PLoS ONE: OCT4 Positivt Regulerer Survivin Expression at fremme Cancer Cell Proliferation og fører til dårlig prognose i esophageal planocellulært Carcinoma

Abstrakt

Baggrund

OCT4 og Survivin er vigtige faktorer for kræft celledeling , fornyelse og dedifferentiering, og korrelerer med resistens mod strålebehandling og kemoterapi i de fleste menneskelige kræftformer, men deres reguleringsmekanismer er ikke kendt.

Metodologi /vigtigste resultater

i denne undersøgelse 50 patienter med esophageal planocellulært karcinom (ESCC) blev retrospektivt analyseret. OCT4 blev udtrykt i 13 tilfælde (26%), og survivin positivt udtrykt i 31 tilfælde (62%), undersøgt af immunkemi. OCT4 viste sig at være en uafhængig forudsigende faktor for median overlevelsestid, og patienterne fra undergruppen med både høj ekspression af OCT4 og Survivin havde den værste prognose undersøgt ved log-rank test. For yderligere at udforske den molekylære reguleringsmekanisme mellem OCT4 og Survivin, vi bygget den specifikke

lille

hårnål RNA (shRNA) udtrykkende vektorer målrettet OCT4 eller /og Survivin og manipuleret udtryk for OCT4 og Survivin. Ved Western blotting og RT-PCR, fandt vi, at OCT4 kunne opregulere Survivin ekspression i esophageal cancer cellelinjer Eca109 og TE1. Samtidig knockdown af OCT4 og Survivin ekspression induceret celle apoptose og G2-fase fald i cellecyklus ved flowcytometri, og endelig udøves en forøget anti-proliferation potens i Eca109 og TE1 cellelinier ved MTT-assayet.

Konklusioner

Denne undersøgelse viser, at OCT4 og Survivin udtryk blev korreleret med dårlig overlevelse hos patienter med ESCC. OCT4 og Survivin kan betragtes som mål i ESCC bioterapi

Henvisning:. Li C, Yan Y, Ji W, Bao L, Qian H, Chen L, et al. (2012) OCT4 Positivt Regulerer Survivin Expression at fremme Cancer Cell Proliferation og fører til dårlig prognose i esophageal pladecellecarcinom. PLoS ONE 7 (11): e49693. doi: 10,1371 /journal.pone.0049693

Redaktør: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Cancer Centre, Australien

Modtaget: Juni 11, 2012; Accepteret: 11 oktober 2012; Udgivet: November 21, 2012 |

Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Scientific Foundation of China (30801106, 81172308, 30.973.469). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

esophageal planocellulært karcinom (ESCC) er en af ​​de fleste maligne tumorer med høj dødelighed [1], [2]. Skønt der er fundet og anvendt i ESCC bioterapi nogle nye molekylære mål, er de molekylære mekanismer i ESCC tilbagefald og metastase stadig ikke forstået. En voksende mængde beviser antydede, at kun en lille brøkdel af kræft initierende celler har evnen til at forny sig selv, såvel som, at drive initiering og progression af cancer, og fremlagt kraftigt resistens mod kemoterapi og strålebehandling [3], [4] , hvilket giver os en bedre forståelse af molekylære basis for ESCC.

octamer-bindende transkriptionsfaktor 4 (OCT4) er en af ​​de stamceller relateret transkriptionsfaktorer, der regulerer tumor spredning og selv-fornyelse. Dårligt differentierede eller udifferentierede cancerceller er blevet karakteriseret ved mange fænotypiske træk ligner udifferentierede embryonale stamceller, hvilket antyder, at OCT4 kan udtrykkes i faste tumorer som kræft initierende celle biomarkør [5]. OCT4 hører til familien af ​​POU-domænet transkriptionsfaktorer, herunder en homeodomæne hvilket er vigtigt i fosterudviklingen [6], [7]. Det er blevet bevist, at OCT4 overudtrykt i mange somatiske cancere, såsom brystcancer, prostatacancer, ikke-småcellet lungecancer, blærecancer, oral pladecellecarcinom, gastrisk cancer, esophageal cancer [8] – [14]. OCT4 ekspression spiller en central link tumorigenese og vedligeholdelse af cancerceller.

