PLoS ONE: Identifikation af RegIV som en roman GLI1 Target Gene i Human kræft i bugspytkirtlen

Abstrakt

Baggrund og Formål

GLI1 er nøglen transkriptionel faktor i Hedgehog signalvejen i kræft i bugspytkirtlen. RegIV er forbundet med regenerering, og cellevækst, overlevelse, vedhæftning og modstandsdygtighed over for apoptose. Vi havde til formål at studere RegIV udtryk i bugspytkirtelkræft og dens forhold til GLI1.

Metoder

GLI1 og RegIV udtryk blev evalueret i tumorvæv og tilstødende normale væv af bugspytkirtlen kræftpatienter og 5 bugspytkirtelkræft celle linjer ved QRT-PCR, Western blot, og immunhistokemi (IHC), og sammenhængen mellem dem. Den GLI1-shRNA lentiviral vektor blev konstrueret og transficeret ind i PANC-1, og lentiviral vektor indeholdende GLI1 ekspressionssekvens blev konstrueret og transficeret ind BxPC-3. GLI1 og RegIV ekspression blev vurderet ved QRT-PCR og Western blot. Endelig viste vi RegIV at være mål for GLI1 ved kromatin immunpræcipitering (CHIP) og elektroforetiske mobilitet shift-assays (EMSA).

Resultater

Resultatet af IHC og QRT-PCR viste, at RegIV og GLI1 udtryk var højere i bugspytkirtelkræft væv versus tilstødende normale væv (p 0,001). RegIV udtryk korreleret med GLI1 udtryk i disse væv (R = 0,795, p 0,0001). Disse resultater blev verificeret for protein (R = 0,939, p = 0,018) og mRNA-ekspression (R = 0,959, p = 0,011) i 5 bugspytkirtelkræft cellelinjer. RegIV mRNA og protein-ekspression blev reduceret (94,7 ± 0,3%, 84,1 ± 0,5%, henholdsvis), når GLI1 blev slået ned (82,1 ± 3,2%, 76,7 ± 2,2%, henholdsvis) af RNAi-teknik. GLI1 overekspression i mRNA og proteinniveauet (924,5 ± 5,3%, 362,1 ± 3,5%, henholdsvis) inducerede RegIV overekspression (729,1 ± 4,3%, 339,0 ± 3,7%, henholdsvis). Desuden viste CHIP og EMSA analyser GLI1 proteinbundet til RegIV promotor regioner (GATCATCCA) i bugspytkirtelkræftceller.

Konklusion

GLI1 fremmer RegIV transskription ved binding til RegIV genpromotoren i kræft i bugspytkirtlen.

Henvisning: Wang F, Xu L, Guo C, Ke A, ​​Hu G, Xu X, et al. (2011) Identifikation af RegIV som en roman GLI1 Target Gene i Human kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 6 (4): e18434. doi: 10,1371 /journal.pone.0018434

Redaktør: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, USA

Modtaget: 10. oktober 2010; Accepteret: 4 marts 2011; Udgivet: 11 April, 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.072.065), Foundation for Shanghai Videnskab og Teknologi Udvalg (nr 09JC1412200, No. 09410705400), og ph.d. fonden af ​​Undervisningsministeriet i Kina (nr 20090072110022). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PC) er den fjerde mest almindelige kræftform-relaterede dødsårsag i den vestlige verden [1] – [3] og har en trist prognose trods betydelige fremskridt i forvaltningen. Den mediane overlevelse PC er mindre end 6 måneder; 5-års overlevelse er mindre end 5% [1], [2]. Mere end 80% til stede med inoperabel sygdom; en tredjedel har lokal sygdom, mens den resterende del har fjerne metastaser. Forskning i de sidste to årtier har vist, at PC er en genetisk sygdom fundamentalt, forårsaget af arvelige kimcellelinje og erhvervede somatiske mutationer i cancerassocierede gener. Tumor progression model til PC, hvor bugspytkirtlen ductal epitel skrider fra normal til øget kvaliteter af pancreas intraepitelialneoplasi (PanINs) til invasiv cancer. Flere ændringer i gener, der er vigtige i PC progression er blevet identificeret, for eksempel K-ras, INK4a, p53, og Smad4 /DPC4 [4], [5]. PC er karakteriseret ved næsten universelle mutationer i K-ras og hyppige deregulering af afgørende embryonale signalveje, herunder Hedgehog (HH) signalvejen [6], [7]. En bedre forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af ​​PC kan bidrage til at forbedre tidlig diagnose og potentielt identificere molekylære terapeutiske mål.

