PLoS ONE: Den Engineered thymidylatkinase (TMPK) /AZT Enzym-prodrug Axis Tilbud Effektiv tilskuerplacering Cell Killing for Suicide Genterapi af Cancer

Abstrakt

Vi har tidligere beskrevet en roman selvmord (eller “celle skæbne kontrol ‘ ) genterapi enzym /prodrug system baseret på en manipuleret variant af human thymidylatkinase (TMPK), der potentierer azidothymidin (AZT) aktivering. Levering af et selvmord gensekvens i tumorer ved lentiviral transduktion rummer en cancer genterapi, der kunne ansætte tilskuer celle drab som en mekanisme kørsel betydelig tumorregression

in vivo

. Her præsenterer vi tegn på en væsentlig tilskuer celledræbende

in vitro

in vivo

medieret af de TMPK /AZT selvmord gen akse, der er afhængige af dannelsen af ​​funktionelle gap-junktionel intercellulære kommunikation ( GJICs). Potensering af AZT aktivering ved det manipulerede TMPK udtrykt i human prostatacancer-cellelinie, PC-3, resulterede i en effektiv bystander drab af PC-3-celler, der mangler TMPK ekspression – en effekt, der kunne blive blokeret af GJIC inhibitor, carbenoxolon. Selvom GJICs hovedsageligt er dannet af connexiner, har en ny familie af GJIC molekyler udpegede pannexins nylig blevet identificeret. PC-3 celler udtrykte både connexin43 (Cx43) og Pannexin1 (Panx1), men Panx1 udtryk dominerede på plasmamembranen, mens Cx43 udtryk primært var lokaliseret til cytosolen. Bidraget fra bystander effekter til reduktion af faste tumorxenotransplantater fastsat af PC-3-cellelinjen blev evalueret i en dyremodel. Vi demonstrerer bidrag bystander celledrab til tumorregression i en xenograft model bygger på levering af ekspression af TMPK selvmordsgen i tumorer via direkte intratumoral injektion af rekombinant terapeutisk lentivirus. Tilsammen vores data understreger, at de TMPK /AZT enzym-prodrug-akse kan effektivt anvendes i selvmordsgen terapi af faste tumorer, hvor signifikant tumorregression kan opnås via bystander virkninger medieret af GJICs

Henvisning:. Sato T, Neschadim A, Lavie A, Yanagisawa T, Medin JA (2013) Den Engineered thymidylatkinase (TMPK) /AZT Enzym-prodrug Axis Tilbud Effektiv tilskuerplacering Cell Killing for Suicide Genterapi of Cancer. PLoS ONE 8 (10): e78711. doi: 10,1371 /journal.pone.0078711

Redaktør: Joseph Najbauer, University of Pécs Medical School, Ungarn

Modtaget: Juni 3, 2013; Accepteret: September 16, 2013; Udgivet: 23. oktober 2013 |

Copyright: © 2013 Sato et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret delvist af Grant-i støtte til videnskabelig forskning (C) (20.590.533) til TS fra Japan Society for fremme af Science (JSP’er) og af forskningsbevilling fra Saito Gratitude Foundation til T.S .. A.N. blev finansieret af den canadiske Institutes of Health Research (CIHR) Training Program i regenerativ medicin. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

genterapifremgangsmåder anvendelse af rekombinant oncoretroviral eller lentivirusvektorer til afgivelse af gener, der forstærker forskellige farmakologiske terapier direkte i faste tumorer er lovende ved behandling af faste maligniteter, der er vanskelige at fjerne kirurgisk, såsom cancere plager hjernen [1]. Selvmordsgen terapi af cancer (SGTC), også betegnet gen-rettet enzym-prodrug-terapi (GDEPT), beror typisk på intratumoral levering af selvmordsgener, der letter selektiv og lokal aktivering af specifikke prodrugs til deres cytotoksiske effektor-derivater. Transcriptional- og pseudotype-baserede målretning af virioner til kræftceller yderligere udvide de potentielle anvendelser omfatter metastatiske læsioner og udvide levering metode til systemisk administration [2,3]. De store udfordringer forbundet med at levere selvmord gen i hver og maligne celler er ofte overvindes ved at stole på tilskuer celle drab, eller tilskuer effekter, som skaber en lokaliseret kill zone rundt om succes transducerede tumorceller, der funktionelt udtrykker selvmord genet, hvilket vil øge den samlede SGTC virkningsfuldhed [4].

