PLoS ONE: Glycogene Expression Alterations associeret med kræft i bugspytkirtlen Epithelial-Mesenchymale Transition i supplerende Model Systems

Abstrakt

Baggrund

Evnen til selektivt at opdage og målrette kræftceller, der har gennemgået en epithelial- mesenkymale overgang (EMT) kan føre til forbedrede metoder til behandling af kræft, såsom kræft i bugspytkirtlen. Ombygningen af ​​cellulære glykosylering tidligere har været forbundet med celledifferentiering og kan repræsentere en værdifuld klasse af molekylære mål for EMT.

Metode /vigtigste resultater

Som et første skridt i retning af at undersøge karakteren af ​​glycosylering ændringer i EMT, vi karakteriseret udtryk for glycan-relaterede gener i tre

in vitro

modelsystemer, som hver repræsenterede en supplerende aspekt af kræft i bugspytkirtlen EMT. Disse modeller omfattede: 1) TGF-induceret EMT, som gav et kig på den aktive overgang mellem stater; 2) et panel af 22 bugspytkirtelkræft cellelinjer, som repræsenterede terminal differentiering tilstande af enten epitel-lignende eller mesenchymale-lignende; og 3) aktivt-trækkende og stationære celler, som gav et kig på den mekanisme af migration. Vi analyserede udtryk data fra en liste over 587 gener involveret i glycosylering (biosyntese, transport sukker, glycan-binding, etc.) eller EMT. Glycogenes blev ændret ved en højere forekomst end alle andre gener i de første to modeller (p 0,05 og 0,005 henholdsvis), men ikke i migration model. Adskillige funktionelle temaer blev delt mellem den inducerede-EMT modellen og cellelinje panel, herunder ændringer i matrix komponenter og proteoglycaner, at sulfatering af glycosaminoglycaner; mannose receptor familiemedlemmer; initiering af O-glycosylering; og visse former for sialylering. ændringer protein-niveau blev bekræftet ved Western blot for mannosereceptoren MRC2 og O-glycosylering enzym GALNT3, og celle-overflade sulfateringsgrupper ændringer blev bekræftet under anvendelse af Alcian Blue-farvning.

Konklusioner /Signifikans

ændringer glycogenes er en vigtig bestanddel af kræft EMT og er karakteriseret ved ændringer af matrixkomponenter, sulfateringen af ​​GAG, mannose receptorer, O-glycosylering, og specifikke sialylerede strukturer. Disse resultater giver kundeemner til at målrette aggressive og lægemiddelresistente former for bugspytkirtelkræftceller

Henvisning:. Maupin KA, Sinha A, Eugster E, Miller J, Ross J, Paulino V, et al. (2010) Glycogene Expression Alterations associeret med kræft i bugspytkirtlen Epithelial-Mesenchymale Transition i Komplementære Model Systems. PLoS ONE 5 (9): e13002. doi: 10,1371 /journal.pone.0013002

Redaktør: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilien

Modtaget: April 26, 2010; Accepteret: August 30, 2010; Udgivet: 27 September, 2010

Copyright: © 2010 Maupin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute (www.cancer.gov) (R03CA139225 til BH, National Institutes of Health [NIH] R01 CA132571 til VK, og NIH R01 CA130940 NT), American Cancer Society (www.cancer.org) ( CSM-116.801 til VK), Statens Institut for Neurologiske lidelser (www.ninds.nih.gov) (NIH R01 NS042262 til MB) og Van Andel Research Institute (www.vai.org). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen har en af ​​de fattigste overlevelsesrater for enhver større kræft [1]. Den ekstreme dødelighed af pancreascancer er relateret til dets tendens til at udbrede på tidlige trin forud for diagnosen [2], [3] og dens modstandsdygtighed over for kemoterapeutika [2], [4]. Købet af vandrende og resistente træk i bugspytkirtelkræftceller kan forekomme i en trin-for-trin mode, ledsaget af stigende ændringer i genetik og morfologier af kræftcellerne. Tidlige fase og præ-maligne tilstande menes at bestå af dysplastiske celler i bugspytkirtlen kanaler [5], og progression til duktalt adenokarcinom er kendetegnet ved prolifererende epitel cancerceller samlet i rør-lignende duktale strukturer omgivet af fibrotisk stroma. Den metastatiske spredning af kræft i bugspytkirtlen kræver celler til at bryde væk fra de epiteliale duktale strukturer og tage karakteristika migrerende, mesenkymale celler. Denne overgang indebærer enorme remodeling af cellen og er sandsynligvis drevet af genetiske afvigelser, ekstracellulære signaler og aktivering af differentiering programmer i kræftcellerne. Karakterisere de molekylære ændringer, der er forbundet med den fænotypiske kontakten i bugspytkirtelkræftceller fra epitel-lignende til mesenkymale-lignende træk vil give indsigt i muligheder for at opdage og målrette denne konvertering.