Pindsvinet (HH) signalvejen blev første gang identificeret i fosterudviklingen af ​​Drosophila [8] og har vist sig at være afgørende for væksten og mønsterdannelse i bugspytkirtlen under fosterudviklingen. HH signalering regulerer celledifferentiering og dannelse orgel under fosterudviklingen, og udtrykkes i pancreasepitelceller [9], [10]. Konstitutiv aktivering af HH signalering påvises i en række humane cancere, herunder pancreascancer [9] – [13]. I betragtning af dets misexpression både metastatisk bugspytkirtelkræft cellelinjer og i prækursorer læsioner (Panin) [14], kan HH signal aktivering være involveret i både tidlige og sene bugspytkirtlen tumorigenese.

Af de tre pattedyr ligander i HH familien , Sonic (SHH), Desert (DHH) og indiske (IHH) Hedgehog [15], den tidligere har været forbundet med både pancreas organogenese og kræft i bugspytkirtlen. HH signaler transmitteres og modificeret af to transmembrane proteiner, lappede (ptch) og smoothened (SMO), og downstream transkriptionsfaktorer, der er medlemmer af gliom-associerede onkogen (GLI) familie (GLI1, 2, og 3). GLI2 og GLI3 har transaktivering og repressive domæner, mens GLI1 sandsynlige fungerer kun som en transaktivator og transkriptionel mål af HH-vejen selv [16] – [19]. Den regenererende gen (Reg) familie, en gruppe af små sekretoriske proteiner, der er involveret i celleproliferation eller -differentiering i fordøjelsesorganer [20], opreguleres i flere gastrointestinale cancerformer, og fungerer som trofisk eller antiapoptotiske faktorer [21] – [23] . RegIV, et medlem af regenererende genfamilien, er involveret i fordøjelseskanalen maligne lidelser, inklusive maven [24], colorectum [25], [26], og pancreas [27], [28], samt i benigne sygdomme som ulcerativ colitis [29]. RegIV overekspression i tumorceller er blevet associeret med cellevækst, overlevelse, vedhæftning, og resistens over for apoptose. For nylig blev RegIV overekspression rapporteret at være associeret med initiering og progression af kræft i bugspytkirtlen, og blev foreslået som en lovende tumormarkør at screene tidligt stadium PC og mål for adjuverende behandling i PC [28], [30].

funktioner GLI1 og RegIV syntes at være ens i vores gennemgang af litteraturen; således, undersøgte vi det udtryk og korrelation af GLI1 og RegIV i pc-væv og cellelinier. Vi udforskede også mulig mekanisme mellem GLI1 og RegIV, ved hjælp af chip og EMSA-analyser.

Materialer og metoder

cellelinjer og væv

Humane bugspytkirtelkræft cellelinjer, Panc -1, AsPC-1, BxPC-3, Capan-2 og SW1990, blev købt fra kinesiske videnskabsakademi Udvalg Type Culture Collection celle bank. PANC-1 blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Gibco BRL, USA), de andre typer af celler blev dyrket i RPMI-1640 (Gibco BRL, USA), og alle medier blev suppleret med 10% FBS (Gibco BRL, USA), penicillin G (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C med 5% CO2. Tolv par PC og tilsvarende ikke-kræft bugspytkirtel væv blev opnået fra Shanghai Tenth Folkets Hospital med fuld skriftlig etisk samtykke. Ingen af ​​disse patienter havde fået kemoterapi eller strålebehandling før cancer resektion. Yderligere 9 parrede væv skiver blev opnået fra patologi afdeling af Shanghai tiende Folkets Hospital. Undersøgelsen blev godkendt af Etisk Komité Tongji University School of Medicine og Life Sciences.

Short Hårnål RNA (shRNA) Design og Vector Produktion

Forstyrrende sekvenser svarende til distinkte regioner i GLI1mRNA, som samt negativ kontrol uden homologi for humane eller muse-gener er designet af Shanghai GeneChem Biotech (tabel 1). Tre siRNA-duplexer blev screenet for GLI1 knock-down ved Western blot-analyse i cotransfektion eksperimenter med GLI1 ekspressionsplasmid i HEK 293T-celler. Den mest succesfulde sekvens og én ikke-silencing Luciferase sekvens blev designet til en shRNA oligonucleotid skabelon bestående af sense, hårnål loop, antisense, og terminatorsekvenser, som alle blev flankeret af restriktionsenzymsteder for at lette retningsbestemt subkloning. De resulterende vektorer kodede GFP under transkriptionel kontrol af EF1 promoter og en H1 promotor opstrøms for kloning restriktionssteder (

Mlu

I og

Cla

I) til indføring af oligonukleotider, der koder shRNAs. Enten shRNA mod GLI1 eller en nonsilencing-Luciferase shRNA blev placeret under H1-promotoren (figur 1). Den korrekte insertion af det specifikke shRNA blev yderligere bekræftet ved direkte DNA-sekventering.