Adskillige selvmordsgener er blevet karakteriseret og evalueret hidtil med hensyn til deres anvendelighed til SGTC. Blandt dem, herpes simplex virus-afledt thymidinkinase (HSV-tk) er en af ​​de mest omfattende undersøgt selvmordsgener for SGTC [5]. HSV-tk og forskellige katalytisk forbedrede mutanter af dette enzym er ofte blevet brugt som et selvmordsgen i kombination med guanosin analog, ganciclovir (GCV), til behandling af forskellige cancertyper [1,6]. HSV-tk omdanner ikke-toksisk GCV i GCV-monophosphat (GCV-MP), som yderligere fosforyleres af cellulære kinaser til den toksiske metabolit, GCV-triphosphat (GCV-TP), som inhiberer værtscelle DNA-replikation medfører induktion af apoptose [7]. Bystander virkninger er blevet velkarakteriseret i HSV-tk /GCV selvmord genterapi-system, og menes at involvere diffusionen af ​​aktiverede GCV, enten mono- eller multipelt phosphoryleret form, fra HSV-tk-udtrykkende celler til bystander celler gennem gap-junktion intercellulære kommunikation (GJICs), der forbinder cytosol af tilstødende celler i mange solide tumorer og tillader udveksling af små molekylvægt metabolitter ved diffusion [8]. En række faktorer begrænser den samlede effekt af HSV-tk til brug i SGTC herunder: dårlig aktivering af GCV af HSV-tk i sin cytotoksiske form primært forbundet med det hastighedsbegrænsende trin i GCV aktivering være phosphorylering af GCV-MP i GCV -DP af det cellulære guanylat kinase (GMPK) [9]; begrænset cytotoksicitet GCV, navnlig mod langsomt voksende tumorer, givet sin begrænsede virkningsmekanisme, der bygger udelukkende på DNA-replikation [10]; og endelig den dårlige lipofilicitet GCV resulterer i reducerede bystander virkninger, og en ringe evne til at krydse blod-hjerne-barrieren begrænser således anvendelighed i hjerne-målrettet SGTC [11]. Tilsammen SGTC tilgange udnytte HSV-tk /GCV akse er således begrænset af begrænset cytotoksicitet og problemer med en effektiv dosering med GCV, som kan have til at blive brugt ved koncentrationer, der er systemisk myelosuppressivt at opnå betydelige tumor ablation.

Vi har tidligere beskrevne alternative enzym prodrug systemer til selvmord (eller »cell skæbne kontrol”) genterapi [12,13], hvoraf den ene anvender en katalytisk forstærket variant af den humane thymidylatkinase (TMPK-F105Y), der er aktiveret at potensere den hurtige aktivering af prodrug azidothymidin (AZT) [12]. Katalytisk, vildtype TMPK er forholdsvis langsom i phosphorylering af AZT-monophosphat, som er flaskehalsen trin i dens aktivering pathway i pattedyrceller. Den F105Y mutation, vedtaget på grundlag af sammenligning af en homolog region af gær TMPK sekvens, resulterer i en variant enzym, der er meget mere robust på phosphorylering AZT-monophosphat og mindre aktive på dens naturlige substrat, thymidylat monophosphat [14]. Denne hidtil ukendte selvmord genterapi akse anvender en menneske-oprindelse enzym med minimal mulighed for at forårsage uønskede immunreaktioner rettet mod transgenet, som observeres med HSV-tk-tilgange. Det udnytter også et enzym, der er katalytisk robust og virker på det hastighedsbegrænsende trin med AZT aktivering. Endvidere er det udnytter en prodrug, hvis cytotoksisk formular kan effektivt målrette både skillelinjen og ikke-delende celler på grund af to forskellige cytotoksicitet mekanismer [12]. Endelig udnytter en prodrug, der har bedre lipofilicitet profil og er sandsynligvis mere egnet til anvendelse i SGTC. Specifikt AZT skønnes at være mindst 30 gange mere lipofil end GCV [11], der forudsiger bedre passiv diffusion og øget egnethed AZT prodrug for selvmord genterapi af faste tumorer, samt bedre levering af prolægemidlet til hjerne, f.eks. På grund af disse overlegne egenskaber TMPK /AZT selvmord genterapi akse, vi satte os for at vurdere egnetheden af ​​dette system, og størrelsen af ​​bystander virkninger det ville afføde i SGTC.