Denne store fænotypiske kontakten i bugspytkirtelkræftceller kan være drevet af epitel-mesenkymale overgang (EMT). EMT er et biologisk program, der koordinerer omdannelsen af ​​celledifferentiering fra epiteliale karakteristika stærk celle-celle-adhæsion, polaritet, og glat morfologi til mesenkymale karakteristika minimale celle-celle-kontakter, tab af polaritet, og øgede celle fremspring [2] [6], [7], [8], [9]. EMT aktiveres normalt i udvikling og sårheling under vævsremodellering, men det menes at være unormalt aktiveres af visse typer cancerceller til at give træk forbundet med meget dødelige kræftformer. Flere linjer af beviser understøtter vigtigheden af ​​EMT at fremme bugspytkirtelkræft aggressivitet. Den generelle histologiske tab af cellulær differentiering er en meget nøjagtig indikator for dårligt resultat i bugspytkirtelkræft [10], [11], og de specifikke EMT markører for reduceret E-cadherin og øget vimentin korrelerer med dårlig overlevelse [12], [13] og invasion [14]. Musemodeller for bugspytkirtelkræft rekapitulere dette forhold [15]. Efter aftale med disse resultater, induktion af en transskription faktor kaldet snegl, der kontrollerer E-cadherin undertrykkelse, resulterer i øget metastaser og kemoresistens af bugspytkirtelkræftceller [16]. Endvidere kan mesenkymale-lignende cancerceller være mere resistente end deres epitel-lignende modstykker, som foreslået af korrelationen mellem gemcitabin modstand og mesenchymal træk [17] og tab af EGFR-inhibitor følsomhed i bugspytkirtelkræftceller der har tabte epitel-lignende træk [8]. Intensive undersøgelser har afdækket mange af de reguleringsmekanismer og molekylære karakteristika ved denne konvertering [2], [6], [7], [8], [9], men in vivo faktorer på arbejdspladsen i kræft EMT, og som er relevante til kræft i bugspytkirtlen progression er ikke klare.

glycosyleringen af ​​en kræftcelle kan ombygget væsentligt i EMT, selv om karakteren af ​​denne forening ikke har været godt karakteriseret. Glycosylering er en dynamisk proces, der involverer en samordnet samspil mellem forskellige glycosyltransferaser og tilhørende enzymer i det endoplasmatiske reticulum og Golgi-apparatet [18]. Glykanstrukturer er involveret i korrekt proteinfoldning [19], [20], [21], intracellulær transport [18], [20], [22], cellevækst og differentiering, [20], [23], adhæsion og migration [18], [24], og cellebaserede immunitet [20], [25], blandt andre funktioner. Ændringer i glykaner er blevet opdaget og impliceret i forskellige patologiske tilstande [23], [26]. Derudover carbohydratstrukturer på celle-overfladen og secernerede proteiner er gode indikatorer for celletype og status, idet de specifikt ændre sig i forbindelse med udvikling [27], [28], celledifferentiering og aktivering [29], [30], og transformation [31]. vi hypotese derfor, at kræft i bugspytkirtlen EMT er karakteriseret ved specifikke glycosylerings forandringer, der spiller funktionelle roller i kræft celledifferentiering eller migration.

