremragende respons bedømt af den fortsatte dråbe serum PSA-niveau, selv efter behandlingen blev afsluttet. Patienten forblev symptomfri i yderligere 4 måneder før at skulle foretage en anden 8 cykler af docetaxel til symptomatisk progression. Under behandlingen patientens CTC tællinger faldet markant, fra 82 ned til 6, og levende CTCs reduceret tilsvarende, nemlig fra 37 til 0%. Denne patient oplevede en stigning i den samlede og levende CTCs løbet af docetaxel behandling fra dag-20 til dag-139. Hen mod slutningen af ​​docetaxel behandling (fra dag-102 til dag-139), vi observerede levende CTCs igen stiger fra 14 til 94% (tabel 2 og figur 3B).

Patient 43 oprindeligt modtog docetaxel, som han viste indledende biokemiske og kliniske respons. Den anden cyklus af docetaxel behandling blev imidlertid efterfulgt af hurtig sygdomsprogression med progressiv klinisk forværring (

dvs..

, Forværring smerter og vægttab) og en stigning i serum-PSA. Vi bemærkede en dramatisk stigning i andelen af ​​levende CTCs (fra 2% op til 97%) uden væsentlige ændringer af de samlede CTCs (varierede fra 36 til 44). Patienten er udløbet i løbet af de næste 2 måneder med hurtig klinisk forværring. Den levende CTC tæller steg markant sammen med forværringen (tabel 2).

Patient 44 blev behandlet med bicalutamid for mCPRC. Behandlingen resulterede ikke i biokemisk fordel, men et brat fald i CTC nytter fra 1052 til 54, noteret. Trods denne dramatiske fald i total CTCs imidlertid procentdelen af ​​levende CTCs ændredes ikke væsentligt forbliver i området på 63 til 88%. CTC tæller steg 54-196 mellem dag-25 til dag-73 på det tidspunkt, hvor bicalutamid behandling blev afsluttet. Denne patient krævede palliativ stråling og en kvaternær hormonel manøvre (tabel 2).

Patient 45 havde kastration følsom PCa og blev udsat for intermitterende androgen suppression terapi, der var blevet indledt 4 måneder før den første CTC afsløring. Levende CTC optælling var under grænsen for detektion, i god overensstemmelse med den godt undertrykt serum PSA koncentration (tabel 2). I dette tilfælde, den efterfølgende stigning af levende CTC tæller var 4 måneder tidligere end PSA rebound, som senere blev undertrykt med androgen deprivation terapi. Det er dog værd at bemærke, at denne patient havde en høj procentdel af levende CTCs (83-84%) på trods af hormonal undertrykkelse terapi.

4. Isolering af levende CTCs til yderligere molekylær karakterisering

NIR farvning lettet identifikation og isolering af levende CTCs fra kliniske blodprøver (figur 2). Vi testede de isolerede CTCs for yderligere at undersøge PCa-relaterede molekylære forandringer. I en sådan undersøgelse, blev CTCs i PCA patienter isoleret baseret på EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ farvning. Proteinekspression i de CTCs påvistes ved mQDL og blev udført for at verificere ekspression af et panel af protein biomarkører forbundet med PCa progression og metastase, at vores gruppe følger aktivt [22]. Disse assays viste, at den unormale ekspression af RANKL, HIF-1α, NRP-1 og VEGF proteiner set i kliniske PCA tumorprøver [22] let kunne detekteres i de isolerede CTCs (figur 4A). Tilsvarende kliniske tumorer, forbedret phosphorylering af c-Met, samt p65 subunit af NFKB, blev fundet i samme CTC population. Interessant nok signal kvantificering af de farvede CTCs afslørede bemærkelsesværdig intercellulær heterogenitet, som individuelle proteiner blev påvist med varieret niveauer blandt CTCs (figur 4B). Yderligere undersøgelse er dog nødvendig for at vurdere omfanget af CTC heterogenitet på genekspression niveau.

Levende CTCs fra den første prøve fra patient 44 (tabel 2) blev isoleret på et objektglas og udsat for mQDL farvning status som et panel af proteiner dokumenteret at forholde sig til PCa progression. A, Spektrale billeder fra to repræsentative CTCs er vist på de to øverste paneler (8 billeder hver der repræsenterer ekspressionsniveauet for RANKL, pc-Met, HIF-1α, pp65, NRP-1 og VEGF, 400 ×; bar = 50 um ). B, Kvantificering af spektrale billedstyrker af de seks proteiner, der er angivet i panel A fra fem farvede celler fra den samme patient. Det relative niveau af genekspression blev beregnet på grundlag af ekspressionen af ​​HIF-1α, der blev tildelt som 1,0.

Diskussion

Vi udviklede en protokol til vurdering af tilstedeværelsen af ​​levende CTCs baseret på den aktive optagelse af prototype IR-783 heptamethine carbocyanin farvestof [19], [20]. I kombination med antistoffer mod EpCAM, IR-783-farvning identificerede levende humane PC-3-celler tilsat til rask donor blod med høj reproducerbarhed og korrelationskoefficienten (figur 1). Vi har konstateret, at aktiv transport af IR-783 i tumorceller kan anvendes som et funktionelt assay til at påvise levedygtigheden tumorcelle (figur 2B). Denne konklusion understreges yderligere af manglen på IR-783 farvestof optagelse i døde tumorceller (fryse-tø og /eller ethanol fast) tilsat i rask donor blod (data ikke vist). Vi har med held påvist og isoleret levende CTCs fra kliniske prøver af primær PCa (figur 2 og tabel 1) og mCPRC patienter (figur 3 og tabel 2). I et proof-of-concept studie, de isolerede levende CTCs var modtagelig for multiplex detektion af protein niveauer på enkelt celle niveau frisk isolerede CTCs bruger en mQDL metode (figur 4). Resultaterne kollektivt tyder på, at: 1) IR-783-farvning kan differentiere levende CTCs fra i alt opregnede CTC population i en given patient i realtid; kan etableres 2) Sammenhænge mellem procentdelen af ​​levende CTCs og udvikling af progressive og terapeutisk-resistent sygdom;