I denne undersøgelse rapporterer vi at vedvarende ekspression af katalytisk forstærket, AZT-aktive TMPK variant TMPK-F105Y, i den humane prostatacarcinom cancercellelinie, PC-3, ved transduktion med lentivirale konstruktioner let sensibiliserer disse celler til behandling med AZT og letter forbedret celledrab via tilskuer effekter både

in vitro

og

in vivo

. Vi viser, at tilskuer dræbende virkning, observeret efter AZT behandling, er i vid udstrækning afhængig af eksistensen af ​​funktionelle GJICs og ophæves ved behandling med en gap junction-hæmmer. Endvidere viser vi Pannexin1, og ikke Connexin43, sandsynligvis danner de funktionelle gap junctions mellem PC-3-celler. Disse resultater fremhæver nytten af ​​lentivirus-medieret SGTC baseret på modificeret TMPK /AZT-system og garanterer dets yderligere evaluering

in vivo

i specifikke modeller for kræft.

Materialer og Metoder

Etik Statement

Animal eksperimentelle procedurer fulgt en protokol godkendt af Animal Care udvalg af University Health Network (Toronto, ON, Canada). Dyrene blev fastholdt på Animal Resource Centre på prinsesse Margaret Hospital (Toronto, ON, Canada).

Cell kultur

Menneskelig prostataadenocarcinom PC-3-cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA) og opretholdt i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) -1640-medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; PAA Laboratories GmbH, Pasching , Østrig), 100 enheder /ml penicillin (Nakalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan), 100 ug /ml streptomycin (Nakalai Tesque, Inc.) og 250 ng /ml amphotericin B (Nakalai Tesque, Inc. ) i et 37 ° C, 5% CO

2 atmosfære ved konstant fugtighed. Den humane embryoniske nyre-afledt 293T cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA) og opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (D-MEM; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) tilsat 10% FBS , 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 2 mM L-glutamin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Produktion af rekombinant LV /TMPK og transduktion af PC-3 celler

Proceduren for produktion af vesikulær stomatitis-virus-glycoprotein (VSV-g) -pseudotyped rekombinant lentivirus, rapporterede tidligere af vores gruppe [12], blev anvendt med mindre modifikationer. Kort beskrevet transfektion af tre plasmider (pHR ‘gen-transfer plasmid, det pakkende plasmid pCMVR8.91, og vesikulær stomatitis virus glycoprotein konvolut-kodende plasmid pMD.G) i 293T-celler blev udført ved anvendelse af en polyethylenimin (PEI) -fremgangsmåden [15 ] og virusset supernatanter blev opsamlet ved 48 timer efter transfektion, filtreret med et 0,45 um filter og koncentreret ved 50.000 x g i 2 timer. PC-3-celler blev inficeret med de koncentrerede virusstammer i nærvær af 8 ug /ml protaminsulfat. Inficerede celler blev derefter encellede klonet ved begrænsende fortynding. Transgen ekspression i transducerede PC-3-celler blev bekræftet ved Western blot-analyse under anvendelse af kanin-anti-human TMPK (venligst tilvejebragt af Dr. Manfred Konrad, Max Plank Institute for Biophysical Chemistry, Gottingen, Tyskland). Til denne analyse blev totale cellelysater løst med 12,5% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og blottet på en polyvinylidendifluorid (PVDF) filtermembran (Millipore, Billerica, MA). Membranen blev blokeret med 0,5% fedtfri skummetmælk i 20 mM Tris-bufret saltvand med 0,05% Tween-20, pH 7,4 (TBS-T, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Membranen blev probet med kanin-anti-human TMPK (fortyndet 1: 5000), og derefter med det passende peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (fortyndet 1: 5000, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Lig protein loading blev bekræftet med et murint anti-GAPDH-antistof (fortyndet 1: 5.000, Ambion, Austin, TX, USA.). Membraner, efter udvikling med Immobilon vestlige Chemiluminescent HRP substrat (Millipore, Billerica, MA, USA), blev afbildet ved hjælp af LAS-1000-system (Fuji Film Corp., Tokyo, Japan) ladet-par enhedens kamera. Ekspression af det forstærkede grønt fluorescerende protein (eGFP) i de transducerede single-cellekloner blev bekræftet ved flowcytometrisk detektion (FACS Canto II, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

