PLoS ONE: Novel Levamisol Derivative inducerer ydre vej af apoptose i cancerceller og Hæmmer Tumor Progression i Mice

Abstrakt

Baggrund

Levamisol, en imidazo (2,1-b) thiazolderivat , er blevet rapporteret at være en potentiel antitumormiddel. I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt virkningsmekanismen af ​​en af ​​de nyligt identificerede analoger, 4a (2-benzyl-6- (4′-fluorphenyl) -5-thiocyanato-imidazo [2,1-b] [1] , [3], [4] thiadiazol).

Materialer og metoder

ROS produktion og ekspression af forskellige apoptotiske proteiner blev målt efter 4a behandling i leukæmicellelinjer. Tumor dyremodeller blev anvendt til at evaluere effekten af ​​4a i sammenligning med Levamisol på progression af brystadenocarcinom og overlevelse. Immunhistokemi og Western blotting studier blev udført for at forstå den mekanisme af 4a handling både

ex vivo

in vivo

.

Resultater

Vi har bestemt IC

50 værdi 4a i mange leukæmisk og brystkræft cellelinier og fundet CEM-celler mest følsomme (IC

50 5 pM). Resultaterne viste, at 4a behandling fører til akkumulering af ROS. Western blot analyse viste opregulering af pro-apoptotiske proteiner t-BID og BAX, efter behandling med 4a. Desuden dosisafhængig aktivering af p53 sammen med FAS, FAS-L, og spaltning af caspase-8 antyder, at det inducerer død receptormedieret apoptosecyklus i CEM-celler. Vigtigere, observerede vi en reduktion i tumorvækst og signifikant stigning i overlevelse efter oral indgivelse af 4a (20 mg /kg, seks doser) i mus. Til sammenligning blev 4a sig at være mere potent end dets parental analog Levamisol baseret på både

ex vivo

og

in vivo

undersøgelser. Endvidere immunhistokemi og Western blotting studier indikerer, at 4a behandling førte til ophævelse af tumorcelleproliferation og aktivering af apoptose ved den ydre vej, selv i dyremodeller.

Konklusion

Således er vores resultater antyder, at 4a kan anvendes som en potent kemoterapeutisk middel

Henvisning:. Hegde M, Karki SS, Thomas E, Kumar S, Panjamurthy K, Ranganatha SR, et al. (2012) Novel Levamisol Afledte inducerer ydre vej af apoptose i cancerceller og Hæmmer Tumor Progression i mus. PLoS ONE 7 (9): e43632. doi: 10,1371 /journal.pone.0043632

Redaktør: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, Mexico

Modtaget: Februar 13, 2012; Accepteret: 23, 2012; Udgivet 10. september, 2012 |

Copyright: © Hegde et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Lady Tata Memorial Trust, Storbritannien, og Det indiske Videnskabelige Institut opstart tilskud til SCR. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke er konkurrerende interesse

Introduktion

Kræft er en vanskelig sygdom at behandle, og kun meget få effektive lægemidler er tilgængelige. Udviklingen af ​​nye, effektive, selektive og mindre giftige kræft terapeutiske molekyler har været et udfordrende mål. Forståelse af molekylære mekanisme involveret i cancertyper vil føre til opdagelsen af ​​hidtil ukendte anticancermidler. Ændringer i ekspressionsniveauer af RNA og proteiner som følge af forskellige mutationer er blevet undersøgt i mange cancere, inklusive leukæmi og lymfom [1] – [4]. For nylig har der været omfattende arbejde for at karakterisere den mekanisme af kromosomale translokationer og deletioner resulterer i leukæmi og lymfom [5], [6]. Mange genfusioner er også blevet identificeret i prostata kræft og brystkræft [7]. De mest diskuterede proteiner er ansvarlige for leukæmi og lymfom i den seneste tid er de rekombination aktiverende gener (klude, det enzym ansvarlig for antistof mangfoldighed) [5], [6] og aktivering deaminase (AID, det enzym, der er ansvarlige for somatisk hypermutation og klasse skiftrekombination) [5], [8]. Men de enzymer, der er ansvarlige for udviklingen af ​​gen fusioner endnu ikke identificeret.