Som et indledende skridt i at teste denne hypotese undersøgte vi ekspressionen af ​​glycosylerings-relaterede gener i tre modelsystemer af EMT eller migration. Overvågning genekspression er eksperimentelt mere medgørlige end omfattende karakterisering glykanstrukturer forbundet med hver model-system, og vi valgte derfor denne rute for en indledende undersøgelse. Selv om det ikke er muligt at udlede glykanstrukturer simpelthen fra genekspression af glycogenes, udtryk ændringer i glycogenes giver indsigt i større strukturelle ændringer samt leads på mål point for terapeutisk intervention. Expression ændringer i glycogenes tidligere er blevet undersøgt ved hjælp af fokuserede mikroarrays eller PCR arrays designet til specifikt at måle de relevante udskrifter [32], [33], [34]. Her demonstrerer vi brug af hel-genom udtryk profilering at fange de samme oplysninger ved selektivt at analysere data fra et mål gen liste over 587 glycan-associerede gener (herunder gener er relevante for EMT). En fordel ved denne fremgangsmåde er muligheden for at bruge standard ekspressionsprofil platforme samt historiske data, der ikke blev genereret specielt for at behandle glycogenes. Vi anvendte cellekultursystemer, hvori EMT kan kontrolleres ved stimulering med TGFp (model 1) eller hvori den terminale differentiering tilstand af en række forskellige cellelinjer kunne klassificeres som enten epitel-lignende eller mesenchymal-lignende (model 2). Derudover undersøgte vi genekspression mønstre i celler, der blev enten aktivt migrerer eller stationære (model 3). Hver model-system repræsenterer et andet aspekt af celle adfærd vedrørende EMT: aktiv overgang mellem stater, terminal differentiering stater, eller aktiviteten af ​​migration. Vi rapporterer her de store ændringer at glycan-associeret genekspression, der er forbundet med hver af de modelsystemer, og som er fælles mellem modelsystemer.

Resultater

Glycogene udtryk i TGF-induceret EMT

Den første model system, hvor vi undersøgte glycogene udtryk ændringer var TGF induktion af EMT i cellelinjer Panc-1 og A549. Den A549 cellelinje blev ikke stammer fra kræft i bugspytkirtlen, men blev medtaget for at give oplysninger om den generelle betydning af de foreninger med EMT. Desuden ved at lede efter gener, der ændrer i begge cellelinier, vi reduceret listen over kandidatgener. TGFp behandling resulterede i opløsning af celle-celle-adhæsion og stigninger i spindel-lignende fremspring i begge cellelinier (figur S1). Whole-genom ekspression målinger blev opnået for de behandlede og ubehandlede celler under anvendelse Affymetrix genchips. For en fokuseret analyse af gener af interesse, vi brugte vores liste over 587 gener relateret til glycosylering og EMT-associerede veje (se tabel S1).

Vi først undersøgt, om glycosylering gener viste en højere udtryk ændringer end alle andre gener (tabel 1), hvilket kan indikere en fremtrædende rolle for glycosylering ændringer i EMT. Blandt alle gener, 1.524 unikke Affymetrix mål ændret ekspression i både Panc-1 og A549 efter behandling med TGFp. Da vores glycan gener udgjorde 1,5% af det samlede antal unikke Affymetrix U133 Plus 2.0 mål, tilfældig repræsentation af glycogenes forudsiger en tilsvarende 1,5% repræsentation af glycogenes (eller 23 gener) blandt dem, der ændrede ekspression. Men 40 af de 1.524 gener (2,6%) var glycogenes fra vores mål liste. Denne forskel var signifikant ved chi-square analyse (X

2 = 13.05, p 0,05). Dette resultat foreslog en berigelse af transkriptionel regulering af glycan-relaterede gener i TGF-induceret EMT.

