PLoS ONE: Perifere Immune Cell genekspression Ændringer i Advanced ikke-småcellet lungekræft Patienter behandlet med første linje Kombination Chemotherapy

Abstrakt

Introduktion

Stigende beviser har vist, at immun overvågning er kompromitteret i en tumor-fremmende mikromiljø for patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), og kan gendannes ved passende kemoterapi.

Metoder

for at teste denne hypotese, vi analyserede microarray genekspression profiler af perifere mononukleære blodceller fra 30 patienter med nydiagnosticeret fremskredent stadium NSCLC, og 20 alders-, køns- og co-morbiditet-matchede raske kontrolpersoner. Alle patienter fik en median på fire kurser af kemoterapi med cisplatin og gemcitabin for en 28-dages cyklus som første linje behandling.

Resultater

Sixty-ni differentielt udtrykte gener mellem patienter og kontroller , og 59 differentielt udtrykte gener før og efter kemoterapi blev identificeret.

IL4

sti var signifikant beriget med både tumor progression og kemoterapi signaturer.

CXCR4

IL2RG

blev nedreguleret, mens

DOK2

og

S100A15

var opreguleret i patienterne, og udtryk for alle fire gener helt eller delvist blev vendt efter kemoterapi. Real-time kvantitativ RT-PCR for fire opreguleret (

S100A15, DOK2

) og nedreguleret (

TLR7, TOP1MT

) gener i patienterne, og de seks opreguleret (

TLR7, CRISP3, TOP1MT

) og nedreguleret (

S100A15, DOK2, IL2RG

) gener efter kemoterapi bekræftede gyldigheden af ​​microarray resultater. Yderligere immunhistokemisk analyse af paraffinindlejrede lungekræft væv identificerede stærk S100A15 kernefarvning ikke kun i trin IV NSCLC sammenlignet med trin IIIB NSCLC (p = 0,005), men også hos patienter med stabil eller progressiv sygdom sammenlignet med dem med en delvis respons (p = 0,032). En høj procentdel af S100A15 nukleare farvede celler (HR 1,028, p = 0,01) var den eneste uafhængige faktor i forbindelse med tre-årig samlede dødelighed.

Konklusioner

Vores resultater tyder på en potentiel rolle

IL4

vej hos immun overvågning af fremskreden NSCLC, og immun forstærkning af kombinationskemoterapi. S100A15 kan tjene som en potentiel biomarkør for tumor staging, og en prædiktor for dårlig prognose i NSCLC

Henvisning:. Chen Y-C, Hsiao C-C, Chen K-D, Hung Y-C, Wu C-Y, Lie C-H, et al. (2013) Perifere Immune Cell Gene Expression Ændringer i Avancerede ikke-småcellet lungekræft Patienter behandlet med første linje kombinationskemoterapi. PLoS ONE 8 (2): e57053. doi: 10,1371 /journal.pone.0057053

Redaktør: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 14. august 2012; Accepteret: 16 Januar 2013; Publiceret: 25 feb 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling (CCMP96-RD-202) fra Udvalget om kinesisk medicin og Farmaci af Department of Health, Executive Yuan, Taiwan, og også delvist understøttet af tilskud fra Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG891301 til KD Chen, og CMRPG881031 til YC Chen). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) er den mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. Den gennemsnitlige 5-års overlevelse er mindre end 15%, hvilket er stort set uændret i de sidste tre årtier. Hovedparten af ​​NSCLC patienter til stede med fremskreden sygdom på diagnosetidspunktet, og dem diagnosticeret med tidlig fase sygdom oplever ofte tilbagefald og metastatisk sygdom [1], [2], [3].

Host immunceller mægle immun overvågning af udrydde aberrerende celler, og dette er kompromitteret i en tumorfremmende mikromiljø for mange patienter med lungecancer. Adskillige immundefekter, herunder et skift mod type 2 hjælper-T-(Th2) fænotype, er tydelige i patienter med lungecancer [4], [5]. Imidlertid kan de samme immunceller fremme tumorvækst og metastase gennem angiogenese og invasion af den ekstracellulære matrix [6], [7]. Forståelse af de grundlæggende molekylære processer, der forårsager disse fejl ville give mulighed for at udvikle innovative behandlinger. Desuden immune celle responser monteret ved forskellige histopatologiske typer og tumor stadier af lungekræft kan være forskellige; imidlertid undersøgelser af dette spørgsmål mangler.