Dye transfer assay ved anvendelse af flowcytometri og konfokal mikroskopisk observation

I calcein mærkning, celler dyrket til semi-konfluens blev vasket to gange med PBS (uden calcium og magnesium), og derefter farvet i 15 minutter med 20 pM calcein-acetoxy methyl (calcein-AM, Doujin Chemical Co., Kumamoto, Japan) opløst i PBS (uden calcium og magnesium). Efter farvning med calcein blev cellerne vasket med RPMI-1640 indeholdende 10% FBS. For PKH26-mærkning blev cellerne vasket i PBS og resuspenderet i diluent C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) til en densitet på 10

7 celler /ml og farvet med 20 pM PKH26 (Sigma-Aldrich ) opløst i Diluent C i 5 min. Celler blev derefter vasket 3 gange med RPMI-1640 indeholdende 10% FBS. Både calcein-mærket og PKH26-mærkede celler blev blandet og co-dyrket i plader med 6 brønde (Corning Incorporated, Corning, NY, USA) i 3 dage. Farveoverføringsinhiberende blev analyseret ved flowcytometri (FACS Canto II, BD Biosciences) ved måling af fluorescensen af ​​calcein detekteret ved 514 nm og PKH26 detekteret ved 567nm. I en separat assay 100 pM carbenoxolon (CBX; Sigma-Aldrich) blev tilsat til cellekulturerne til at undersøge dens evne til at blokere overførsel farvestof. Yderligere, for at opdage molekylerne, der deltager i gap junction-dannelse, immunfarvning af PC-3-celler blev udført. Kort fortalt, PC-3-celler, klæbet til Lab-TekII kammer slide (Nalge Nunc International Corp., Naperville, IL, USA), blev fikseret med 4% (vægt /volumen) bufret formalin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i 0,1 M phosphatpuffer, pH 7,4, og permeabiliseret med 0,1% (v /v) TritonX-100 i 15 min. Celler blev derefter blokeret med 5% normalt gedeserum, og blev sekventielt omsat med primært antistof (1: 100 fortynding i PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA)) ved 4 ° C natten over, efterfulgt af inkubation i PBS indeholdende den sekundære antistof (1: 500 fortynding i PBS indeholdende 1% BSA) mærket med Alexa488 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) og modfarvet med rhodamin phalloidin (Cytskelton, Inc., Denver, CO, USA) i 3 timer ved stue temperatur. Antistoffer anvendt i denne undersøgelse var som følger: kanin anti-connexin43 antistof (Signalway Antibody, College Park, MA, USA), kanin-anti-pannexin1 antistof (EMD Millipore Corp., Billerica, MA, USA), og Alexa488-mærket gede-anti -rabbit IgG-antistof (Molecular Probes, Inc.). Fluorescens signaler blev analyseret ved hjælp af en konfokal laser-scanning mikroskop LSM-5 og LSM Anlægsudførelse 3,98 (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) på Biomedical Research Core af Tohoku University Graduate School of Medicine.

Cell proliferationsassays

celler blev podet i 96-brønds plader (Corning Incorporated) ved 5 × 10

5 celler /brønd i 200 pi RPMI-1640 medium suppleret som beskrevet ovenfor, og inkuberet med stigende koncentrationer af AZT (0, 0,1, 1, 10, 100 uM, og 1 mM; Sigma-Aldrich). Mediet blev opdateres dagligt. Efter 4 dages dyrkning blev cellelevedygtighed bestemt ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (Doujin Chemical Co.). Til bestemmelse af det optimale celle ratio for efterfølgende bystander eksperimenter blev både eGFP-udtrykkende celler og TMPK-F105Y-transducerede celler podedes på plader med 96 brønde i forskellige forhold, og dyrket i nærvær af 10 uM AZT i 5 dage. Cellelevedygtighed blev bestemt som ovenfor under anvendelse af celle Counting Kit-8 (Doujin Chemical Co.).