De seneste to årtier har oplevet en dramatisk ændring i kræftbehandling paradigmer. F.eks Imatinib (Gleevac), et lægemiddel udviklet specifikt mod den aktiverede tyrosinkinase i kronisk myeloid leukæmi, er en af ​​sådanne store fremskridt [9]. Desuden har mange andre forbindelser også blevet identificeret og klinisk testet. Selv om succes af kliniske forsøg i at identificere nye agenter og behandlingsmetoder har været betydelige, de nuværende behandlinger har mange begrænsninger. Dette omfatter bivirkninger forårsaget af lægemidlerne og erhvervet lægemiddelresistens [10]. Således, behovet for udvikling af effektive anti-cancer terapeutiske midler med veldefinerede farmakokinetiske egenskaber er af stor betydning.

I øjeblikket er der forskellige måder, hvorved et lægemiddel testet for dens effektivitet som et anticancermiddel . I denne henseende er forskellige apoptotiske veje blevet omfattende undersøgt for mange forbindelser at forstå deres tilstand af cytotoksicitet [11]. Celle cyklus kontrolpunkter induceret af små molekyler er også blevet undersøgt [12], [13].

Levamisol er en immunmodulator i forskellige cancerceller, herunder colorectal, brystcancer, melanoma og leukæmi [14]. Tidligere er det blevet vist, at det påvirker celleproliferation i forskellige cancere [15] og modulerer phosphorylering relevant for både cellecyklusprogression og apoptose. Undersøgelser har også vist, at det kan bruges til anti helminthiske parasitære og forskellige autoimmune sygdomme [16], [17]. Desuden er det blevet vist, at levamisol har anticanceraktivitet i kombination med fluorouracil (5-FU) som supplerende behandling for tumor-knude-metastaser (TNM) stadium III (Dukes ‘C) coloncarcinom [18].

Den imidazo (2,1-b) thiazol derivater af Levamisol er blevet rapporteret som potentielle antitumormidler [19]. Senere, antitumoraktiviteten af ​​5-formyl-6-arylimidazo- [2,1-b] blev også rapporteret -1,3,4-thiadiazol sulfonamider [20]. På baggrund af disse lovende resultater, syntetiserede vi en serie af analoger, der indeholder fluor i stilling 4 af 6-phenyl i imidazo- [2,1-b] -1,3,4-thiadiazol og identificeret 4a som den ledende forbindelse [21]. Imidlertid blev den mekanisme, hvormed det inducerede cytotoksicitet ikke kendt. Desuden blev det aldrig testet på dyremodeller for dens virkning på tumorprogression. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi at 4a udøver sin virkning på tumorceller ved at aktivere ydre vej af apoptose. Vi fandt også, 4a inhiberer progressionen af ​​tumoren i mus effektivt og øger levetiden betydeligt.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

Alle kemikalier anvendt i den foreliggende undersøgelse var af analytisk kvalitet og indkøbt fra Sigma-Aldrich, USA. Antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology, USA.

Syntese af 4a

Syntese og karakterisering af 2-benzyl-6- (4′-fluorphenyl) -5-thiocyanato-imidazo [2, 1-b] [1], [3], [4] thiadiazol, 4a er blevet beskrevet tidligere [21]. Levamisol (tetramisol hydrochlorid, kat. Nr L9756) blev købt fra Sigma-Aldrich, USA.

Cell kultur

Humane cellelinier, CEM (T-celle leukæmi), K562 (kronisk myeloid leukæmi) REH (B-celleleukæmi) og Nalm6 (B-celle-leukæmi), blev dyrket i RPMI1640 (Sera Lab, UK) indeholdende 10% FBS (Gibco BRL, USA), 100 U penicillin G /ml og 100 ug streptomycin /ml (Sigma-Aldrich, USA) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. EAC (brystkræft) cellelinien blev fremskaffet fra National Center for Cell videnskab, Pune og dyrket i DMEM indeholdende 10% FBS, som beskrevet ovenfor.

trypanblåt -eksklusionsassay

Virkningen af ​​4a på levedygtighed leukæmisk (CEM, K562, REH, Nalm6) og brystkræft (EAC) celler blev bestemt ved trypanblåt-udelukkelse assay [22]. Celler blev dyrket (0,75 × 10

5 celler /ml) i 24 timer og forbindelse blev tilsat i området fra 1-100 uM at bestemme IC

50 værdi. DMSO behandlede celler blev anvendt som vehikelkontrol. Celler blev opsamlet med intervaller på 24 timer i fem dage og antallet af levedygtige celler blev bestemt efter trypanblåt-farvning. For Levamisol blev vand anvendt som kontrol køretøj. I tilfælde af EAC, en adhærent cellelinje, blev levedygtige målt ved 48 og 72 timer efter behandling af 4a. Hvert eksperiment blev gentaget mindst to gange, og fejlsøjler blev beregnet og afbildet.