I den GLI1-shRNA vektor, to enkeltstrengede DNA’er, der koder to linkere, målsekvenserne og en løkke element, syntetiseret. Disse blev annealet til dobbeltstrenget DNA, og ligeret ind i pLVTHM følgende

Mlu

I og

Cal

fordøjelse. Den korte hårnål form af shGLI1 udtrykkes under kontrol af humane H1 promotor. Vektoren indeholder også et humant EF1-α promotor, der driver GFP markørgenet til sporing transducerede celler. Vektorerne blev genereret ved forbigående transfektion af pRSV-REV, pMDlg-pRRE, pMD2G, og shRNA koder pLVTHM i 293T-celler. Forkortelser: RRE, Rev-responselement; cPPT, centralt polypurin tarmkanalen; EF1-α, human elongation faktor 1-α-promotor; H1, den humane H1 promotor; GFP, grønt fluorescerende protein; PRE, humant hepatitis virus posttranskriptionel regulatorisk element.

Til produktion af lentivirusvektoren, HEK 293T-celler blev dyrket til 30-40% sammenløb af den følgende dag. Den næste dag blev mediet udskiftet med DMEM /10% FBS uden antibiotika. Efterfølgende 20 ug shRNA plasmid-DNA (nonsens shRNA eller GLI1 målrettet shRNA, GeneChem Biotech, Shanghai, Kina), 7,5 pg pMD2G, 10 pg pRSV-Rev, og 15 ug pMDLg-pRRE blev blandet med sterilt Hedeselskabet

2O til et slutvolumen på 1800 pi, derefter blandet med 200 pi 2,5 M CaCl

2. DNA-blandingen blev iltet og 2000 pi 2 × PBS (pH 7,05) tilsat dråbevis, og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter. Transfektionsblandingen blev tilsat til deres respektive plader og inkuberet natten over. Mediet blev udskiftet efter 12 timer med DMEM suppleret med 10% FBS. Efter 48 timer blev det konditionerede medium indeholdende shRNA lentivirus opsamlet og filtreret gennem 0,45 um porestørrelse celluloseacetatfiltre og opbevaret på is. Virusset blev koncentreret ved centrifugering ved 70.000 G i 2 timer og resuspenderet med 500 pi PBS. Transduktionen enhed (TU) titer blev vurderet på HEK 293T-celler i nærvær af polybren 8 ug /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Titere af 2-5 × 10

8 TU /ml blev rutinemæssigt opnået.

Overekspression-GLI1 Lentiviral Vector Construction

Humant GLI1 cDNA blev købt fra Open-Biosystem (USA). Den komplette cDNA sekvens af GLI1 blev frembragt ved PCR under anvendelse af fremadrettet primer, 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTTCAACTCGATGACCCCAC-3 ‘; og revers primer, 5’-TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGGCACTAGAGTTGAGGA-3 ‘; derefter indsat i en pGC-FU-EGFP-3FLAG Vector (GeneChem Company, Shanghai, Kina). Transformanter blev analyseret ved sekventering. Det resulterende 3320 bp fragment blev bekræftet ved sekventering (fig S1) og sammenlignet med sekvensen af ​​GLI1 genekspression region i GenBank (NM_005269.2). For at producere lentiviral stock blev 293FT celler dyrket til 70-85% konfluens den følgende dag. Den komplette dyrkningsmedium blev fjernet. Cellerne blev derefter udsat for 5 ml medium (Opti-MEM, Invitrogen) med komplekser indeholdende emballage hjælper konstruktion (GeneChem Company, Shanghai, Kina), 20 ug ekspressionsplasmid DNA (pGC-FU-EGFP-3FLAG-GLI1), eller kontrol plasmid DNA (pGC-FU-EGFP-3FLAG) med 100 pi lipofectamin 2000 (Invitrogen, USA) i nærvær af polybren (8 ug /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Efter inkubation i 24 timer blev infektion mediet erstattet med komplet dyrkningsmedium. Lentivirus-holdige supernatanter blev høstet 72 timer efter transfektion. Supernatanterne blev centrifugeret for at fjerne pellet debris og opbevaret ved -80 ° C. Titere af 2-5 × 10