Adskillige immunosuppressive molekyler produceres af tumorer, såsom interleukin-10 (IL-10), transformerende vækstfaktor-beta (TGF-β), eller cyclooxygenase-2 ( COX-2) metabolitter; dog kan særlige terapier, såsom kemoterapi og strålebehandling bidrage til ændringen af ​​immunsystemets funktion [4], [6], [8]. Stigende bevis foreslår, at en facet af immun-overvågning kan genoprettes ved passende kemoterapeutiske stoffer. For eksempel har nucleosidanalogen gemcitabin (GEM) blevet vist at selektivt forøge immunresponset adaptive og fremme cellemedieret immunrespons over humorale immunrespons i tillæg til konventionelle apoptotiske virkninger [9] – [12]. Derudover platinbaseret middel, cisplatin (CDDP), har vist sig at forøge antitumor-virkninger af cytotoksisk T-lymfocyt-medieret immunterapi [13]. Det er også blevet påvist, at brug af platinbaseret dobbelt kemoterapi giver en betydelig fordel i form af tumor respons og overlevelse sammenlignet med en enkelt-agent regime [14]. Den underliggende mekanisme for immun forstærkning for kombinationskemoterapi er stort set ukendt.

Formålet med denne undersøgelse var at forbedre forståelsen af ​​de molekylære mekanismer, der regulerer immunosurveillance eller tumor progression i de immunceller af patienter med fremskreden NSCLC af undersøge udtrykkene for gener i mononukleære blodceller (PBMC) fra perifert der kan være involveret i disse virkninger. Vi antager, at genet udtryk for PBMC involveret i immunresponset på fremskredent stadium NSCLC ville være markant forskellige fra dem i raske forsøgspersoner, og at yderligere forskelle ville blive set mellem kræftpatienter med adenocarcinom (AC) og pladecellekræft (SCC), eller mellem trin III B og IV. Desuden er vi til formål at forbedre forståelsen af ​​de molekylære mekanismer, der regulerer immunpotentiering induceret af kombinationskemoterapi med CDDP og GEM, med håbet om, at nye gener kan vise sig at være over- eller under-udtrykt efter behandling, hvilket giver ny indsigt i at forbedre effekten af ​​kemoterapi

En række undersøgelser har anvendt mikromatrice teknologi til at undersøge gen udtryk i patienter med NSCLC [15] -. [24]. I en af ​​disse undersøgelser, som fokuserede på gen udtryk i blodet leukocytter snarere end tumorvæv blev fundet 29 gener, der skal ændres hos patienter med tidlige fase NSCLC sammenlignet med dem med ikke-maligne lungesygdomme. I hvilket omfang de leukocyt gener spiller en rolle i avanceret NSCLC, og virkningerne af histopatologi og tumor stadie på gen-signaturer er uklare [23]. Derfor har vi udvidet vores undersøgelse fremskredent NSCLC ved at analysere hele-genom genekspressionsprofiler i PBMC fra patienter med nydiagnosticeret fremskreden NSCLC og histopatologi af enten AC eller SCC. Desuden at etablere en direkte forbindelse mellem genekspression og kemoterapi, efterbehandling PBMC fra 17 patienter, der fik mindst fire kurser af kombinationskemoterapi med CDDP og GEM blev opnået, og virkningerne af kemoterapi på den globale genekspression profiler blev evalueret ved hjælp af microarray analyse.