MTT assay

MTT-assayet blev udført som beskrevet tidligere [23]. CEM, K562, Reh eller Nalm6 celler (0,75 x 10

5 celler /ml) blev behandlet med 4a (for CEM og Reh celler 1, 5, 10 og 20 um, for K562 1, 5, 10, 20, 40 og 100 pM, for Nalm6, 1,5,10, 20, 40 uM), inkuberet i 48 og 72 timer og underkastet MTT-assay. Celler behandlet med DMSO eller vand blev anvendt som køretøjets styringer til 4a, henholdsvis. Forsøg blev gentaget mindst to uafhængige gange, hver med dublerede reaktioner og fejlsøjlerne angivet.

LDH-frigivelse-assay

LDH-frigivelse i mediet efter 4a behandling (1, 5, 10 og 20 uM) på CEM-celler efter 48 og 72 timer af behandlingen blev målt ved anvendelse af standardprotokol [24]. Procentdelen af ​​LDH frigivelse blev beregnet som: LDH frigivelse i media /(LDH frigivelse i medierne + intracellulær LDH frigivelse) × 100%

Påvisning af intracellulær ROS produktion ved flowcytometri

Niveauet. af den samlede intracellulære ROS-produktion blev målt ved hjælp af celle permeable fluorescerende probe 2,7-dichlorodihydro fluoresceindiacetat (H

2DCFDA) i CEM og REH celler [25]. CEM-celler blev behandlet med 5 og 10 uM af 4a og REH celler med 10 pM for 5, 10, 15, 30 og 60 min, høstet, vasket, og fluorescensintensiteten blev analyseret ved flowcytometri. Celler behandlet med H

2O

2 blev anvendt som positiv kontrol for kompensation af eksperimentelle prøver.

Western blot-analyse

Cell lysat blev udarbejdet efter behandling med 4a på CEM (0 , 0,5, 1 og 5 uM i 48 timer). Western blotting blev udført som tidligere [23] beskrevne. Kort beskrevet -40 ug protein prøve blev elektroforesebehandlet på 8-12% SDS-PAGE, overført til PVDF-membran (Millipore, USA) og probet med de respektive primære og biotinylerede sekundære antistoffer. De primære anvendte antistoffer var BCL2, BCL-xL, BAX, t-BID, p53, p-p53 [Ser 392], PUMA, AKT, Pakt [Ser 473], FAS, FAS-L, FADD, SMAC /DIABLO, caspase -3, caspase-8 og cytochrom C. Blottene blev fremkaldt under anvendelse kemiluminescerende reagenser (Immobilon ™ western, Millipore, Indien) og scannet ved gel dokumentationssystem (LAS 3000, Fuji, Japan). Blots blev frataget efterfølgende som pr standardprotokol og re-testet med anti-tubulin antistof [23].

Adskillelse af mitokondrie og cytosolisk fraktioner fra 4a behandlede CEM celler

CEM celler blev behandlet med 5 pM 4a i 48 timer, høstet og anvendt til isolering af mitochondriske og cytosoliske fraktioner under anvendelse mitokondrie ekstraktion kit (IMGENEX, USA, katalog nr. 10082k) i henhold til fabrikantens anvisninger. DMSO behandlede celler blev anvendt som kontrol. De resulterende fraktioner blev anvendt til western blot analyse mod anti-cytochrom C. Actin blev anvendt som lastning kontrol.

In vivo eksperimenter

Etik erklæring.

Mus blev opretholdt som per de principper og retningslinjer for den etiske komité for dyrs pleje af Indian Institute of Science i overensstemmelse med indiske National lov om dyrs pleje og brug. Den eksperimentelle design af foreliggende undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Ethics Committee (Ref. CAF /Etik /125/2007/560), Indian Institute of Science, Bangalore, Indien.