7 TU /ml blev rutinemæssigt opnået.

Lentiviral transfektion

Celler (1 x 10

5) i en plade med seks brønde blev transficeret med den lentivirale vektor ved en infektionsmultiplicitet (MOI) = 5 (PANC-1) eller 20 (BxPC-3) i nærvær af 8 ug /ml polybren (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Efter 72 timers transfektion blev mediet udskiftet med 2 ml komplet dyrkningsmedium. 48 timer efter transfektion blev GLI1 udtryk oprettet ved real time-PCR og Western blot-analyse.

flowcytometri

Cellerne blev justeret til 1 x 10

6 celler /100 pi og anvendt for flowcytometri. I alt 10.000 hændelser blev analyseret for at bestemme transfektionseffektiviteten anvendelse af FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) Cell-Quest software.

QRT-PCR

Real-time kvantitativ revers-transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR) -analyse blev udført med ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA). GLI1 og RegIV mRNA-ekspression blev analyseret ved QRT-PCR under anvendelse af SYBR Green Dye. β-actin blev anvendt som housekeeping-genet. Target genekspression blev normaliseret til p-actin og analyseret af 2

-ΔΔCT

formel. Primersekvenserne er som følger: GLI1, fremad: TTCCTACCAGAGTCCCAAGT, omvendt: CCCTATGTGAAGCCCTATTT, RegIV, frem: CGCTGAGATGAACCCCAAG, omvendt: TGAGAGGGAAGTGGGAAGAG. β-actin, frem: AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA, omvendt: CTGGAACGGTGAAGGTGACA. Alle reaktioner blev udført mindst tre gange.

Western blot-analyse

Celler blev skyllet to gange i PBS, lyseres derefter i 2 timer i RIPA-lysepuffer på is og centrifugeret ved 12.000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved standard BCA fremgangsmåden (BCA ™ Protein Assay Kit, Pierce, USA). 50 ug totalt protein blev separeret ved SDS-PAGE ved anvendelse af 6% eller 12% polyacrylamidgel med Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, USA). GLI1 og RegIV protein i gel blev overført til en 0,45-um nitrocellulose membran med Mini Transfer Cell og Trans-blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad, USA) hhv.

De immunoreagenser anvendes til Western blot var kanin monoklonalt antistof mod GLI1 (1:200, Santa Cruz, USA) og ged polyklonale anti-RegIV antistof (1:100, Santa Cruz, USA). Muse polyklonalt anti-β-actin-antistof (1:5000, Santa Cruz, USA) blev anvendt som indlæsning kontrol. Blottene blev fremkaldt ved en standard forøget kemiluminescens (ECL) fremgangsmåden (Pierce, USA). Alle forsøg blev gentaget flere gange og gav lignende resultater.

Immunhistokemi

Tumor snit blev deparaffineret, rehydreret, og behandlet med 10 mM citratpuffer (pH 6,0) ved 95 ° C for at hente antigener. Efter standsning endogen peroxidaseaktivitet med H

2O

2 og blokering med 10% normalt hesteserum blev sektionerne inkuberet sekventielt med de primære antistoffer ged anti-RegIV (1:100, Santa Cruz, Californien, USA), kanin anti-GLI1 (1:200, Santa Cruz, Californien, USA), biotinylerede sekundære antistoffer, og ABC-reagens (Gene Tech, Shanghai, Kina). Den immunfarvning blev visualiseret med 3,3-diaminobenzidin (Gene Tech, Shanghai, Kina). Snittene blev derefter modfarvet med hematoxylin. Negative kontroller blev udført i hvert tilfælde ved at erstatte det primære antistof med PBS.

chromatin immunoprecipitation (CHIP)

Vi ændrede den tidligere rapporterede protokol [31] for kromatin immunofældning (CHIP). Kort fortalt, PANC-1-celler (3 x 10