Survivin er medlem af inhibitorer af den apoptotiske genfamilien, og spiller en vigtig rolle i tumorudvikling ved at inhibere celle apoptose, regulering af celledeling og induktion af angiogenese [15]. Overekspression af Survivin blev foreslået i forskellige cancerformer, herunder ESCC [16], [17], men sjældent til stede i normale voksne væv. Survivin ekspression i cirkulerende cancerceller i det perifere blod hos patienter med ESCC blev påvist og givet værdifulde oplysninger i forudsigelsen af ​​cancer tilbagefald og dårlig prognose [18], [19]. Desuden, overekspression af Survivin i ESCC præsenterede resistens mod kemoterapi og kortere overlevelse [20], og der var lignende resultater i andre cancere [21].

tidligere undersøgelse viste, at knockdown af Survivin ekspression i en række human cancer cellelinier, såsom A549, HeLa og MCF-7-celler, resulterede i en signifikant reduktion af cellelevedygtighed, og kombinationen af ​​Survivin-directed silencing strategi med kemoterapeutiske midler udgjorde en værdifuld fremgangsmåde til kræftbehandling med en forbedret antitumorvirkning [21], [22]. Men kræft fornyet vækst er formentlig det vigtigste element, fordi kræften initierende celler modstå de konventionelle kræftbehandling og vil sandsynligvis spille en vigtig rolle i kræft tilbagefald [23]. Derfor målrette kræft initierende celler har potentiale til markant at forbedre resultater for kræftpatienter. OCT4 er en mester gen, der spiller en central rolle i selv-fornyelse og pluripotens af stamceller. At være selektivt udtrykt i tumorvæv, foreslog beviser for, at OCT4 kan være et lovende mål for udviklingen af ​​anticancer strategier til at eliminere kræft initierende celler [24].

For nylig blev det rapporteret, at Survivin udtryk dramatisk blev nedsat i OCT4 knockdown murine embryonale stamceller [25], hvilket tyder på, at der er en sammenhæng mellem OCT4 og Survivin. Men de molekylære reguleringsmekanismer mellem OCT4 og Survivin er endnu ikke klart, i kræft. I den aktuelle undersøgelse, vi undersøgte OCT4 og Survivin udtryk og analyseret den prognostiske betydning af disse to gener med ESCC prøver. I mellemtiden, den reguleringsmekanisme af OCT4 og Survivin udtryk og deres funktion på celle apoptose, celledeling eller cellecyklus blev undersøgt i ESCC cellelinjer.

Resultater

OCT4 og Survivin var Over-udtrykt i ESCC

udtryk for OCT4 og Survivin blev påvist ved immunhistokemi i eksemplarer af ESCC og tilstødende normale esophageal væv. OCT4 blev udtrykt i 13 (26%) af ESCC men kun 2 (4%) af normale esophageal væv. Survivin blev udtrykt i 31 (62%) af ESCC men kun 11 (22%) af normale esophageal væv. Der var forskelle mellem ESCC og normale esophageal grupper (

s

= 0,0051 for OCT4;

s

= 0,0001 for Survivin). Den OCT4-positive immunreaktivitet blev hovedsageligt fordelt i ESCC cellulære kerner og Survivin blev primært fordelt i ESCC cytoplasma. De OCT4- og Survivin-positive celler blev primært lokaliseret i de basale dele af epithel (fig. 1). Survivin udtryk ikke relateret til OCT4 udtryk i disse ESCC prøver (R = 0,276,

s

= 0,052; tabel 1).

De paraffinindstøbte sektioner blev udsat for immunhistokemisk undersøgelse med det primære muse-anti-humant OCT4 og kanin-anti-humane survivin antistoffer ved arbejde koncentration på 1:100, og diaminobenzidin (DAB) blev anvendt til at farve den positive reaktion. Den phosphatbufret saltvand (PBS), i stedet for de primære antistoffer, blev anvendt til negativ kontrol. Procenter af positive celler blev talt inden for 5 high-power felter, original forstørrelse × 200.