Dyr

Swiss albino mus, 6-8 uger gamle, vejer 18-22 g blev købt fra central dyr facilitet, Indian Institute of Science (IISc), Bangalore, Indien og opretholdt i dyret huset, Institut for Biokemi, IISc. Dyrene blev huset i polypropylen bure og givet standard pellet diæt (Agro Corporation Pvt. Ltd., Indien) og vand ad libitum. Standarden pellet diæt bestående af 21% protein, 5% lipider, 4% træstof, 8% aske, 1% calcium, 0,6% phosphor, 3,4% glucose, 2% vitamin, og 55% nitrogen-fri ekstrakt (kulhydrater). Musene blev holdt under kontrollerede betingelser for temperatur og fugtighed med en 12 timers lys /mørke-cyklus.

Fremstilling af Ehrlich ascites carcinoma (EAC) -celler.

EAC celler blev opsamlet fra bughulen af tumorbærende donormus på 20-22 g legemsvægt og suspenderet i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Et fast antal levedygtige celler (1 x 10

6 celler /22 g b. Vægt) blev implanteret i det peritoneale hulrum på hver modtager mus og tilladt at formere sig. De tumorceller blev trukket tilbage, fortyndet i saltvand, talt og re-injiceres (1 × 10

6 celler /dyr) til højre lår væv af forsøgsdyr for at udvikle solid tumor.

Evaluering af antitumoraktivitet af 4a i mus

at studere og sammenligne antitumoraktiviteten af ​​4a, blev 32 schweiziske albino mus anvendt i den foreliggende undersøgelse, (to partier af 16 dyr hver). Ud af 16 mus, blev fire anvendes som ubehandlede (normal) kontrol. Resten af ​​musene blev injiceret med ØK at inducere fast tumor, og opdeles i tre grupper, der hver indeholder fire dyr til tumor kontrol (gruppe to), Levamisole behandlet (gruppe tre) og 4a behandlet (gruppe fire). Gruppe to fik vand som køretøj kontrol, modtog oral indgivelse af Levamisol (20 mg /kg, b. Vægt) og gruppe fire samle tre modtog oral administration af 4a (6 doser på 20 mg /kg) på hver alternativ dag ved hjælp af gastrisk gavages starter fra 12

th dagen for injektion af tumorceller.

diametrene af udvikling tumor blev målt i tilfælde af gruppe to, tre og fire dyr ved hjælp af en skydelære gang i fem dage. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af formlen V = 0.5ab

2, hvor a og “b” angiver større og mindre diameter, henholdsvis [26]. Ved udgangen af ​​25

th og 45

th dag i forsøgsperioden, blev ét dyr fra hver gruppe aflivet ved cervikal dislokation, og væv fra normale (gruppe én), tumor (gruppe to), Levamisole behandlet (gruppe tre ) og 4a behandlet (gruppe fire) dyr blev opsamlet og opbevaret.

for at kontrollere levetiden induceret af 4a i tumor mus blev 24 dyr studeret, to partier, som indeholder 12 hver. Ud af 12, seks tjente som tumor kontrol og andre blev behandlet med 4a som forklaret tidligere. Den procentvise stigning i levetid blev beregnet og sammenlignet med den for kontroldyr. Død mønster for kontrol og 4a behandlede dyr blev indspillet og% stigning i levetiden blev beregnet ved hjælp af formlen [(T-C) /C] x 100, hvor “T” angiver antallet af dage 4a behandlede dyr overlevede og »C ‘angiver det antal dage tumor dyr overlevede [26] – [28].

Evaluering af toksicitet 4a i normale mus

Swiss Albino mus blev behandlet med 4a og Levamisol (6 doser, på hver anden dag) og bivirkninger blev vurderet på to forskellige tidspunkter (20

th og 50

th dag). Ud af 36 mus, 18 hver blev anvendt ved 20

th og 50

th dag. I begge tilfælde, tjente 6 dyr som kontrol, mens 6 blev behandlet med Levamisol (20 mg /kg) eller 4a (20 mg /kg). Legemsvægt af hvert dyr blev overvåget gennem hele forsøget og gennemsnitlig vægt beregnet ved 20

th og 50

th dag for kontrol, 4a og Levamisol indgivne mus og blev afbildet med fejlsøjler. For at evaluere virkningen af ​​4a og Levamisol på fysiologiske funktioner blev blod opsamlet på 20

th og 50

th dag som tidligere beskrevet [29]. Serum blev separeret, og lever- og nyrefunktion blev udført for hvert dyr, for at bestemme niveauer af alkalisk phosphatase (ALP), blev kreatinin, urinstof og blodtælling udføres ved anvendelse plasma som beskrevet tidligere [29]. Værdier er præsenteret som gennemsnit ± SEM.