7) blev tværbundet med 1% formaldehyd. Fikseringen Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 10 ml glycin (0,125 M), derefter kromatin blev opsamlet med 1 ml IP buffer indeholdende protease inhibitor cocktails. Chromatin blev klippet ved anvendelse af en sonikator med en 4 mm spids sonde 3 gange i 10 andre impulser (60 W, 80 W og 100 W, henholdsvis 90 s intervaller) i et is boks. Tværbinding blev vendt ved tilsætning af 20 pi af 5 M NaCl natten over ved 65 ° C. DNA blev ekstraheret under anvendelse af phenol /chloroform-assay. 20 pi DNA blev elektroforeret på en 1,5% agarosegel og resten blev opbevaret ved -20 ° C som INPUT DNA. Opløselig kromatin blev immunpræcipiteret med 2 ug anti-GLI1 kanin monoklonalt antistof (Santa Cruz, Californien, USA). De 2 ug muse-IgG (Santa Cruz, Californien, USA) blev tilsat som en tilfældig kontrol, RNA-polymerase II som en positiv kontrol, og β-actin-antistof som negativ kontrol. DNA-protein-immunkomplekser blev elueret og revers tværbundet, og DNA blev ekstraheret med phenol /chloroform og udfældet. Tilstedeværelsen af ​​RegIV promotor domæne indeholdende GLI1 motiver i immunopræcipiteret DNA blev identificeret ved PCR under anvendelse af følgende primere: RegIV-A for site 1 (118 bp), frem: 5′-5-TGGTCCCTTCCAGACTTA-3-3 ‘, reverse: 5 ‘- TCCAGTATAGATGGCAAA -3 “. RegIV-B for site 2 (131 bp), frem: 5′-CTAACCCTTTGCCATCTA -3 “, omvendt: 5’-GACCTGGACACTGAACCTTG-3 ‘. RegIV-C for site 3 (70 bp), frem: 5’-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 ‘, revers: 5′-GTGTTACATAACGGGTTT-3’. RegIV-D for site4 (70 bp), frem: 5′-TGTAACACACTCTGTTGATGTAAGC-3 ‘, omvendt: 5’CTATTTGAGCTTCTCCCGCAG-3’. RegIV-E for websteder 3 og 4 (226 bp), frem: 5′-CTCGGAAGGTTTCTAATC-3 ‘, omvendt: 5’TTCAACATGCGTGAGTTT-3’. RegIV-F for websteder 3 og 4 (481 bp), frem: 5′-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 ‘, omvendt: 5′-AGACGGCTTCAGAATGTA-3’. RegIV-G for site 5 (315 bp), frem: 5′-TTCCTGAGGCAAGAAGAT-3 ‘, revers: 5′-CCAAGATTTAACCCAACA-3’. PCR-betingelserne for RegIV promotorregionen var: denaturering 30 sekunder ved 94 ° C, annealing 30 s, forlængelse 1 minut ved 72 ° C. Annealing temperaturer for RegIV-A-G var 55 ° C, 56 ° C, 56 ° C, 47 ° C, 56 ° C, 56 ° C, og 52 ° C. Amplifikation af RegIV promotorregionen blev analyseret efter 35 cykler. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange.

elektroforetisk mobilitet ændring-assays (EMSA)

Nukleare ekstrakter fremstillet med NE-PER Nuclear og cytoplasmiske Ekstraktion Reagenser (Pierce, Rockford, USA). EMSA og supershift EMSA med digoxin-mærkede prober blev udført under anvendelse af DIG-Gel shift kit ifølge producentens instruktioner (Roche, Basel, Schweiz). Sekvenserne for de anvendte oligonukleotider var 5′-AGAACATGGATGATCATGTCA-3 ‘(bindende motiv understreget). Mutante oligonukleotider anvendt var 5’-AGAACAAAAAATTTTATGTCA-3 ‘. I supershift studie blev 5 ug kanin monoklonalt antistof mod GLI1 inkuberet med 5 ug af kerneekstrakt på is i 30 minutter før tilsætning af den mærkede probe, og yderligere inkuberet på is i 30 minutter. Hele 20 pi bindingsreaktion blev løst på en 7% polyacrylamidgel og overført til en positivt ladet nylonmembran (Bio-Rad, USA) i 0,5 × Tris borat-EDTA-puffer.