En undersøgelse af de gener, der er blevet ændret mere end 1,5 gange i begge cellelinier (tabel 2 og 3 ) afslørede nogle funktionelle temaer. Den største ændring var i proteoglycan SPOCK1, som indeholder glycosaminoglycan sidekæder af heparin- og chondroitin-sulfat [35]. Relateret til dette protein, blev gener, der ændrer glycosaminoglycan sulfatering opreguleret, herunder SULF2, CHST3, og CHST11, og HAS2 blev opreguleret, som er involveret i syntesen af ​​den glycosaminoglycan hyaluronan. En lectin-lignende receptor involveret i cellemotilitet og ekstracellulær matrix remodellering, MRC2, blev opreguleret. Ændringer indledningen af ​​O-glykosylering blev angivet af GALNT2 og GALNT10 ændringer, og matrix vedhæftning ændringer blev repræsenteret ved opregulering af flere integriner og matrix protein LAMC2 (gamma 2 laminin). Andre forhøjede gener repræsenterer EMT og TGF signaleringsfunktioner. De seks gener med reduceret udtryk viste ingen særlig berigelse i specificitet, med ST8SIA4 er den eneste reduceret glycosyltransferase.

Glycogene Expression i en kræft i bugspytkirtlen cellelinje Panel

Den anden modelsystem var et panel af 22 pancreas cancercellelinier. En mangfoldighed af celle- morfologier og adhæsion adfærd blev observeret blandt cellelinierne (figur 1). Visse cellelinier har stærke epiteliale egenskaber (afrundede morfologier og talrige celle-celle-kontakter), mens andre er klart mesenchymale-lignende (spindel-lignende fremspring og få celle-celle sammenvoksninger). Derfor søgt vi at identificere genekspression karakteristika, der adskiller disse to funktionsmåder. Denne sammenligning er ikke direkte adresse EMT, men snarere giver indsigt i de terminale differentiering stater associeret med mesenkymale og epitel fænotyper.

Mesenkymale-lignende cellelinjer præsenteres i de to øverste rækker, og epitel-lignende cellelinjer er i de to nederste rækker. Bemærk den forøgede celle scatter og spindel fremspring set i mesenkymale-lignende celler sammenlignet med strammere celle-celle-adhæsion og mere sfærisk form karakteristisk for epitelcellerne. Billederne blev indsamlet af fase-kontrast mikroskopi på 10 × forstørrelse.

Vi oprindeligt klassificeret celle linjer som enten epitel-lignende eller mesenkymale-lignende baseret på morfologi og klyngedannelse (Figur 1). Cellelinjer, såsom Capan-2, HPAF-II, og BXPC-3 har tætte, afrundede kolonier og blev utvetydigt klassificeret som epithelial-lignende. På den anden ende af spektret MiaPaCa-2 og MPanc-96 viste tydeligt de mesenkymale karakteristika lave celle-celle interaktioner og spindel lignende cellulære fremspring. Andre cellelinjer var vanskeligere at klassificere disse karakteristika, viser blandede eller partielle karakteristika for hver type. Vi kiggede derfor på ekspression af EMT-relaterede gener som et middel til klassificering (figur S2). Blandt de gener (se figur S2 for den komplette liste) den ZEB1 transskription faktor mest tydeligt svarede til morfologi og stærkt korreleret med nedregulering af epitelial markør, E-cadherin (CDH-1) [6], [7], [8 ], [9] i mesenkymale-lignende celler. Et slående dikotomi af celler, der var negative eller positive for ZEB1 var indlysende, dividere cellelinjer i seks, der var mesenkymale-lignende og 16, der var epitel ud. Baseret på denne klassificering blev ekspressionen af ​​E-cadherin (CDH-1) signifikant op reguleret (p≤0.01) og ekspression af vimentin (VIM) var signifikant nedreguleret (p≤0.01) i epitelceller. Proteinet ekspressionsmønster af disse to gener blev bekræftet ved Western blot (figur 2). Derfor brugte vi denne klassifikation i efterfølgende analyser.

Lysater blev opsamlet fra de udvalgte cellelinjer, fraktioneret ved SDS-PAGE og probet ved Western blot. De fremhævede bands er på de forventede molekylvægte på 110 kD for E-cadherin, 57 kD for vimentin, og 42 kD for actin.