Materialer og metoder

undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board of Chung Gung Memorial Hospital, Taiwan. Undersøgelsens deltagere blev rekrutteret fra den pulmonale klinikker og sundhed undersøgelse centrum af Kaohsiung Chung Gung Memorial Hospital i perioden fra august 2007 til januar 2009. Alle de inkluderede patienter var i alderen 18 år eller ældre med histologisk bekræftet, nydiagnosticeret, ubehandlet, trin IIIB eller IV NSCLC, med en eller flere målbare (unidimensional) læsion med en diameter på 10 mm eller større, målt ved hjælp af edb-tomografi, histopatologisk undertype af AC eller SCC, og et østligt Cooperative Oncology Group performance status på 0, 1 eller 2. Hver tumor blev diagnosticeret i henhold til den histopatologiske subtype og kvalitet af en patolog. Klinisk fase blev bedømt i henhold til den Internationale Union Against Cancer (UICC) Tumor Knude Metastase klassifikation (6

udgave, 2002). I alt 42 patienter med lungekræft blev screenet for støtteberettigelse indskrivning. Patienter med første linje behandlingsregimer andet end CDDP og GEM kombinationskemoterapi (4 patienter), der modtager samtidig strålebehandling (2 patienter), alvorlig ukontrolleret medicinsk eller psykiatrisk sygdom (1 patient), historie af anden malignitet inden for de sidste 5 år (1 patient ), og nægter at give en blodprøve for undersøgelsen (4 patienter) blev udelukket. Tredive patienter afsluttet opfølgning og indgik til endelig analyse. Alle 30 patienter fik første linje kemoterapi med CDDP (gennemsnitlig dosis 70 mg /m2) på dag 1 plus GEM (Gemzar®, Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, betyde dosis 1000 mg /m2) på dag 1, 8 og 15 af en 28-dages cyklus. Behandlingen var planlagt i højst seks cyklusser (median 4, interval 1-6), medmindre den blev afbrudt på grund af progressiv sygdom, stabil sygdom, uacceptabel toksicitet, eller død. Efter baseline vurdering blev tumorrespons vurderet en uge efter den sidste dosis i henhold til de svar evalueringskriterier i solide tumorer. En komplet respons (CR) blev defineret som den fuldstændig forsvinden af ​​alle tegn på sygdom. En partielt respons (PR) blev defineret som en reduktion på mindst 30% af den største diameter af hvert mål læsion, uden fremkomsten af ​​nye læsioner. Progression blev defineret som en stigning på mindst 20% af den største diameter af hvert mål læsion, eller udseendet af en eller flere nye læsioner. Samlet overlevelse blev defineret som tiden fra diagnose til død uanset årsag i 3-års follow-up periode. Tyve raske forsøgspersoner uden en historie af malignitet inden for de seneste 5 år eller seneste infektionssygdom blev indskrevet som kontrolgruppen.

Processer RNA Isolation og cRNA Synthesis

Perifer fuldblod (15 ml) blev opsamlet efter informeret samtykke var blevet indhentet fra de 30 patienter med nydiagnosticeret histopatologisk bekræftet NSCLC, og 20 alders-, køns- og co-morbiditet-matchede raske kontrolpersoner (HC). Yderligere 15 ml blod blev opsamlet igen en uge efter den sidste dosis af CDDP og GEM fra de 17 patienter, som gennemførte mindst fire kurser af kombinationskemoterapi. PBMC blev isoleret ved Ficoll-Hypaque gradientcentrifugering (Histopaque®-119, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO USA) inden 90 min for at trække blod, vasket i PBS og derefter opbevaret i RNAlater (Ambion Inc. , Austin, TX, USA) ved -80 ° C indtil RNA-isolering. En RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) blev anvendt til isolering af høj kvalitet total RNA, og behandles med DNase ifølge producentens protokol. RNA blev derefter elueret i RNase-frit vand. Prøver blev kørt på en RNA 6000 Nano Gel System (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, USA) under anvendelse af en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent) at bestemme kvaliteten af ​​RNA, og 2 ul RNA blev anvendt til at bestemme koncentrationen af ​​RNA ved hjælp af en NanoDrap spektrofotometer (Thermo Science, Wilmington, DE, USA). Kun prøver med A260 /A280-forhold på 1,9 til 2.1 blev anvendt til yderligere analyse. I alt 300 ng RNA blev anvendt til syntese af første streng cDNA og in vitro transkription af cRNA ved anvendelse af et Illumina Totalprep RNA-amplifikation kit (Ambion, Inc.).