Statistisk analyse

kvantitative data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Real-time PCR-data blev analyseret i henhold til de forskelle i target genekspression ved parret t-test og var 2

-ΔΔCT

forvandlet inden analyse. Forholdet mellem GLI1 og RegIV ekspression blev analyseret ved anvendelse af Spearman. IHC data blev analyseret ved anvendelse af chi i anden-test. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

GLI1 og RegIV udtryk i bugspytkirtelkræft væv

At studere GLI1 og RegIV udtryk i PC, QRT -PCR og IHC blev anvendt i 12 parrede biopsi væv. GLI1 udtryk var højere i 9 tilfælde (9/12) sammenlignet med tilstødende normale bugspytkirtlen væv (p = 0,011, figur 2); RegIV udtryk var højere i 9 tilfælde (9/12) (p = 0,011, figur 2). Der var en positiv korrelation mellem GLI1 og RegIV i pc-væv (R = 0,795, p 0,0001, Figur 2). På IHC, fandt vi RegIV at kun udtrykkes i beta-celler fra normale endokrine pancreas væv, som bekræftede Oue rapport [37]. På IHC, GLI1 og RegIV ekspression var højere i de fleste PC sammenlignes med normale væv (15/21 versus 4/21, p = 0,001; 14/21 versus 5/21, p = 0,005; henholdsvis, figur 3). 15 af 21 PC tilfælde havde høj ekspression af GLI1 protein, blandt hvilke 11 tilfælde udtrykte høje niveauer af RegIV protein (p = 0,001, figur 3).

Ekspressionen af ​​GLI1 RegIV mRNA i 12 par PC væv og tilgrænsende normale væv (A-B). DNA fra prøverne blev indsamlet fra kirurgiske biopsier, og relativ GLI1 og RegIV mRNA-ekspression blev påvist ved QRT-PCR. Statistisk sammenhæng mellem ekspressionen af ​​GLI1 og RegIV mRNA i 12 par PC væv og tilstødende normale væv blev analyseret ved Spearman test (C). Alle resultater blev normaliseret til p-actin-mRNA-ekspression. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± SD og blev beregnet ved den parrede t-test. Signifikant forskellig mellem to grupper: * p 0,05. ** P 0,01. NS:. Ikke signifikant

Alle prøver blev opsamlet, formalin-fikseret, paraffin-embedded, og opdaget af IHC. Repræsentative billeder vises. Positiv farvning af GLI1 blev observeret ved den PDAC cellekernen (A); imidlertid tilgrænsende normale væv udviste ingen eller svag farvning for GLI1 (B). I tilstødende normale pancreas væv, viste kun øceller positiv farvning af RegIV (D), mens den positive farvning af RegIV blev observeret samt bæger-lignende cytoplasma granulat i PC væv (C). Alle mikrofotografier blev opnået ved × 200 forstørrelse. Scale barer, 100 um.

Sammenhængen mellem GLI1 og RegIV

Vi testede GLI1 og RegIV udtryk i 5 PC cellelinier ved qPCR og Western blot. Der var en positiv korrelation mellem niveauet for GLI1 og RegIV mRNA og protein (R = 0,958, p = 0,011 og R = 0,939, p = 0,018, henholdsvis, figur 4). GLI1 og RegIV blev overudtrykt i PC versus normale bugspytkirtlen celler.

Angivelse af GLI1 og RegIV proteiner i 5 bugspytkirtelkræft cellelinjer som påvist ved Western blot analyse på celleekstrakter, hjælp anti-GLI1 og anti-RegIV antistoffer ( EN). β-actin blev anvendt som loading kontrol i alle eksperimenter. Resultaterne blev kvantificeret ved bestemmelse intensiteterne af båndene sammenlignet med den af ​​β-actin (B). Statistisk sammenhæng mellem ekspression af GLI1 og RegIV protein i 5 PC cellelinier blev analyseret ved Pearsons test (C). Relativ GLI1 og RegIV mRNA-ekspression blev undersøgt ved QRT-PCR (D). Ekspressionen af ​​GLI1 og RegIV mRNA blev normaliseret for p-actin mRNA-ekspression. Statistisk sammenhæng mellem ekspressionen af ​​GLI1 og RegIV mRNA i 5 PC cellelinier blev analyseret ved Pearsons test (E). Alle data præsenteres som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg.

RegIV udtryk ændres med GLI1 udtryk i PANC-1 og BxPC-3

For yderligere at verificere forholdet mellem GLI1 og RegIV i PC celler, vi konstrueret og fremstillet shRNA-GLI1 lentiviral vektor, og transficeret det ind PANC-1, en PC-cellelinje med det højeste udtryk for GLI1 (figur 4). 48 timer efter transfektion blev effektiviteten af ​​transfektion vist ved flowcytometri (FCM) at være mere end 95% (figur S2); stabil fluorescens kunne stadig påvises selv efter 20 passager (figur S3).