Western blot-analyse for 4a behandlede faste og flydende tumorceller

Solid tumor blev udviklet som tidligere [29] beskrevne. Efter 6 doser 4a, blev tumoren opsamlet og ekstrakt blev fremstillet ved anvendelse af RIPA buffer metode [23]. Den flydende tumor blev udviklet ved at injicere EAC celler (2 × 10

6 celler) fra donormus til bughulen af ​​forsøgsdyrene. Efter ØK injektion (5

th dag), blev dyrene behandlet med 4a (20 mg /kg; 4 doser hver alternative dage) og EAC celler blev isoleret fra den peritoneale kavitet. De makrofagslægten celler blev separeret fra ikke-adhærente EAC cellerne under let aspiration og vasket med 1 × PBS. Cellelevedygtighed blev kontrolleret ved anvendelse af trypan-blå-udelukkelse farvestof-assay og 92% celler viste sig at være i live i både eksperimentelle og styrer grupper. EAC-celler blev lyseret i RIPA-buffer, blev ekstrakten fremstillet som beskrevet tidligere [30] og anvendt til Western blot-analyse.

Histologisk evaluering

tumor og levervæv af normale og eksperimentelle mus blev opsamlet og forarbejdet som pr standardprotokoller. Kort fortalt blev vævene indlejret i paraffin, snittet ved 5-10 um i en roterende mikrotom (Leica Biosystems, Tyskland) og farvet med hæmatoxylin og eosin [31], [32]. Brain væv blev indsamlet, behandlet og farvet med Luxol Fast Blue at studere demyelinisering. Hver sektion blev evalueret ved lysmikroskopi og billeder blev indfanget (Zeiss, Tyskland).

Immunohistokemisk (IHC) analyse

antistoffarvning blev udført på formalinfikserede, paraffinindlejrede væv, der blev snittet på en tykkelse på 5 um. Objektglas blev de-paraffinized hjælp xylen, rehydreret og behandlet med 3% H

2O

2 i PBS. Antigen genfinding blev udført under anvendelse 0,01% natrium-citrat puffer efterfulgt af blokering i PBST indeholdende 0,1% BSA og 10% FBS. Primært antistof inkubation (Ki67, BID eller 53BP1) blev udført natten over ved 4 ° C. Objektglas blev vasket og inkuberet med biotinyleret sekundært antistof (1 time). Objektglas blev derefter vasket, inkuberet i streptavidin-HRP (1:1000). Objektglas blev igen vasket (PBS indeholdende 0,1% Tween 20) og farven blev udviklet ved anvendelse DAB + H

2O

2, modfarvet med hæmatoxylin og monteret i DPX (Sigma-Aldrich, USA). Billeder blev taget med lysmikroskop (Zeiss, Tyskland). Ændring i intensitet af antistof-farvning efter 4a behandling blev bestemt ved anvendelse ImageJ software [33].

Statistisk analyse

Værdier er udtrykt som middelværdi ± SEM for kontrol og eksperimentelle prøver og statistisk analyse blev udført ved hjælp af One-way ANOVA efterfulgt af Dunnett-test, og hver værdi blev sammenlignet med kontrolgruppen og betydning er nævnt. Til denne analyse blev GraphPad software prisme 5.1 anvendes. Værdierne blev betragtet som statistisk signifikant, hvis p-værdien var lig med eller mindre end 0,05.

Resultater Salg

4a inducerer cytotoksicitet i kræftceller

Tidligere, mens screening en serie af levamisol derivater identificerede vi 4a som den ledende forbindelse (fig. 1A) [21]. I den foreliggende undersøgelse har vi anvendt en række forskellige leukæmiske cellelinier (CEM, K562, REH og Nalm6) og en mus brystcancercellelinje, Ehrlich ascites carcinoma (EAC) at vurdere dens potentiale til at inducere cytotoksicitet. For det første IC

50 af 4a på CEM, K562, Nalm6 og REH celler blev bestemt under anvendelse af trypanblåt og MTT-assays (fig. 1). Celler behandlet med DMSO blev anvendt som vehikelkontrol. Resultaterne viste, at 4a behandling signifikant påvirket cellernes levedygtighed ved lavere koncentrationer i CEM, Nalm6 og REH (fig. 1B, C). Interessant nok viste K562-celler mindst følsomhed over 4a behandling (fig. 1B, C). Baseret på begge trypanblåt og MTT-analyser, IC