genekspressionsprofilering og Microarray Data Analysis

Illumina (San Diego, CA) HumanRef-8v2 perle mikroarrays blev anvendt med 750 ng mærket cRNA for hver prøve ifølge fabrikantens protokol. Menneskelig Ref-8 version 2 arrays består af 22,184 sonder repræsenterer 18,189 unikke menneskelige gener på en otte-strimmel format array. Alle udtryk datasæt er blevet deponeret i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) med tiltrædelse nummer GSE39345. Statistisk analyse af microarray data blev udført under anvendelse GeneSpring software version 11 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). For at gøre udtrykket værdier uafhængig af spot intensitet og placering, en yderligere per gen normalisering blev påført den præ-normaliserede data inden for hver opstilling ved at dividere de rå data ved medianen af ​​ekspressionsniveauet for genet i prøver fra raske personer. Rå data genereret efter scanning af mikroarrays med baggrund korrigeret blev indlæst fra Illumina s Beadstudio Expression modul til Genespring GX. Dette trin blev efterfulgt af fraktil normalisering og log2 transformation. En probe sæt filter blev anvendt til at fjerne gener, der ikke detekteres pålideligt. Samlet set 22150 sonder af de samlede 22184 sonder (99,8%) viste, hvor mindst 1 ud af 67 prøver var blevet markeret i P (til stede) eller M (marginal) flag i forhold til baggrundsniveauet. En ikke-parametrisk U-test for uparrede sammenligninger af de to uafhængige grupper eller Wilcoxon signed rank test for at sammenligne genekspressionsniveauer før og efter kemoterapi blev påført. Vi brugte Benjamini-Hochberg falsk-discovery sats (FDR) korrektion metode at styre for falske positiver og en korrigeret p-værdi cutoff på 0,05 blev anvendt til at vælge det sæt af markant op- og ned-regulerede gener med den laveste FDR. De gen-sæt blev derefter inddelt i funktionelle kategorier efter den Gene ontologi biologiske processer Klassifikation. Den vej berigningsproces blev brugt til at identificere de funktioner fra væsentligt ændrede delmængder af gener blandt fænotypiske grupper og finde direkte relationer mellem gener af interesse. Dette blev udført i GeneSpring softwaren med “enkel og direkte interaktion” algoritme. De oplysninger, der anvendes af algoritmen blev opnået fra PubMed litteratur ved hjælp Natural Language Processing algoritmer til at søge søgeord og relationer i abstracts. Hierarkisk klyngedannelse analyse blev udført ved klyngedannelse og træ-building programmer, baseret på de filtrerede gener, der opfyldte de statistiske kriterier, ved hjælp af den sekskantede boble metode.

Verifikation af Gene Expressions hjælp TaqMan Kvantificering Real-time revers transkriptase-polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

for at bekræfte ekspressionsmønstre for visse kandidatgener blev udtryk analyseret under anvendelse af RT-PCR i et 32-brønds format. For hvert gen af ​​interesse, blev en enkelt RT-PCR-reaktion udføres på samme RNA-prøve af PBMC fra cancerpatienter (N = 30) og HC (N = 20). Parlamentet holde gen Humant surt ribosomale protein (HUPO) blev valgt som en endogen kontrol til at normalisere udtryk data for hvert gen. Alle PCR-primere (vilkårlige hexamerer) og TaqMan prober blev designet og indkøbt fra Roche henhold til selskabets protokoller (www.roche-applied-science.com), og deres sekvenser er angivet i tabel S1, der er offentliggjort som underbyggende oplysninger på PLoS One hjemmeside. Kort fortalt blev to trin kvantitativ RT-PCR udført. Første streng cDNA blev syntetiseret ud fra 5 ug af RNA under anvendelse af et LightCyclerTaqManMaster kit (Roche, Tyskland). PCR-reaktionerne blev kørt i en Roche Light Cycle 2.0 maskine. Single real time PCR forsøg blev udført på hver prøve for hver målgen, fordi Roch Light Cycler systemet har vist høj reproducerbarhed ved anvendelse fortrinlig termisk kontrol og probe detektion format (https://www.roche-applied-science.com/sis /rtpcr/LCNano/index.jsp?id=LCNano_100000). Relative ekspressionsniveauer blev beregnet ved hjælp af den ΔΔCq metoden med medianværdien for HC gruppen som kalibratoren, som det var tilfældet med microarray data [25].