Evaluering af apoptose

Celler blev podet i plader med 6 brønde (Corning Incorporated) ved 10

6 celler /brønd i 5 ml celledyrkningsmedium (RPMI-1640 suppleret med 10% FBS, antibiotika, og antimykotika, som beskrevet ovenfor), med eller uden 10 uM AZT. Efter 4 dages dyrkning blev annexin V-farvning udført i overensstemmelse med producentens protokol (Annexin V-APC; BD Pharmingen, San Diego, CA). For at bekræfte kravet om GJICs for bystander drab induceret af AZT, 100 uM carbenoxolon (CBX; Sigma-Aldrich) blev tilsat samtidigt med AZT til kulturen. Relative apoptotiske indeks blev beregnet som normaliserede forhold mellem apoptose i AZT-behandlet til AZT-ubehandlede celler. For at undersøge bidraget af opløselige faktorer secerneret fra AZT-behandlede celler, vildtype-PC-3-celler blev dyrket i 5 dage i det konditionerede medium opsamlet fra vildtype TMPK eller TMPK-F105Y-udtrykkende celler, der var behandlet med 10 pM AZT i 5 dage efterfulgt af vurdering af apoptose induktion i disse celler som ovenfor.

reaktive oxygenarter (ROS) assay

Generering af intracellulære reaktive oxygenarter (ROS) blev overvåget af dihydroethidium ( DHE) procedure [16]. Kort fortalt, efter de angivne behandling tidspunkter, cellerne blev yderligere inkuberet med DHE (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. Fluorescensemission intensitet ved 525 nm (efter excitation ved 488 nm) blev målt ved et flowcytometer (FACS Canto II, BD Biosciences). Ændringen i den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) målte prøver fra hver behandlingsgruppe blev udtrykt som en procentdel af DHE fluorescens af ubehandlede kontrolceller.

Evaluering af tilskuer-virkning in vivo efter en intratumoral injektion af LV /TMPK

Ikke-fede diabetiske /svær kombineret immundefekt (NOD /SCID) mus (5-8 uger gamle, købt hos Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) blev fastholdt på Animal Resource Centre på prinsesse Margaret Hospital (Toronto , ON, Canada). Dyr blev injiceret på dag 0 i deres højre dorsale flanke med 4×10

6 LV /eGFP-transducerede PC-3-celler suspenderet i 200 pi phosphatpufret saltvand (PBS). Ca. 10 pi af en LV /TMPK-F105Y (1,5×10

8 IU /ml) præparat blev injiceret intratumoralt på dag 11. Dyr i lægemiddelbehandlede grupper fik en dosis på 50 mg /kg /dag af AZT intraperitonealt til 6 dage startende på dag 12. De eksperimentelle grupper var som følger: PC-3-TMPK-F105Y behandlet med AZT og PC-3-TMPK-F105Y behandlet med vehikel (PBS). Dyr blev aflivet på dag 18; tumorer blev derefter høstet og vejet

Statistik

Statistisk signifikans mellem grupperne blev evalueret af envejs ANOVA analyser med Bonferroni post-hoc test med GraphPad InStat (ver 3,0 A til Macintosh..; GraphPad Software, San Diego CA).

Resultater

PC-3 celler udtrykker funktionelle GJICs består af pannexin1

Gap forbindelsesepitoper intracellulære kommunikation (GJICs), ud over at spille en direkte rolle i tumorudvikling [17], anses for at være vigtige for bystander celledræbende virkning i SGTC applikationer [18]. GJICs omfatter typisk proteiner af connexin familien, og som for nylig blev vist, fra proteiner af pannexin familien samt [19]. GJICs tillader den passive diffusion af små molekyler (≤1 kDa i størrelse) mellem tilstødende, forbundet celler. Udtrykkene for centrale GJIC proteiner, connexin43 og pannexin1, blev bekræftet i PC-3-celler ved hjælp af Western blot-analyse (figur 1A); udtryk for vildtype TMPK og TMPK-F105Y blev også bekræftet analogt (figur 1B). De spredningsmønstre for connexin43 og pannexin1, som bestemt af konfokal immunfluorescent mikroskopi analyse afslørede dog, at PC-3 celler overvejende udtrykkelig connexin43 i cytoplasmatiske perinukleære rum (figur 1C, venstre panel), mens pannexin1 primært var lokaliseret til plasmamembranen, observeret som pletter og striber, som er kendetegnende for GJIC udseende mønster (figur 1C, højre panel). Dette fund tyder på, at pannexin1 kan fremtrædende end connexin43 i dannelsen af ​​funktionelle GJICs i denne prostatacancer-cellelinie.