50 værdi blev anslået til at være ca. 5, 70, 10 og 8 uM i CEM, K562, Nalm6 og Reh celler, henholdsvis efter 48 timers 4a behandling. Interessant nok i sammenligning med 4a, Levamisole behandling på CEM-celler viste mindre følsomhed (fig. 2A, B). 4a udviste signifikant cytotoksicitet i EAC-celler (IC

50, 33 uM), mens celler var ufølsomme for Levamisol, ved koncentrationsinterval afprøvet (fig. 2C, D). Endvidere blev LDH-assay udført for at assay celleskader induceret af 4a på CEM-celler. Cellerne blev behandlet med 4a i 48 og 72 timer, henholdsvis høstet og underkastet LDH måling. Resultaterne viste en dosisafhængig stigning i frigivelsen af ​​LDH (fig. S1).

A. Strukturen af ​​4a. B. 4a induceret cytotoksicitet som bestemt ved trypanblåt-assay. CEM, K562, Nalm6 og REH celler blev dyrket (0,75 × 10

5 celler /ml) og cytotoksicitet blev målt efter tilsætning af stigende koncentration af 4a som angivet. Celler blev talt med intervaller på 24 timer, indtil cellerne opnåede stationær fase og blev afbildet. DMSO behandlede celler blev anvendt som vehikelkontrol. Standardfejl blev beregnet på basis mindst to uafhængige forsøg. C. Bestemmelse af celleproliferation ved hjælp af MTT-assayet efter tilsætning af 4a til CEM, K562, Nalm6, og REH celler (48 og 72 h). De viste resultater er fra et minimum på to uafhængige forsøg, der hver blev udført in duplo, og resultaterne er udtrykt som% af celleproliferation. I alle paneler “C” står for DMSO behandlet køretøj kontrol.

A. Strukturen af ​​Levamisol, den parentale forbindelse med 4a. B. Bestemmelse af celleproliferation ved hjælp af MTT-assay på CEM-celler behandlet med Levamisol eller 4a. I tilfælde af Levamisol, anvendte koncentrationer var 1, 5, 10 og 20 uM, mens det var 10 uM til 4a. Standardfejl blev beregnet baseret på to uafhængige forsøg. C, D. Cytotoksicitet af 4a og Levamisol på EAC-celler som målt ved trypan blue assay. EAC-celler blev dyrket (0,75 × 10

5 celler /ml) og behandlet med 1, 5, 10, 20 og 40 uM 4a eller Levamisol. Levedygtigheden af ​​cellerne blev bestemt ved trypanblåt assay ved 48 og 72 timer. Standardfejl blev beregnet ud fra tre uafhængige forsøg.

4a inducerer intracellulære reaktive oxygenarter (ROS)

Overproduktion af ROS efter tilsætning af en forbindelse er en indikator for cellulær reaktion, der fører til DNA-skader og apoptose. Vi fandt, at 4a behandling induceret ROS-produktion i tilfælde af CEM (5 og 10 uM) samt REH (10 uM) celler ved 10 og 15 min (fig. 3 A, B, fig. S2). Endvidere fandt stigningen i inkubationstiden ikke øge ROS niveau. Celler behandlet med H

2O

2, blev anvendt som en positiv kontrol, mens DMSO behandlede celler tjente som vehikelkontrol (fig. 3). Således er vores resultater antyder, at ROS produktion er et mellemtrin involveret i 4a induceret cytotoksicitet.

A, B. CEM (A) og REH (B) celler behandlet med 4a (5 uM og 10 uM) for forskellige tidspunkter blev anvendt til afprøvning af dannelsen af ​​intracellulær ROS ved flowcytometri analyse. Den valgte til undersøgelsen koncentrationen var baseret på deres respektive IC

50 værdier. H

2O

2-behandlede celler blev anvendt som positiv kontrol, mens celler alene blev anvendt som negativ kontrol. DMSO behandlede celler blev anvendt som vehikelkontrol. Cellepopulation viser ROS blev vist sammen med standardfejlen middelværdi (n = 2).