Immunhistokemi (IHC) Farvning af lungekræft væv for S100A15

Tissue paraffinsnit blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret gennem graduerede ethanolopløsninger til destilleret vand, og derefter vasket i Tris-bufret saltvand. Antigen genfinding blev udført ved opvarmning sektioner i 10 mM natriumcitrat i 10 min i en mikrobølgeovn. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset ved inkubation i 3% H

2O

2 i methanol i 5 minutter. Ikke-specifikke bindingssteder blev blokeret ved anvendelse af Protein Block (Dako, Carpinteria, Californien, USA) i 20 min. Vævssnittene blev derefter inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med anti-humant S100 calcium-bindende protein A15 (anti-hS100A15, 1:5000; en gave fra Stuart H. Yuspa, Laboratoriet for Cancer Biology og Genetik Center for Cancer Research, National cancer Institute, USA) natten over, efterfulgt af 30 minutters-inkubation med gede-anti-muse-IgG konjugeret til peberrodsperoxidase-mærket polymer (Envision + System; DakoCytomation, Carpinteria, Californien, USA). Objektglas blev udviklet i 5 min med 3,3′-diaminobenzidin kromogen og modfarvet med hæmatoxylin. I den negative kontrol vævssnit, blev det primære antistof erstattet af isotype specifik ikke-immun muse-IgG.

Evaluering af immunhistokemisk farvning for S100A15

Hver slide blev evalueret for S100A15 immunfarvning ved hjælp af en semi- kvantitativ pointsystemet for både farvningsintensitet og procentdelen af ​​positive tumor /pulmonale epitelceller. IHC farvning oversigt blev udført af en uafhængig uddannet læser (TYW), som blev blindet til det kliniske resultat, tumor stadie, og histopatologi. Vævssnittene blev bedømt ved manuelt at tælle ≥ 1000 celler baseret på procentdelen af ​​immunofarvede celler som: 0-10% = 0; 10-30% = 1; 30-50% = 2; 50-70% = 3 og 70-100% = 4. Sektioner blev også scoret semikvantitativt på basis af farvningsintensitet som negativ = 0; milde = 1; moderate = 2; og intens = 3. En samlet score blev opnået ved at tilføje snesevis af procentvise positivitet og farvning intensitet, med nukleare og cytoplasmatisk farvning scorede uafhængigt [26].

Statistisk analyse

Kontinuerlig værdier blev præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Mann-Whitney, Wilcoxon rangeret sum, Kruskal-Wallis H, og chi-square tests blev anvendt til at vurdere forskellene mellem forskellige grupper i givet fald. Pearson korrelation test blev anvendt til at vurdere sammenhængen imellem to kontinuerlige variabler. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere den samlede overlevelse, og Cox regressionsanalyse med trinvis fremad selektion blev anvendt til at evaluere uafhængige prognostiske faktorer forbundet med overlevelse. Alle tests var tosidet og nulhypotesen blev afvist ved p 0,05. En statistisk programpakke (SPSS version 15.0, SPSS Inc., Chicago, IL) blev anvendt til alle analyser.

Resultater

Microarrays fra de 50 emner, bestået kvalitetskontrol filtre var inkluderet i denne undersøgelse. De demografiske og kliniske data for disse emner (30 patienter med fremskreden NSCLC og 20 HC), er vist i tabel blev observeret 1. Ingen signifikante forskelle mellem patienterne og HC med hensyn til alder, køn, co-morbiditet, og rygevaner . De kræftpatienter omfattede 9 stadie IIIB AC, 12 trin IV AC, 5 trin IIIB SCC, og 4 stadie IV SCC.