Vi undersøgte, om glycan gener var forskellige mellem grupperne på en højere sats end alle andre gener (tabel 1). Strengt tilfældigt, da vores glycan gener udgjorde 1,5% af det samlede antal unikke Affymetrix U133 Plus 2.0 mål, forventede vi en tilsvarende 1,5% repræsentation af glycogenes blandt listen af ​​de samlede skiftende gener. Men af ​​de 3.675 prober, der viste ændrede niveauer af ekspression (p ≤ 0,05) mellem de mesenkymale-lignende celler og epitelceller-lignende celler signifikant, 87 (2,37%) var glycogenes fra vores målliste. En chi-square analyse viste disse resultater til at være stærkt signifikant (X

2 = 18,9, p≤0.005). Denne tendens fortsatte på højere niveauer af betydning som 1212 unikke Affymetrix mål viste signifikant forskellige udtryk niveauer (p≤0.01). Af disse mål, 30 (2,48%) var på vores liste som glycogenes, også en væsentlig forskel ved Chi-square analyse (X

2 = 8,12; p≤0.005). Denne analyse foreslog en berigelse af transkriptionel regulering af glycan-relaterede gener i differentieringen af ​​celler mellem mesenchymale og epiteliale fænotyper.

genekspressionen ændringer for dette modelsystem er opsummeret i tabel 4 og 5. Svarende til ovenfor, et proteoglycan blev den mest signifikant overudtrykt i de mesenkymale-lignende celler, i dette tilfælde VCAN (versican), og gener, der regulerer sulfateringen af ​​glycosaminoglycaner blev opreguleret, herunder SULF2, CHST7, SGSH, og NDST2. Matrix modifikation var også repræsenteret ved opregulering af VIM (vimentin) og LAMA4 (alfa 4 laminin). I modsætning til i den inducerede-EMT model, gener involveret i forgrening eller udvide glycankæder blev opreguleret i de mesenkymale-lignende celler, herunder MGAT5B, ST3GAL2, ST6GALNAC4, POMGNT1, og B3GNT1. De mesenkymale-lignende celler viste også en slående nedregulering i nogle gener, især GALNT3, der initierer O-glykosylering. GALNT3 blev nedreguleret i alle seks mesenkymale-lignende celler, med et gennemsnitligt fald på ~1000-fold. To C-typen lektiner også blev nedreguleret, LY75 og CLEC3A. De ekspressionsmønstre for disse gener klart at skelne de mesenkymale-lignende cellelinjer fra epitel-lignende (figur 3)

Gener blev inkluderet som havde signifikant forskellige (p 0,01). Ekspressionsniveauer mellem mesenchymale-lignende ( kolonneetiketter farvede rødt) og epitel-lignende (kolonneetiketter farvet sort) cellelinier. Udtrykket værdier blev log transformeret (base 10) og median centreret af rækken. Værdien af ​​hver firkant er angivet med farve bar. Vejviser

Glycogene udtryk i at migrere og stationære bugspytkirtelkræftceller

Den tredje model systemet var en sammenligning af aktivt migrerende celler til stationære celler [36]. Panc-1 og MiaPaCa-2-celler blev podet som 1 mm defineret omkreds og cellerne fik lov til at migrere i 48 timer. Der blev observeret to særskilte morfologiske populationer. Cellerne i periferien af ​​cellen klynge migreret væk fra området med høj celletæthed (fælg) og tog på en klassisk mesenchymale fænotype med spindel fremspring og tab af celle til celle adhæsion. Celler, der forblev i den stærkt befolkede centrum (core) viste større intercellulær adhæsion og var mere afrundet i udseende. Cellerne blev høstet i “fælg” og “kerne” grupper ved selektivt at indsamle fra hver af disse to grupper.