(A) Ekspression af GJIC komponenter, connexin43 og pannexin1, blev bekræftet ved Western blot på hel-cellelysater af ikke-transduceret, LV /TMPK-transducerede, og LV /eGFP-transducerede PC-3-celler. GAPDH-ekspression blev vurderet som en ligeværdig loading kontrol. (B) Ekspression af TMPK blev bekræftet ved Western blot på hel-cellelysater af ikke-transduceret, LV /TMPK-transducerede, og LV /TMPK-F105Y-transducerede PC-3-celler. GAPDH-ekspression blev vurderet som en ligeværdig loading kontrol. (C) Ekspression mønster af connexin43 (venstre panel) og pannexin1 (højre panel) GJIC komponenter (grøn fluorescens) blev vurderet ved konfokal immunofluorescens-mikroskopi. Cytoskelettet (F-actin) blev visualiseret med rhodamin phalloidin (rød fluorescens) farvning. (D) Dye overførsel af calcein ind i tilstødende PKH26-mærkede celler blev målt ved flowcytometri i direkte (normale) eller transwell co-kulturer af PC-3-celler som procentdelen af ​​celler dobbelt-positive for calcein og PKH26 fluorescens (n ​​= 3) . (E) Dye overførsel af calcein ind i tilstødende PKH26-mærkede celler blev signifikant inhiberet af carbenoxolon (CBX) (n = 3). Statistisk signifikans er angivet (p 0,0001).

Vi næste undersøgt dannelsen af ​​funktionelle GJICs i PC-3 celler i en overførsel farvestof eksperiment. To cellepopulationer, separat og stabilt mærket med en af ​​to forskellige farvestoffer (calcein, som er ikke-membran permeabel og er fanget i cellen cytosolen, og PKH26, som specifikt etiketter cellemembraner) udviste farveoverførsel i 2 dage lange co- kulturer, som påvist ved fremkomst af dobbelt-mærkede celler (figur 1D). Denne calcein farvestof overførsel til PKH26-mærkede celler, der kræves direkte celle-celle-kontakt, som farvestoffet overførsel var ikke synlige i differentielt mærkede celler, som blev dyrket i et trans-brønd-system (figur 1D). Endvidere blev farveoverførsel signifikant inhiberet i nærvær af en specifik gap junction-inhibitor, carbenoxolon (CBX) (figur 1E). Taget under ét, data tyder på, at calcein overførsel farvestof i PKH26-mærkede celler krævede direkte celle-celle kontakt, og blev sandsynligvis fremmet af funktionelle GJICs.

Evaluering af AZT-medieret celledrab af LV /TMPK-transducerede PC-3-celler og bystander effekter

PC-3-celler blev transduceret med lentivirale vektorer engineering ekspression af enten vildtype TMPK eller TMPK-F105Y. TMPK og TMPK-F105Y ekspression blev bekræftet ved Western blot-analyse under anvendelse af et kanin-anti-humant TMPK antistof i individuelle cellekloner isoleret ved begrænsende fortynding (figur 1B). Mens endogen TMPK ekspression var påviselig i de ikke-transducerede (NT) celler, blev en signifikant overekspression af TMPK observeret i de transducerede celler. Dosisafhængig AZT følsomhed PC-3-cellekloner der udtrykker vildtype-TMPK, som er ude af stand til at aktivere AZT betydeligt, eller AZT-aktive TMPK-F105Y mutant, blev vurderet i cellekultur. PC-celler, der udtrykker TMPK-F105Y mutanten var meget følsomme over for behandling med stigende koncentrationer af AZT (IC50 på 1,8 pM) sammenlignet med ikke-transducerede celler eller celler, der overudtrykker vildtype TMPK (IC50 på 1 mM og 0,1 mM henholdsvis) (figur 2A). Baseret på de fastlagte dosisresponser, en dosis på 10 uM AZT blev udvalgt til efterfølgende eksperimenter som en dosis, der var meget effektive i TMPK-F105Y-udtrykkende celler, men udviste ingen påviselig toksicitet i ikke-transducerede celler eller celler, der overudtrykker vildtype TMPK.