Statistisk sammenhæng mellem OCT4 eller Survivin udtryk og ESCC klinisk-patologiske karakteristika (køn, alder, celledifferentiering, tumor invasion dybde, blev lymfeknude metastaser) analyseret og viste ingen signifikante forskelle mellem de OCT4- eller Survivin-positive og OCT4- eller Survivin-negative tilfælde af ESCC (tabel 2).

OCT4 og Survivin korreleret til dårlig prognose for ESCC patienter

Opfølgende data fra 50 patienter blev analyseret ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden til at estimere overlevelseskurver. Den mediane OS var 34,5 måneder. Den mediane overlevelse ESCC patienter med OCT4 positivt udtryk var betydeligt mindre end for patienter med OCT4 negative udtryk (

s

0,001). Det tilsvarende resultat blev vist mellem Survivin-positive og -negative ESCC tilfælde (

s

= 0,009). Blandt de tre undergrupper (OCT4-positive /Survivin-positive, OCT4-negative /Survivin-positive, OCT4-negative /Survivin-negative), patienter med OCT4-positive /Survivin-positive ESCC havde en signifikant fattigste prognose (

s

0,001), og den længste OS blev dokumenteret i OCT4-negativ /survivin-negative undergruppe (figur 2A).. Yderligere analyse blev udført mellem to undergrupper ved log-rank test, og resultaterne viste, at OCT4 og Survivin ekspression kraftigt var forbundet med dårlig prognose af ESCC patienter (fig. 2B). Salg

(A) Halvtreds patienter med ESCC blev indrulleret i studiet, og OS blev defineret som tidsperioden fra driften dato til datoen for død eller datoen for opfølgning ende. Overlevelseskurver blev beregnet ved Kaplan-Meier-metoden, og den signifikante forskel blev testet under anvendelse log-rank test. (B) Hvert andet undergrupper blev sammenlignet ved log-rank test.

Dataanalyse med univariate Cox ‘proportionale hazard model viste, at OCT4 og Survivin var væsentlige prognostiske faktorer af ESCC patienter. viste imidlertid, den multivariate analyse, at OCT4 var en uafhængig prognostisk værdi i ESCC patienter, men Survivin var ikke (

s

= 0,168; tabel 3).

hæmmende virkning af shRNA vektorer målretning OCT4 og Survivin i ESCC cellelinier

for at identificere, om den specifikke

lille

hårnål RNA (shRNA) rettet OCT4

(OCT4-shRNA),

Survivin

( sur-shRNA)

, eller dobbelt shRNAs (Dual-shRNA) målrette både OCT4 og Survivin, påvirket esophageal cancer celleproliferation, MTT assay blev udført for at opdage cellernes levedygtighed. Cellelevedygtighed var naturligvis faldet i de Eca109 og TE1 celler transficeret med OCT4-shRNA og Sur-shRNA sammenlignet med de parentale eller Ctr-shRNA transficerede celler. Dual-shRNA udøvede en forbedret hæmmende effekt på cellernes levedygtighed i forhold til shRNA vektor rettet mod enkelt faktor. Der var dog ingen forskel i cellelevedygtighed mellem OCT4-shRNA og Sur-shRNA grupper (fig. 3A). Salg

(A) de parentale og shRNA-transficerede Eca109 og TE1 celler blev dyrket i plader med 96 brønde ved en densitet på 8 x 10

3 celler /brønd i 48 timer. Cellernes levedygtighed blev bestemt ved methylthiazoletetrazolium (MTT) assay ved en bølgelængde på 490 nm,

#

s

0,01; Dual-shRNA: vektor, der indeholder dobbelt shRNAs rettet mod både OCT4 og Survivin. (B) Efter Eca109 celler blev transficeret med shRNA vektorer, 5 × 10

6 celler /ml blev høstet og farvet med Annexin V-FITC og PI og analyseret ved flowcytometri. Procenter af tidlig apoptose blev vist i histogrammer, data var repræsentanter for tre uafhængige forsøg, og kvantitative histogrammer blev samlet data, fejl barer er standardafvigelsen (SD), *

s

0,05;