2,778 unikke mål ændret ekspression mindst +/- 0,25 gange i både det migrerende MiaPaCa-2 og Panc-1 i forhold til deres stationære modstykker (tabel 1). Da vores glycan-relaterede gener udgjorde 3,0% af den samlede unikke Agilent Whole Human Genome Microarray Kit (4 × 44K prober), tilfældig chance forudsagde en tilsvarende 3,0% repræsentation af glycogenes på listen over gener, der ændres. Dette niveau af repræsentation blev faktisk observeret, som 84 af de 2778 gener (3,0%) med ændrede niveauer af ekspression var glycogenes fra vores mål liste. En chi-square-analyse afslørede, at forskellen mellem den observerede ændring i glycogenes ikke var signifikant sammenlignet med den forventede værdi. Disse resultater tyder ikke på en berigelse af regulering af glycan-relaterede gener karakterisere forskelle mellem aktivt trækkende og stationære celler.

Færre gener viste forskellen udtryk mellem grupperne end i de ovennævnte modeller (tabel 6 og 7). Otte målgener forøget ekspression med mere end 1,5 gange i både migrerer MiaPaCa-2 og Panc-1. Ingen gener er steget med mere end to gange i begge celletyper. Ingen tydelige temaer i glycogene funktion var mærkbar blandt de gener med forøget ekspression. Ni målgener faldt ekspressionsniveauer end 1,5 gange i både Migrering MiaPaCa-2 og Panc-1. To er relateret til fjernelse af mannose i biosyntesen af ​​N-glycaner, MAN1A2 og Manba. Det mucin MUC12 var den eneste gen med nedsat udtryk større end to gange i begge celletyper.

Delt Gener og Funktionelle Temaer

Vi næste undersøgte, om bestemte genekspression ændringer var fælles mellem to eller flere af modelsystemer. En sådan analyse er nyttigt at give mere vejledning om, hvilke gener er vigtige i flere aspekter af EMT eller er funktionelt vigtige i processer relateret til EMT. Overlappet mellem modelsystemer var svag. Ved sammenligningen TGFp-induceret EMT og cellelinjen panel, kun tre gener var almindelige: ZEB1 og SULF2 opreguleret i begge modeller, og CDH1 blev reduceret i begge. Ved hjælp af data kun fra Panc-1-cellelinien i TGFp-inducerede og migrerer cellemodeller, ST6GALNAC4 steg og PIGM faldet i alle modelsystemer. Disse resultater viser, at mens glycogenes ændres i hver model og er særligt beriget i induceret-EMT og cellelinjen panel, de specifikke gener involveret i hver divergerer mellem systemerne.

Selvom mange af de ændrede gener var forskellige mellem den inducerede-EMT model og cellelinie panel, flere funktionelle temaer var til stede i begge. Den mest fremherskende delt tema var modulering af glycosaminoglycan (GAG) komponent af den ekstracellulære matrix. SPOCK1 og VCAN (versican) er begge matrixproteiner bærer GAG kæder, og begge systemer viste opregulering af gener, der tilføjer og tage væk sulfat fra disse kæder, herunder SULF2, CHST3, CHST11, HAS2, CHST7, SGSH, og NDST2. En alcianblåt assay blev udført for yderligere at karakterisere de overordnede sulfateringsgrupper niveauer mellem epitel- og mesenchymal-lignende cellelinjer samt efter induktion af EMT i Panc-1 af TGFp (figur 4). En betydelig stigning i den samlede sulfatering blev set for mesenkymale-lignende cellelinier (p = 1,29 × 10

-5). Induktion EMT i Panc-1 ved TGFp fortsatte tendensen med markant stigende generelle niveauer for sulfatering (p = 0,027). Disse resultater bekræfter cellulære sulfateringsgrupper ændringer for de to modelsystemer, hvor de blev foreslået af genekspression.