differentielt udtrykte gener i PBMC associeret med Tumor Progression

Fra de 22,150 sonder, 4463 (20,16%) udskrifter blev differentielt udtrykt mellem patientgruppe og HC-gruppe ved hjælp af en Mann-Whitney uparret test med en Benjamini-Hochberg FDR af 0,05. For scenen-afhængige ændringer i mRNA-ekspression niveauer fra patienter i fase III B og IV sammenligne med HC gruppe, en Kruskal-Wallis test med Benjamini-Hochberg FDR af 0,05 ved en samtidig stigning 1,5 gange blev anvendt, og 3989 differentielt udtrykte udskrifter blev identificeret. Desuden 3858 af disse transkripter gennemskåret med dem, der findes i Mann-Whitney-test. Brug af funktionelle pathway kategorier af GeneSpring pathway analyseværktøjet som kriterierne for yderligere validering udvælgelse, blev 3858 gen sæt derefter analyseret for funktionel anmærkning på vejen niveau. Elleve statistisk forskellige funktionelle kategorier blev kortlagt, og 70 gen udskrifter (69 unikke gener) er involveret i sekretion, DNA topoisomerase aktivitet, methyltransferaseaktivitet, histonacetyltransferase aktivitet, vækstfaktor aktivitet, protein tyrosinphosphataseaktivitet, membran lipid metaboliske proces, medfødte immunrespons , celleadhæsionsmolekyle binding, metalloendopeptidase inhibitor aktivitet og cytokin /kemokinmedieret signalveje blev identificeret som formodede underskrifter disse funktioner (tabel S2).

differentielt udtrykte gener i PBMC efter kombinationskemoterapi med CDDP og GEM i Cancer patienter

for at vurdere virkningerne af kemoterapi på perifere immunceller, blev genekspression profiler i de sytten patienter, som gennemførte mindst fire kurser af CDDP og GEM behandling sammenlignet før og efter kemoterapi ved hjælp Mann-Whitney U test for parrede observationer (p 0,05), og differentieret udtryk for 3576 udskrifter blev identificeret. Derudover blev der i alt 669 udskrifter gennemskåret mellem differentielt udtrykte udskrifter i parrede fald på kemoterapi og 3858 udskrifter identificeret med kræft /iscenesættelse specificitet. Brug vejen analyseværktøjet i GeneSpring GX blev ni funktionelle kategorier kortlagt, og 62 gentranskripter (59 unikke gener), der involverer medfødte immunforsvar, cytokinproduktion, mikrotubuli-baseret proces, organisk kation transmembrane transporter aktivitet, sekretoriske bane, DNA-topoisomerase (ATP -hydrolyzing) aktivitet, histon methyltransferase aktivitet, histonacetyltransferase aktivitet, og protein tyrosinphosphataseaktivitet blev identificeret fra dette sæt af 669 gentranskripter (tabel S3). Seks gener med højere udtryk med tumor progression viste endnu højere udtryk efter kemoterapi:

Cystein-rige sekretorisk protein 3

(

CRISP3

, medfødte immunrespons protein),

signal transducer og aktivator af transskription 1 Hotel (

STAT1

, cytokin og vækstfaktor receptor signalering mediator),

opløst stof carrier familie 22 medlem 4

(

SLC22A4

; ergothionein transporter),

synapsin II, afskrift variant IIa

(

SYN2

, synaptisk transmission),

Brain neurotrofisk faktor

(

BDNF

; vækstfaktor for overlevelse og differentiering af neuroner og synaptisk transmission),

Kalium stor ledningsevne calcium-aktiverede kanal, underfamilie M, alpha medlem 1 Hotel (

KCNMA1

, synaptisk transmission, cellecyklus, og celle migration). Især

S100A15

(også kaldet

S100A7A;

epidermal modning og antimikrobielt forsvar) var opreguleret med tumor progression og vendes til normal efter kemoterapi

Interleukin 4 (IL4. ) Pathway

Vi fandt 69 gener at være signifikant forskelligt udtrykt mellem patienter og raske kontroller og 59 gener udtrykkes forskelligt efter kemoterapi. For at undersøge om de gener, differentielt blev udtrykt i fremskredent stadium NSCLC og med kemoterapi i fælles veje, vi studerede deres konnektivitet ved hjælp af GeneSpring pathway analyse værktøj.