Bagefter blev QRT-PCR og Western blot anvendes til at detektere RegIV ekspression i GLI1-shRNA-PANC-1-celler. Celler uden transfektion blev anvendt som kontroller, mens celler transficeret med scramble shRNA blev anvendt som negative kontroller. RegIV mRNA faldt med 94,7 ± 0,3%, når GLI1 mRNA faldt med 82,1 ± 3,2%. RegIV protein faldt med 84,1 ± 0,5%, når GLI1 protein faldt med 76,7 ± 2,2% (figur 5). Dette antydede, at RegIV udtryk faldt da GLI1 blev bragt til tavshed af RNAi.

Panc-1 celler blev transficeret med GLI1-shRNA eller GFP-shRNA, BxPC-3 celler blev transficeret med LV-GLI1-eGFP eller LV-eGFP så ekspression af GLI1 mRNA forhold til den for β-actin mRNA blev vurderet ved QRT-PCR (A, D). Efter transfektion blev ekspression af GLI1 proteiner analyseret ved Western blot (C, F). Det indsatte viser et betydeligt fald i RegIV udtryk ved real-time RT-PCT (B, E) og Western blot analyse (C, F). Resultaterne blev normaliseret til den for β-actin-ekspression. Alle data præsenteres som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg.

Vi yderligere konstrueret og fremstillet et lentivirus vektor, udtrykte GLI1, og transficeret det ind BxPC-3, med den laveste GLI1 udtryk i 5 cellelinier (figur 4), at bestemme, om RegIV ekspression ændret sammen med GLI1. 48 timer efter transfektion blev QRT-PCR og Western blot anvendes til at detektere RegIV i LV-GLI1-BxPC-3-celler. Celler uden transfektion blev anvendt som kontroller, mens celler transficeret med tom lentivirusvektor blev anvendt som negative kontroller. RegIV mRNA steg med 729,1 ± 4,3%, når GLI1 mRNA steg med 924,5 ± 5,3%. RegIV protein steg med 339,0 ± 3,7%, når GLI1 protein steg med 362,1 ± 3,5% (figur 5). Dette indebærer, at RegIV udtryk øges, når GLI1 blev overudtrykt. Baseret på disse resultater, konkluderede vi, at GLI1, en transskription faktor, kan regulere RegIV genekspression.

Identifikation af kandidat Gli1 bindende steder i RegIV promotor

Den positive korrelation mellem GLI1 og RegIV i både PC væv og cellelinier fik os til at søge i RegIV promotoren for potentiel GLI1 bindingssteder til DNA konsensus sekvensen 5′-GACCACCCA-3 ‘[42]. Database analyse afslørede fire potentielle steder lokaliseret opstrøms for det transkriptionelle startsted (figur 6). Homologien af ​​hver GLI1 bindingssted til den kanoniske konsensussekvens varierede fra 67% (site 1, 2, 3, og 5) til 78% (sted 4), som antydede, at RegIV genpromotoren kan binde til GLI1.

(A) Placering af de potentielle GLI1 bindingssteder (tallene 1-5) i forhold til strukturen af ​​genet. P betegner det transkriptionelle startsted. Det grå ramme repræsenterer den variable splejsning site. Blanke rammer repræsenterer exons. (B) Position af bindingsstederne på promotoren i forhold til P transkriptionelle startsted og sekvensen homologi med GLI1 konsensus bindende sekvens, GACCACCCA.

Bekræftelse af GLI1 protein bundet til promotorområdet i RegIV genet ved CHIP

den sonikerede kromatin løsning assay viste, at den samlede DNA-fragment dukkede smurt i 100 bp til 1 kb rækkevidde i 80 W gruppen (figur S4). Resultatet af DNA-elektroforese viste den forventede DNA-bånd i INPUT, GLI1-Ab, og postive kontrolgrupper under anvendelse af humant RegIV primer-D-F, og ikke i IgG og negative kontrolgrupper (figur 7). Kun INPUT og den positive kontrol viste forudsagte bånd under anvendelse af humant RegIV primer-A-C, G, men ikke i GLI-Ab, IgG og negative grupper (data ikke vist). Resultaterne af sekvensanalyse viste, at sekvenserne var den samme som den af ​​RegIV genpromotoren af ​​site 4 (fig S5, S6, S7). Alle data antydede, at GLI1 var bundet til RegIV genpromotoren af ​​site 4 (GATCATCCA), og reguleret RegIV i PC gennem HH signalvejen.