#

s

0,01. (C) Cell cyklus blev målt ved flowcytometri. Data for cellecyklus blev vist i histogrammer, *

s

. 0,05

Apoptose af ESCC cellelinjer blev målt ved FCM med Anexin V-FITC og PI farvning. Efter behandling med shRNA vektorer til 48 timer blev procentdele af tidlig celle apoptose forøges i OCT4-shRNA (13,4 ± 2,76%), Sur-shRNA (10,89 ± 2,21%) og Dual-shRNA (17,79 ± 3,89%) grupper, sammenlignet med, at der i de parentale celler (1,20 ± 1,01%) og Ctr-shRNA (0,87 ± 0,64%) gruppe, især højere i Dual-shRNA gruppe (fig. 3B). Sammenlignet med forældrenes og Ctr-shRNA grupper blev procentdele af G2-fase celler signifikant reduceret i OCT4-shRNA, Sur-shRNA og Dual-shRNA transficerede grupper, men der var ingen signifikant forskel for G1 og S-fase celler ( fig. 3C).

Survivin Expression var forbundet med OCT4 i ESCC Celler

for at undersøge interaktionen og regulering mellem OCT4 og Survivin, den OCT4-shRNA, Sur-shRNA og Dual-shRNA vektorer blev designet til at manipulere målgenekspression i ESCC cellelinier. Ved Western blot og RT-PCR-analyse, blev OCT4 og Survivin positivt udtrykt i de parentale Eca109 og TE1 celler. De OCT4-shRNA og Sur-shRNA vektorer kunne hæmme det specifikke mål genekspression, og Dual-shRNA vektor kunne hæmme ekspression af begge Oct4 og survivin gener. Den OCT4-shRNA kunne også nedregulere Survivin ekspression i Eca109 og TE1 celler (fig. 4A), men den Sur-shRNA havde ingen indflydelse på OCT4 ekspression (fig. 4B).

(A) parentale og shRNA-transficerede Eca109 og TE1 celler blev dyrket i plader med 96 brønde ved en densitet på 8 x 10

3 celler /brønd i 48 timer, og ekspression af OCT4 og Survivin i de høstede ESCC celler blev undersøgt ved Western blotting . Glyceraldehyd-3- phosphatedehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en loading kontrol. Den relative band intensitet blev analyseret ved densitometri efter normaliseret med GAPDH indhold, *

s

0,05;

#

s

0,01. (B) OCT4 og Survivin mRNA-ekspression blev undersøgt ved revers transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR). GAPDH blev anvendt som en indre kontrol. Den relative band intensitet blev analyseret ved densitometri efter normalisering med GAPDH indhold, *

s

0,05;

#

s

0,01. Alle data var repræsentanter for 3 uafhængige forsøg. Kvantitative histogrammer blev samlet data. Fejl barer: standardafvigelse (SD); Dual-shRNA:. Vektor, der indeholder dobbelt shRNAs rettet mod både OCT4 og Survivin

Dynamisk Lokalisering af OCT4 og Survivin Expression i ESCC Celler

Vi yderligere undersøgt den dynamiske variation af OCT4 og Survivin udtryk i ESCC celler ved konfokal assay. Efter 48 h transfektion med OCT4-shRNA, Survivin udtryk blev især nedreguleret i cancer cellulære cytoplasma sammen med nedgangen i OCT4 udtryk i cellulære kerner. Men efter transfektion med Sur-shRNA, det OCT4 ekspressionsniveauet blev ikke ændret sammen med faldet i Survivin udtryk (fig. 5).

De forældre og shRNA-transficeret Eca109 og TE1 celler blev dyrket i 96- brønde ved en densitet på 8 x 10

3 celler /brønd i 48 timer, og de høstede celler blev fikseret med 4% formaldehyd, derefter undersøgt OCT4 og Survivin ekspression ved immuno fl uorescent konfokal assay og observeret under et laser-konfokalt .

diskussion

OCT4, som en af ​​de vigtigste transkriptionsfaktorer, spiller en central rolle i pluripotente stamceller [26]. OCT4 sammen med SOX2 og Nanog, fastholder stamceller pluripotens, selv-fornyelse og differentiering [27]. Det er efterhånden blevet en lovende tumor biomarkør til diagnosticering af kønsceller tumorer [28]. For nylig er det rapporteret, at OCT4 kunne påvises i mange somatiske cellecancere fra esophagus, blære, lunge og lever, og har en stærk indflydelse på patienternes prognose. Funktionen af ​​OCT4 kunne modulere en række signalveje, såsom Wnt /β-catenin, TGF-β, JAK /STAT3 signalveje [29], [30], for at aktivere eller begrænse de nedstrøms målgener. Desuden OCT4 udtryk i muse embryonale stamceller er nødvendig for beskyttelse mod apoptose og denne effekt kan være forbundet med STAT3 /Survivin vej [25].