(A) Dosisafhængig celledrab af LV-transducerede PC-3-celler inkuberet med stigende koncentrationer af AZT (middel +/- SEM, n = 3). (B) Induktion af apoptose med 10 uM AZT blev vurderet ved annexin V-farvning af behandlede TMPK-F105Y celler. (C) Sprøjtepersonalet celledrab blev vurderet ved relativ vurdering af annexin V-farvning i AZT-behandlet til ubehandlet bystander eGFP-udtrykkende PC-3-celler ved flowcytometri i direkte (normal) og transwell co-kulturer af eGFP-transduceret med TMPK-WT – eller TMPK-F105-transducerede PC-3-celler (n = 3). Statistisk signifikans er angivet (p 0,0001). (D) Bestemmelse af optimale forhold mellem eGFP-udtrykkende celler til TMPKF105Y-udtrykkende celler at evaluere bystander dræbe effekter ved 10 uM AZT (gennemsnit +/- SEM, n = 4; * p 0,05, ** p 0,01 ). (E) Induktion af apoptose i vildtype PC-3-celler ved konditionerede medier fra AZT-behandlede vildtype TMPK-transducerede og TMPK-F105Y-transducerede PC-3-celler normaliseret til apoptose i celler behandlet med konditioneret medium fra AZT-ubehandlet celler (n = 3).

for yderligere at bekræfte den specifikke induktion af apoptose i TMPK-F105Y-udtrykkende celler efter inkubation med 10 pM AZT, vi vurderede eksponering af en apoptotisk markering, phosphatidylserin (PS ), på celleoverfladen af ​​behandlede celler ved farvning med APC-konjugeret annexin V-protein. TMPK-F105Y-transducerede celler dyrket i nærvær af 10 uM AZT, men ikke andre kontrol cellegrupper, udviste en signifikant induktion af apoptose som vist ved en mere end 3 gange stigning i den apoptotiske indeks af disse celler (figur 2B).

at evaluere bystander celledrab medieret af TMPK-F105Y-afledte aktivering af AZT i PC-3-celler, TMPK-transducerede og ikke-transducerede kontrolceller var direkte co-dyrket med uafhængige PC-3 celler konstrueret til udtrykker stabilt den forstærkede grønt fluorescerende protein (eGFP). Co-kulturer behandlet med AZT blev evalueret ved annexin V (og 7-AAD) farvning for induktion af apoptose i EGFP-positive PC-3 cellepopulation. Som vist i figur 2C (hvide søjler), kun eGFP-positive bystander-celler co-dyrket med celler, der udtrykker AZT-aktive TMPK-F105Y og ikke vildtype TMPK viste en signifikant stigning i den apoptotiske indeks ved AZT-behandling. TMPK-udtrykkende effektorceller og eGFP-udtrykkende bystander-celler kræver direkte celle-celle-kontakt, idet der blev observeret nogen stigning i den apoptotiske indeks for bystander celler, når de cellepopulationer, hvor adskilt af et trans-brønd-system (figur 2C, skraverede søjler). Den tilskuer dræbende effekt i co-kulturer med en 1: 4 forhold af eGFP-udtrykkende celler (20%) til TMPK-F105Y-udtrykkende celler (80%) var meget signifikant fører til et samlet fald på 80% i celle overlevelse i co -kulturer efter 5 dages AZT-behandling (figur 2D), hvilket antyder, at en potent tilskuer dræbende virkning kunne observeres. For yderligere at bekræfte, at tilskuer-virkning observeres ikke var medieret af opløselige faktorer secerneret fra TMPK-F105Y-udtrykkende, AZT-behandlede celler, dyrkede vi ikke-transducerede PC-3-celler i de konditionerede medier opsamlet fra vildtype TMPK eller TMPK-F105Y udtrykkende celler behandlet med 10 pM AZT i 5 dage. Under disse dyrkningsbetingelser, havde ikke-transducerede PC-3-celler ikke udviser signifikant celledød (figur 2E). Taget sammen indikerer disse data, at tilskuer dræbende virkning observeret medieres af overførsel af cytotoksiske AZT metabolitter ved en mekanisme, som kræver direkte celle-til-celle-kontakt.