Placeringerne af RegIV primer-AG i promotorregionen af ​​RegIV genet . Tallene på skematiske af RegIV genet (tal 1-5) svarer til de potentielle GLI1 bindingssteder. P betegner det transkriptionelle startsted. Lysater fra PANC-1-celler blev udsat for chromatin immunoprecipitation af anti-GLI1 antistof. Human RegIV primer-A-G blev anvendt til at amplificere RegIV promotorregionen indeholder det formodede GLI1-bindingssted. Sonikerede kromatin blev anvendt som input DNA-kontrol. IgG, RNA-polymerase II, og β-actin Ab blev anvendt som stikprøvekontrol, positive kontroller og negative kontroller. (B) Kun INPUT viste positiv kontrol, og GLI1-Ab den forudsagte bånd i ethidiumbromid-farvede agarosegeler brug af chip-PCR-produkter, som blev amplificeret ved RegIV primer-D (i), RegIV primer-E (ii), og RegIV primer-F (iii). Ingen påviselig transkript blev observeret i amplificeret skabelon fra IgG eller negativ kontrol og en positiv kontrol lane bekræftede den forventede fragment. Molekylvægtstandarder (Marker) blev anvendt til at anslå størrelsen af ​​de forstærkede bånd.

Bekræftelse af GLI1 bundet til RegIV promotoren af ​​EMSA

Som beskrevet ovenfor GLI1 bindingssted i promotorregionen af ​​RegIV genet blev bekræftet ved chip-PCR. Vi derefter brugt EMSA analyser til direkte adresse, om GLI1 binder RegIV

in vivo

. Vi syntetiserede specifikke oligonukleotider, der indeholder GLI1 element til stede i RegIV promotor i EMSA eksperimenter med nukleare ekstrakter fra PANC-1 cellelinjer. Som vist i figur 8, inkubation af PANC-1 celler ekstrakter med biotin-mærket GLI1-RegIV sekvens produceret en DNA-proteinbånd skift. Disse DNA-proteinkomplekser var specifikke for GLI1 stedet af succesfulde konkurrencemæssige analyser ved hjælp af forskellige folder af overskydende umærkede GLI1-RegIV og mutant mærkede GLI1-RegIV oligonukleotider. For at bekræfte binding af GLI1 til GLI1-RegIV sekvens, blev disse EMSA reaktioner yderligere inkuberet med anti-GLI1 antistof. Som vist i figur 8, tilføjelsen af ​​dette antistof resulterede i et supershift kompleks foruden den DNA-proteinbånd. Disse data viste tilstedeværelsen af ​​GLI1 i den nukleare proteinkompleks som binder GLI1 bindingssted RegIV promotoren (-528~-520).

EMSA blev udført med nukleare ekstrakter af PANC-1-celler (bane 2 til 7) eller uden nukleare ekstrakter (bane 1). Den RegIV proben blev genereret ved annealing af enkeltstrengede og endemærkede oligonukleotider indeholdende den RegIV promotorregionen (nukleotider -528-520). blev udført kompetitive forsøg ved anvendelse af 1-fold (bane 3), 10 gange (bane 4) og 100 gange (bane 5) overskud af umærket oligonukleotider, henholdsvis (bane 3 til 5) eller 100-fold mutant mærkede oligonukleotider (bane 6). For super-shift, anti-GLI1 antistof (bane 7) blev inkuberet med kerneekstrakter før tilsætning til reaktionen.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi bekræftet, at GLI1 og RegIV blev overudtrykt i PC væv og cellelinjer, bekræftes af andre rapporter [12], [20], [32]. Vi viste også en signifikant positiv korrelation mellem ekspression af GLI1 og RegIV. RNA-interferens og overekspression viste, at RegIV udtryk ændrede sig med GLI1 udtryk i PC-cellelinjer; dette blev bekræftet af CHIP og EMSA. Dette er den første rapport, GLI1 kan modulere RegIV ekspression ved binding til RegIV genpromotoren, og at GLI1 er en RegIV transkriptionel faktor.

HH signalvej, herunder transkriptionsfaktor GLI1, er involveret i udviklingen af mange former for kræft, herunder PC [12], [13], [32] – [35]; men mekanismen er ikke fuldt belyst. Indtil videre, er blevet identificeret kun få downstream mål for GLI1, herunder GLI1, ptch, HHIP, CCND, Snail, Bcl-2, cyklin D2, FOX-F1, -L1, -M1, Follistatin, og N-myc [36