Survivin, et nyligt identificeret medlem af hæmmere af apoptose protein (IAP ) familie, regulerer væsentlige cellulære proces, herunder undertrykkelse af apoptose, kontrol af celledeling, og fremme af angiogenese [31]. Som en af ​​mest fremtrædende cancer-gener, er Survivin udtrykkes i næsten alle tumorer, men er ikke påvist i de fleste normale voksne væv [32]. Survivin blev betragtet som et målgen i cancerterapi, og nedregulering af survivin kunne undertrykke tumorvækst og forbedre tumorcelle følsomhed over for stråling og kemoterapi ved at fremme apoptose og inhibering af cellelevedygtighed. Lægemidler af LY2183108 [33] og YM155 [34] målrettet Survivin blev taget i brug i kliniske forsøg i forskellige stadier, og effekten var lovende. Selvom tumorvækst hastighed blev bremset på styrken af ​​lyddæmpende Survivin, tumorer stadig besidder evne udvikling og udvidelse og fratage af patienternes liv, hvilket antyder, at Survivin ikke var en enkelt faktor til prognose. Der er stadig en ukendt reguleringsmekanisme mellem OCT4 og Survivin.

Over-ekspressionen af ​​OCT4 eller Survivin i ESCC har konsekvent forbundet med sygdomsprogression, metastatisk spredning, modstandsdygtighed over for terapi [14], [18]. Derfor har vi opdaget både OCT4 og Survivin udtryk i ESCC tumor prøver, og fandt, at OCT4 og Survivin var tæt forbundet med den kirurgiske resultat af ESCC patienter. Patienter med Oct4-positiv eller survivin-positive tumorer præsenteret meget dårligere prognose end dem med Oct4-negative eller Survivin-negative tumorer. Blandt undergrupperne, patienter med OCT4-positive /survivin-positive tumorer viste den korteste samlede overlevelsestid. Ved multivariat og univariate analyser, der både OCT4 og Survivin forbundet med patienternes prognose, og OCT4 betragtes som en selvstændig faktor for forcasting patienternes samlede overlevelse tid. Fra vores undersøgelse, konkluderede vi, at OCT4 og Survivin fællesskab var relateret til dårlig prognose for ESCC patienter, men de regulatoriske mekanismer mellem OCT4 og Survivin i ESCC er endnu ikke klart.

inhibering af ekspressionen af ​​OCT4 eller Survivin i ESCC cellelinjer med OCT4-shRNA eller Sur-shRNA vektorer resulterede i en reduktion i G2-fase celler og en stigning i celle apoptose, og co-undertrykkelse af OCT4 og Survivin af Dual-shRNA vektor resulterede i en forstærket effekt. Nogle undersøgelser viste, at inhibering af Survivin forårsaget standsning af cellecyklus i G2-M-fasen [35], [36], men vores undersøgelse fandt antallet af G2-fase celler blev reduceret voldsomt efter at undertrykke Survivin ekspression. G1-S-fase, samt G2-M-fasen, var den vigtigste checkpoint i cellecyklus, som kontrollerer og vedligeholder celle proces nøjagtighed. Det blev rapporteret, at overekspression af Survivin kan hjælpe kræftceller til at passere G2-M checkpoint [37], [38]. Samtidig, Survivin besidder en evne til at opregulere ekspressionen af ​​cyclin D1 og sikrer kræftceller at passere G1-S checkpoint flydende og opnå en evne vedvarende proliferation [38], [39].