4a modulerer ekspression af apoptotiske proteiner

For at studere den mekanisme, hvorved 4a inducerer celledød undersøgte vi ekspressionsniveauerne af forskellige apoptotiske proteiner efter 4a behandling. CEM-celler blev valgt til undersøgelsen, da det viste maksimal følsomhed til 4a. CEM-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af 4a (0,5, 1 og 5 uM, i 48 timer), cellelysat blev fremstillet og anvendt til Western blot-undersøgelser. Resultaterne viste, at 4a behandling førte til en bemærkelsesværdig stigning i niveauet af p53 samt phospho-p53 (fig. 4A). Da p53 er en kendt aktivator af apoptose, testede vi ekspressionen af ​​forskellige BCL2 familie proteiner, der har pro /antiapoptotiske funktioner (fig. 4A, B). Overensstemmelse med vores ovennævnte resultater, vi observeret en stigning i ekspressionen af ​​proapoptotiske proteiner PUMA, BAX, og spaltning af BID (fig. 4A, B). Interessant vi også observeret opregulering af antiapoptotiske proteiner, BCL2 og BCL-xL, især ved 0,5 og 1 pM koncentrationer (fig. 4B). Endvidere 4a behandling førte til stigningen i ekspression af død-receptor signalproteiner, FAS, FAS-L og FADD, hvilket indikerer, at cytotoksicitet induceret af 4a kunne være formidlet gennem død receptormedieret apoptose (fig. 4C).

CEM cellelysat blev fremstillet efter behandling med 4a (0, 0,5, 1 og 5 uM i 48 timer). DMSO behandlede celler blev anvendt som kontrol (0 uM). Western blotting blev udført ved hjælp af specifikke primære og sekundære antistoffer for ekspression af (A) Phospho p53, p53, PUMA, phospho AKT, AKT (B) BCL2, BCL-xL, BAX og t-BID; (C) FAS, FAS-L, FADD, og ​​SMAC /DIABLO (D) caspase-3, caspase-8 og cytochrom C. α-tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. Den kvantificering af de bands i hver skamplet vist i venstre panel er vist som søjlediagram med standard fejl baseret på to uafhængige forsøg efter normalisering med respektive tubulin E. frigivelse af cytochrom C fra mitokondrier efter behandling med 4a. Mitochondrial samt cytosoliske fraktioner blev separeret fra CEM-celler efter 48 timers behandling med 4a (5 uM) blev DMSO behandlede celler anvendt som kontrol (C), western blotting blev udført ved anvendelse af anti-cytochrom C. Actin blev anvendt som ladningskontrol .

PI3K /AKT-vejen er kendt for at blive aktiveret i et flertal af T-ALL. Det er også kendt, at det spiller en kritisk rolle i kontrollen overlevelse og apoptose. Stigning i p-AKT flytter cellerne mod overlevelse ved at forstyrre p53 medieret vej af apoptose. Derfor var vi interesserede i at kontrollere niveauet af AKT efter sammensatte behandling. Resultaterne viste opregulering af AKT efter tilsætning af 4a (fig. 4A). Trods stigning i niveauet af p-AKT, lægemidlet induceret celledød, hvilket tyder på, at forholdet mellem proapoptotiske og antiapoptotiske signaler i cellen blev afbrudt.

SMAC /DIABLO er et mammalt mitokondrie-protein, der fungerer som en regulerende komponent under apoptose. Vi testede dets ekspression ved 4a behandling og resultaterne viste en opregulering af proteinekspression (fig. 4C). En dosis-afhængig stigning i niveauet af cytochrom C blev også observeret (Fig. 4D) [34]. Vi har også undersøgt for frigivelse af cytochrom C til cytoplasmaet og resultaterne viste en tydelig stigning i niveauet af den cytosoliske cytochrom C ved behandling med 4a (fig. 4E).

caspase-8 er et andet protein aktiveres under ydre vej af apoptose. Resultaterne viste spaltning af caspase-8 ved 4a behandling (fig. 4D). Dette bekræfter yderligere aktivering af død-receptormedieret apoptose. Aktiveret caspase-8 også spalter procaspase-3 og i overensstemmelse hermed finder vi aktivering af procaspase-3 sammenlignet med kontrollerne, ved 4a behandling, i en dosisafhængig måde (Fig. 4D). Salg