rolle GJICs i mediering af tilskuer-virkning i PC-3 celler

for yderligere at undersøge mekanismerne i tilskuer-virkning observeret i PC-3 celler faciliteret af den TMPK-F105Y /AZT selvmord systemet, vurderede vi tilskuer celle drab observeret i eGFP-positive population direkte co-dyrket med TMPK-F105Y-udtrykkende celler behandlet med 10 pM AZT i fravær og nærvær af 100 uM af en specifik gap junction-inhibitor, carbenoxolon (CBX). Tilsætning af CBX til co-kultur helt afskaffet bystander celledrab (apoptotisk indeks 1) (figur 3A), hvilket viser, at tilskuer-virkning i vores PC-3 co-kulturer hovedsagelig medieres af funktionelle GJICs.

(A) Sprøjtepersonalet celledrab blev vurderet ved relativ vurdering af annexin V-farvning i AZT-behandlede bystander eGFP-udtrykkende PC-3-celler, co-dyrket med TMPK-F105Y-tranduced PC-3-celler ved flow cytometri. Co-kulturer blev enten ubehandlet eller behandlet med panden GJIC inhibitor, carbenoxolon (CBX) (n = 3). (B) Fold-ændring i produktionen af ​​reaktive oxygenspecies (ROS) på grund af AZT-behandling blev evalueret i vildtype TMPK-udtrykkende og TMPK-F105Y-udtrykkende PC-3-celler (n = 3). (C) gange ændring i produktionen af ​​reaktive oxygenspecies (ROS) på grund af AZT-behandling blev evalueret i eGFP-udtrykkende PC-3-celler, co-dyrket med TMPK-F105Y-tranduced PC-3-celler, med og uden carbenoxolon (CBX ) behandling (n = 3). Statistisk signifikans er angivet (p 0,0001).

Vi bestemt, at AZT aktivering i TMPK-F105Y-udtrykkende celler stiger reaktive ilt arter (ROS) produktion (figur 3B). Da det er velkendt, at ROS produktion ofte inducerer cellulære skader, der fører til celledød, vi spekuleret på, at produktionen af ​​ROS kan bidrage til tilskuer celle drab observeret i dette system. Vi har faktisk vist, at CBX behandling af vores co-kulturer, der ville forstyrre funktionelle GJICs resulterede i en reduktion af ROS fremstillet som følge af AZT behandling i bystander-celle population (figur 3C), hvilket antyder, at overførslen af ​​aktiverede AZT metabolitter til bystander celler inducerer produktionen af ​​ROS og potentielt bidrager til induktion af cellulære apoptose i disse celler.

Evaluering af AZT-medierede tilskuer effekter i human prostata cancer xenograftmodeller in vivo

for at evaluere effekten af ​​tilskuer virkninger induceret i TMPK-F105Y /AZT selvmord systemet

in vivo

egnethed denne fremgangsmåde for SGTC, vi ansat en PC-3 xenograft musemodel. Da dårlig transduktion af tumorceller ved vektorer ingeniør ekspression af selvmord gener er en generel begrænsning af GDEPT tilgange, vi søgte at undersøge, om tilskuer effekter i TMPK /AZT selvmord systemet er tilstrækkeligt robuste til eventuelt at kompensere for begrænsninger i tumor transduktion effektivitet. Her NOD /SCID dyr blev subkutant inokuleret med ikke-transducerede PC-3 tumorer, og efter 11 dages tumorvækst blev tydelige tumorer injiceret direkte, intratumoralt, med ~ 1,5×10

6 infektiøse viruspartikler engineering ekspressionen af TMPK-F105Y selvmordsgen. Begyndende 24 timer efter injektion af virionerne, dyrene fik dagligt intraperitoneale injektioner af AZT (50 mg /kg /dag) eller vehikelkontrol i 6 på hinanden følgende dage. Mus blev aflivet ved afslutningen af ​​behandlingsperioden, og tumorvæv blev høstet og vejet.