Tidlig apoptose blev øget med nedregulering af Survivin i mange rapporter. For yderligere at undersøge den molekylære mekanisme af OCT4-involveret celle apoptose og standsning af cellecyklus i Eca109 og TE1 celler, fandt vi, at de ESCC celler udtrykte lavere niveauer af OCT4 og Survivin protein efter transficeret med OCT4-shRNA, men kun Sur-shRNA down- reguleret Survivin ekspression og der var ingen ændring i OCT4 ekspressionsniveau. Vi konkluderede derfor, at OCT4 kan regulere celle apoptose og celledeling gennem Survivin funktion. OCT4 kunne aktivere flere signalveje til kontrol Survivin udtryk, såsom STAT3, myc og NFKB pathways [30], [40] -. [42], som er afgørende for cancer celleoverlevelse og antiapoptosis

I nærværende undersøgelse, fandt vi, at overekspression af OCT4 og Survivin er et vigtigt element i ESCC progression, og OCT4 udtryk er tæt korreleret med Survivin udtryk i reguleringen af ​​kræftcellen apoptose og proliferation. Imidlertid er de molekylære mekanismer mellem OCT4 og Survivin er meget kompliceret. Vi skal udføre arbejde for at klarlægge de genetiske egenskaber OCT4 og Survivin, og design mere effektiv antitumor terapi for ESCC.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

Halvtreds patienter med ESCC blev indrulleret i studiet i Changhai Hospital (Shanghai, Kina) fra 1. Januar til December 31, 2005. undersøgelsen blev godkendt af Etik udvalg Second Military Medical University. Patienterne bestod af 37 mænd og 13 kvinder. Alderen varierede fra 47 til 72 år, og den mediane alder var 62 år. Alle patienter forudsat den skriftlige godkendelse. De resektion læsioner blev diagnosticeret patologisk som ESCC efter operationen. Opfølgningen for patienter startede fra driften dato aug 31, 2011. Den samlede overlevelse (OS) blev defineret som tidsperioden fra datoen for opfølgning start til dødsdagen eller datoen for opfølgning ende .

cellelinjer og Cell Culture

Menneskelig ESCC cellelinjer, Eca109 og TE1, blev købt fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Celler blev holdt som et monolag i RPMI-1640 med 10% FBS (føtalt bovint serum), 100 IU /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 incubator.

immunhistokemisk farvning

de friske tumorer og tilstødende normale væv blev indhentet fra de resektion prøver under drift. De paraffinindlejrede konsekutive snit blev underkastet immunhistokemisk undersøgelse for OCT4 og Survivin ekspression under anvendelse af de primære antistoffer, herunder muse-anti-humant OCT4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) og kanin-anti-human survivin (RD Systems Inc, Minneapolis, MN, USA), og ultrasensitiv streptavidinperoxidase Kit (Fuzhou Maixin bioteknologiske udvikling Co, Fuzhou, Kina). Procentdelen af ​​positive celler blev talt inden for 5 high-power felter, og vurderingen af ​​farvningen blev udført i overensstemmelse med den immunoreaktive score foreslået af Friedrichs [43].

Konstruktion og transfektion af shRNA vektorer

shRNA sekvenser for human OCT4 (OCT4-shRNA: 5′-CCCTCACTTCACTGCACTG-3 ‘) og survivin (Sur-shRNA: 5′-GAAAGTGCGCCGTGCCATC-3′) blev syntetiseret og klonet henholdsvis ind pGenesil vektor (Wuhan Genesil Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Kina), hvor sekvenser blev kontrolleret af U6 promotoren. Dual-shRNA vektor, der indeholder dobbelt shRNAs rettet mod både OCT4 og Survivin og mock kontrol shRNA vektor (Ctr-shRNA, 5’-GACTTCATAAGGCGCATGC-3 ‘) blev samtidig bygget.

ESCC celler i log-fase blev transficeret med shRNA vektorer i en koncentration på 4 pg /10

5 celler ved hjælp af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen Corporation Shanghai repræsentationskontor, Shanghai, Kina). De transficerede celler blev dyrket kontinuerligt ved 37 ° C i en CO

2 inkubator i yderligere 48 timer, derefter høstes til at forberede at undersøge genekspression.

Western Blotting Analysis

De høstede celler blev lyseret i phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) opløsning, og det isolerede protein blev elektroforesebehandlet på natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og undersøgt ved Western blotting under anvendelse af anti-survivin og anti-OCT4 antistoffer. Blots blev visualled ved forøget kemiluminescens-reagens (PerkinElmer Inc., Shanghai, Kina).