(A) RT-PCR blev udført på lysater fra de angivne cellelinjer, og intensiteter af båndene til den forventede størrelse for hvert gen blev kvantificeret. En t-test (resultater givet af p-værdi) blev udført sammenligning af båndintensiteter mellem mesenkymale-lignende cellelinier (med fed) og epiteliale cellelinjer. Desuden blev en korrelation beregnet (resultater givet af r-værdi) mellem RT-PCR resultater og de microarray data. Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som et cDNA loading kontrol. (B) Sammenligning af GALNT3 protein niveauer ved Western blot i udvalgte bugspytkirtelkræft cellelinjer. Lysater blev opsamlet fra de udvalgte cellelinjer, fraktioneret ved SDS-PAGE og probet ved Western blot. Mesenchymal-lignende celle er mærket med fed. De fremhævede bands er på de forventede molekylvægte på 73 kD for GALNT3 og 42 kD til actin. (C) MRC2 proteinniveauer målt ved Western blot i TGFp behandlede og ubehandlede celler. Cellelinierne blev enten eksponeret for 5 ng /mL TGFp eller ubehandlet under serumudsultning i 72 timer før cellelyse. De fremhævede bands er på de forventede molekylvægte på ~167 kD for MRC2 og 42 kD for actin.

Et andet tema i fælles mellem den inducerede-EMT modellen og cellelinie panelet var ændringer til lectin- lignende receptorer af mannose receptorfamilie. De fire medlemmer af denne familie, MRC1, MRC2, LY75, og CD302, er transmembrane endocytiske receptorer med flere kulhydrat-bindende domæner. MRC2 blev opreguleret og CD302 blev nedreguleret i den inducerede-EMT model, og LY75 blev nedreguleret i cellen linje panel. De to EMT modeller også delt ændringer medlem af N-acetyl galactosamin (GalNAc) transferase familie, som katalyserer den initiale tilsætning af GaINAc til en serin- eller threoninrest i mucin-typen O-koblet glycosylering. GALNT2 og GALNT10 blev opreguleret i induceret EMT, og GALNT3 var den stærkeste diskriminatoren af ​​epitel-lignende og mesenchymal-lignende celler i cellelinjen panel, med ekspression falder under målbare niveauer i mesenkymale celler (figur 4).

Validering af genekspression Forskelle

differentiel genekspression i mesenchymale-lignende og epiteliale-lignende cellelinjer blev bekræftet for visse gener under anvendelse af RT-PCR og Western Blot (figur 5). De korrelationer mellem RT-PCR og microarray resultaterne var generelt i overensstemmelse med de stærkeste korrelationer set i GALNT3, 0,912; ZEB1, 0,774; GMPPA, 0,735; og MAN2B2, 0,713; og svagere korrelationer for ST3GAL6, 0,509; og PMM1, 0,415. ændringer Protein niveau blev bekræftet af Western Blot for GALNT3 og MRC2. GALNT3 afsløring var positiv for de epiteliale cellelinjer BXPC-3, HPAF II, og SU86.86 mens ikke opdages i den mesenkymale-lignende cellelinjer MiaPaCa-2, MPanc-96, og Panc-1. MRC2 blev kun fundet i A549, Panc-1, og MiaPaCa-2 og viste øget niveauer efter behandling med TGFp i disse tre cellelinjer. Der var noget påviseligt indhold af MRC2 for BXPC-3 eller HS766t i nærvær eller fravær af TGFp.

An alcianblåt assay blev udført på lysater fra de angivne cellelinjer, og den samlede sulfatering for hver cellelinie var kvantificeret ved at måle absorbansen af ​​farvestoffet ved 600 nm. En t-test (resultater givet ved p-værdi) blev udført sammenligning af absorbanser mellem mesenkymale-lignende cellelinjer (med fed) og epiteliale cellelinjer samt mellem Panc-1 efter 72 timers TGFp behandling og ubehandlet Panc- 1. Heparin blev anvendt som en sulfateret GAG kontrol. (A) Fotografi af den resulterende tilbageholdelse af Alcian blå farvestof efter udfældning af sulfaterede glykaner og efterfølgende resuspension. Den anden kolonne repræsenterer mesenkymale-lignende cellelinier og bibeholdt mere plet, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​højere niveauer af sulfaterede glycaner i cellelysaterne. (B) Søjlediagrammer viser forskellene i absorbans ved 600 nm for cellelinierne. De mesenkymale-lignende cellelinier (med fed), havde signifikant højere niveauer af absorbans end de resterende epiteliale cellelinier (p = 1,29 × 10

-5). (C) Bar grafer, der viser forskellene i absorbans ved 600 nm for Panc-1 efter 72 timers udsættelse for 5 ng /mL TGFp eller ubehandlet under serum sult. Panc-1 efter TGFp behandling havde signifikant højere niveauer af absorbans end den ubehandlede Panc-1 (p = 0,027).