4a behandling inhiberer tumorprogression i mus Salg

EAC afledt fra brystadenocarcinom er en aggressiv og hurtigt voksende carcinom almindeligvis anvendes til evaluering af effekten af ​​hidtil ukendte små molekyler på tumorprogression. Baseret på pilotundersøgelser, blev 20 mg /kg legemsvægt af 4a anvendes til behandling i dyr, der bærer tumorer (data ikke vist). Efter 12

th dag i ØK injektion (lille størrelse tumor var synlig), blev dyrene behandlet med seks doser hver anden dag. Vi fandt, at behandling med 4a på dyr, der bærer tumor resulterede i signifikant reduktion af tumorstørrelse sammenlignet med ubehandlet samt levamisol behandlede tumor dyr (20 mg /kg) (fig. 5A). Vi fandt, at 80% af musene overlevede efter behandling med 4a, mens 50% af de ubehandlede tumor-mus var døde mellem 30 til 40 dage af tumorudvikling (fig. 5A, B og data ikke vist). Brutto udseende låret væv indeholdende tumor, lever og milt fra negativ kontrol, ubehandlet tumor kontrol og 4a behandlede mus viste en proportional morfologisk forskel (fig. 5C og data ikke vist).

Solid tumor blev induceret i Swiss albinomus ved at injicere EAC celler. Seks doser 4a og Levamisol (20 mg /kg) hver administreret til tumor bærende mus på hver anden dag fra 12

th dag i ØK celle injektion. A. Virkning af 4a og Levamisol på tumorprogression på forskellige tidspunkter. De viste data er baseret på to uafhængige partier af eksperimenter, der indeholder fire dyr hver. Fejl søjler indikerer SD fra uafhængige forsøg. B. Kaplan-Meier-overlevelseskurver for mus behandlet med 4a. Ud af 24 tumorinduceret Swiss Albino dyr, blev 12 behandlet med 4a (20 mg /kg) og overlevelse graf blev afbildet, viste log-rank statistisk test P 0,005 (**). I kontrol tilfælde blev median overlevelsestid sig at være 59 dage og i tilfælde af 4a behandlede den ikke er defineret (værdi viste op til 250 dage). C. Gross udseende 4a behandlet og ubehandlet tumor mus og deres udvalgte organer ved 25

th behandlingsdag. en. mus uden tumor, b. mus bærende tumor, c. tumorbærende mus efter behandling med 4a, d. lår væv af normale mus, e. tumor, f. lår væv af en behandlet mus, g. leveren fra normale mus, h. lever af en tumor mus, i. leveren fra en 4a behandlet mus, j. milt af en normal mus, k. milt fra en mus med tumor, l. milt fra en behandlet mus.

Vigtigere, fandt vi, at efter behandling med 4a, dyr med tumor viste en signifikant forskel i overlevelsen sammenlignet med den ubehandlede tumor kontrol (fig. 5B). Mens kontroldyr overlevede kun maksimalt 70 dage efter tumor udvikling, hovedparten af ​​mus behandlet med 4a overlevede i mere end 250 dage indikerer en -4-fold stigning i levetid (fig. 5B). Derfor er vores resultater viser, at 4a behandling reducerede signifikant tumor belastningen og forøget levetid af dyrene.

Histologisk evaluering blev også udført på to forskellige tidspunkter (25

th og 45

th dag ) af behandlingen. Sektioner fra tumorvæv hos en 25 dage behandlet mus viste mange hæmatoxylin farvede kerner med lille cytoplasmatisk farvning indikerer aktiv celleproliferation, mens der i tilfælde af kontroller blev andre end kernerne i skeletmuskler ingen andre celler farvet (fig. S3A). 4a behandlede tumorvæv viste en signifikant reduktion i prolifererende celler (fig. S3A). Vævssnit fra låret efter 45

th behandlingsdag udviste ubetydelig antal prolifererende celler og var mere sammenlignelig med normale væv, mens prolifererende celler var rigelige i mus bærende tumor, hvor ingen behandling blev givet (fig. S3A). For at analysere, om 4a behandling havde nogen negativ indvirkning på andre væv, blev dele af leveren analyseret af hæmatoxylin og eosin farvning (fig. S3C, D). Vores resultater viste hypertrofi af hepatocytter i både tumorbærende og 4a behandlede mus. Det blev imidlertid genoprettet tilbage til normal kun i tilfælde, hvor tumoren regression efter behandling med forbindelse 4a, i modsætning til de ubehandlede mus, hvor uregelmæssige hepatocytter stadig sås (fig. S3C, D).