Semikvantitativ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Efter 48 timers transfektion totalt RNA ekstraheret med Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) fra de høstede Eca109 og TE1 cellelinier og opløst i diethylpyrocarbonatetreated (DEPC) vand. Ekspressionen af ​​OCT4 og Survivin blev undersøgt under anvendelse af Takara Reverse Transcription System Kit (Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian, Kina) ved Oct4 primere (sense: 5′-CAG TCGTCAGCGTCGTCGTTGTAAGCTGCGGCCC-3 ‘, antisense: 5’-ACGCGTCG ACTCAGTTTGAATGCATGGGAG -3 ‘, produkter 480-bp) og survivin primere (sense: 5′-CGGAATTCACCATGGGTGCCCCGACG-3′, antisense: 5’-GAAGATC TTCAATCCATGGCAGCCAG-3 ‘, produkter 448-bp). Glyceraldehyd-3- phosphatedehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en loading kontrol af primerne (sense: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘, antisense: 5′-TCCACCACCCTGT TGCTTGTA-3’, produkter 120-bp). Bands af de produkter, elektroforese på ethidiumbromid (EB) -agarose gel blev analyseret semikvantitativt ved gråtoner densitometrianalyse.

Analyse af Cell Cycle og apoptose ved flowcytometri (FCM)

Efter 48 timers transfektion, de høstede celler blev vasket med 0,1 M phosphatpufret saltopløsning (PBS) og resuspenderede celler med 0,1 M PBS til en koncentration på 10

6 celler /ml. En del af cellerne blev fikseret i 1 ml forafkølet 70% alkohol natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubation med propidiumiodid (PI) opløsning ved en koncentration på 50 ug /ml og RNase A ved en koncentration på 20 ug /ml for 30 min i mørke. Cellecyklussen blev analyseret ved FCM (FACS420, BD Biosciences, San Jose, CA). En anden del af cellerne blev inkuberet med 5 pi Annexin V-FITC i 195 pi bindingsbuffer i mørke i 10 min. Celler blev centrifugeret ved 1000 g i 5 min og resuspenderet i 190 pi bindingspuffer og 10 pi PI, efterfulgt af fl uorescence analyse.

Methylthiazoletetrazolium Assay

Eca109 og TE1 celler blev podet i 96-brønds plader ved en densitet på 8.000 celler /brønd og transficeret med shRNA vektor som beskrevet ovenfor. Efter 48 h, 3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) -3,5-diphenytetrazoliumromide (MTT) ved 5 mg /ml blev tilsat til hver brønd og kontinuerligt inkuberet i 4 timer. Efter tilsat 150 pi dimethylsulfoxid (DMSO) til hver brønd blev absorbansen målt ved 490 nm.

Immuno fl uorescent Konfokal Assay

Cancer celler blev høstet og fikseret med 4% formaldehyd i 15 min ved stuetemperatur, derefter vasket i 0,1 M PBS og behandlet med 0,3% Triton X-100, efterfulgt af inkubering med det angivne OCT4 (1:100) og Survivin (1:100) primære antistoffer ved 4 ° C natten over og de sekundære antistoffer, fl uorescein (FITC) -konjugeret anti-kanin IgG eller cyanin-3 (Cy3) -mærket gede-anti-muse-IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), ved stuetemperatur i 40 min i mørke. Celler blev farvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og detekteres under en laser-konfokalt.

Statistisk analyse

chi-square test og Spearman rang korrelation blev anvendt til at analysere forholdet og sammenhængen mellem relativ genekspression og kliniske patologiske data. OS blev vurderet af Kaplan-Meier-metoden og den signifikante forskel i OS blev beregnet ved log-rank test. Univariate og multivariate analyser blev udført ved hjælp af Cox ‘proportionale hazard model. De eksperimentelle data var repræsentative for tre uafhængige forsøg, og analyseret statistisk ved to-vejs variansanalyse (ANOVA) under anvendelse af PASW Statistics softwareversion 18.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA). Forskelle blev anset for at være signifikant for

s

. 0,05