Diskussion

Evnen til at opdage eller kontrol EMT i bugspytkirtelkræft kunne føre til forbedrede behandlingsstrategier. Karakteriseringen af ​​molekylære ændringer er forbundet med EMT er et første skridt i at udrede nogle af de mekanismer, der driver denne proces. Definition af glycan ændringer i forbindelse med EMT kan være særligt vigtigt for at forstå denne proces, eftersom den kendte involvering af glycaner i andre celledifferentieringsfaktorer processer. Whole-genom udtryk profilering kombineret med et mål gen liste over 587 glycosylering gener var et praktisk redskab til at undersøge glycosylering i denne biologiske system. Hertil kommer, at brugen af ​​tre in vitro modelsystemer vist sig nyttig for behandlingen af ​​komplementære aspekter af epitel og mesenkymale stater, nemlig den aktive overgang mellem stater, de terminale differentiering stater, og den handling af migration.

betydningen af ​​glycan ændringer i EMT blev støttet af frekvensen af ​​ændringer i glycosylerings-associerede gener (tabel 1). Glycan-associerede gener blev ændret oftere end forudsagt i to af de modelsystemer, TGFp-induceret EMT og cellelinjen paneler, men ikke i cellemigrering model. Konstateringen af, at glycan remodeling er et væsentligt aspekt af celledifferentiering processen vil være i overensstemmelse med tidligere arbejde viser vigtigheden af ​​glycan ændringer i stamceller biologi og immun aktivering [27], [31], [37]. Manglen på store glycogene ændringer i celle vandring mellem kan indikere, at de migrerende celler ikke blev faktisk differentiere, men snarere blot ændre udtryk for mekanik migration. glycan ændringer kan derfor være vigtigere som indikatorer for celletype og status snarere end som funktionelle bidragydere til migration. Imidlertid bør det bemærkes, at ændring af glycosyltransferase aktivitet i cellelinje-modeller har vist forskellige virkninger på migreringsevnen

in vitro

[38], [39], [40]. I tilfælde af Panc-1 og MiaPaCa-2, kan de allerede besidder den glycan-maskiner er nødvendige for en forbedret migreringsevnen; yderligere omdannelse måske ikke nødvendigt. Dette område af undersøgelsen var også begrænset til to bugspytkirtelkræft cellelinier i meget specifikke

in vitro

betingelser. Fremtidige analyser bruge flere cellelinjer og forskellige metoder til at adskille vandrende fra stationære celler kan give nye resultater.

De funktionelle temaer deles af den inducerede EMT modellen og cellelinje panelet give nogle indsigt i roller glycosylering i EMT . Ændringerne af proteoglycaner og sulfateringsgrupper enzymer antyder vigtigheden af ​​kontrollen med GAG sulfatering i EMT. Dette fund er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser ændringer i matrixkomponenter såsom versican [41] og ændringer til GAG sulfatering [42] i forbindelse med kræft, især i aggressive former for kræft. De kræft-fremme funktioner versican kan virke gennem regulering af vækst faktor aktivitet og ved at interagere med immun- og stromale celler [43], funktioner, der kunne ændres ved ændringer i sulfatering. SPOCK1 kan fungere gennem lignende mekanismer, men er mindre godt undersøgt. SULF2, som var stærkt opreguleret i begge systemer og virker til at fjerne sulfater fra visse GAG ​​kæder, også har været forbundet med lunge carcinogenese [44] og tumorgenicitet af bugspytkirtelkræftceller [45]. Kræft-fremmende funktioner SULF2 synes at arbejde gennem aktivering Wnt signalering eller frigive vækstfaktorer fra den ekstracellulære matrix, som også kan have en pro-angiogen virkning. Foreningen af ​​disse funktioner med kræft EMT antyder, at cancerceller gennemgår EMT bruge en renovering af det ekstracellulære rum til at blive meget invasiv.