IL4

sti var signifikant beriget i begge underskrifter tumor progression og kemoterapi. Blandt de 49 gener involveret i IL4-vejen, blev 11 unikke gener (12 gentranskripter) differentielt udtrykt mellem patienter og normale kontroller, og 16 unikke gener (19 gentranskripter) blev differentielt udtrykt før og efter kemoterapi. Skæringspunktet mellem begge sammenligninger resulterede i 7 unikke gener (figur 1 og tabel 2). Især

chemokin CXC motiv receptor 4

(

CXCR4

; 7-transmembrane G-protein-kemokinreceptor for

CXCL12

) var opreguleret, og

docking protein 2 Hotel (

DOK2

; underlaget af chmeric p210BCR /abl oncoprotein) og

interleukin 2 receptoren, gamma

(

IL2RG

; interleukin receptor fælles gamma kæde til

IL2, IL4, IL7, IL9, IL15

, og

IL21

) blev nedreguleret med tumorprogression, mens udtryk for disse tre gener ændret i den modsatte retning efter kemoterapi. På den anden side,

Phospholipase C, gamma 1

(

PLCG1

; guaninnukleotid udveksling faktor for nuklear GTPase),

phosphoinositid-3-kinase, katalytisk, delta polypeptid

(

PIK3CD;

autophosphorylering aktivitet), og

protein kinase C, zeta

(

PRKCZ

; atypisk isozym af serin-threonin protein kinase C), som viste, faldt udtryk med tumor progression blev yderligere nedreguleret med kemoterapi, mens

STAT1

der viste en øget udtryk med tumor progression blev yderligere opreguleret med kemoterapi.

Elleve ud af 49

IL4

pathway-involveret gener blev kortlagt i vejen berigelse analyse for de 3.858 differentielt udtrykte udskrifter i PBMC blandt patienter med fremskreden ikke-små ell lungekræft (NSCLC) og normale kontroller, mens 16 unikke gener blev kortlagt for de 669 differentielt udtrykte udskrifter i PBMC fra patienter med fremskreden fase NSCLC før og efter kemoterapi. Syv gennemskåret gener mellem de to gen-sæt blev identificeret og præsenteret i en Venn-diagram. Den blå cirkel angiver differentielt udtrykt gener forbundet med tumor progression alene, den røde cirkel med kemoterapi alene, og den lilla cirkel med begge effekter.

Tydelige Expression mønstre Across Tumor Stages og Histopatologiske undertyper

for yderligere at klarlægge effekten af ​​både tumor stadie og histopatologiske undertyper af genet underskrifter PBMC blev differentielt udtrykte gener grupperet ved hjælp af en hierarkisk klyngedannelse algoritme med en gennemsnitlig-kobling metode og euklidisk afstand metriske i Genespring GX. Figur 2 viser todimensional hierarkisk gruppering af alle patienter og HC cancer baseret på de 73 gener, der blev udtrykkes forskelligt blandt scenen IIIB AC, trin IV AC, fase III B SCC, stadie IV SCC, og HC. Cluster 0 var præget af høje udtryk i fase IIIB AC, trin IV AC, fase III B SCC, og en lignende udtryk i stadie IV SCC sammenlignet med HC, med et højdepunkt udtryk i stadie IV AC. Dette mønster blev set i 19 af de 73 gener. Cluster 1 blev kendetegnet ved høje udtryk i fase IIIB AC, trin IV AC, fase III B SCC, og trin IV SCC sammenlignet med HC, og en lav udtryk i trin IIIB SCC alene sammenlignet med stadie IV AC, med et højdepunkt udtryk i stadie IV AC. Dette mønster blev set i 16 af de 73 gener. Cluster 2 blev kendetegnet ved høje udtryk i stadie IIIB, trin IV AC, og trin IV SCC, og en lignende udtryk i trin IIIB SCC sammenlignet med HC. Dette mønster var den mest almindelige og set i 20 af de 73 gener. Klynge 3 blev også karakteriseret ved høje udtryk i trin III B, trin IV AC, og trin IV SCC, og en lignende ekspression i trin IIIB SCC sammenlignet med HC, men en højere intensitet af relativ genekspression i hvert gen sammenlignes med den i klynge 2. Dette mønster blev set i 18 af de 73 gener (tabel S4). Blandt disse 73 gener, ti overlappede med de 69 gener identificeret i sammenligningen mellem fase IIIB /IV kræftpatienter og raske kontrolpersoner:

transformerende vækstfaktor beta 2

(

TGFB2

; modulation af proliferativ aktivitet, cellulær differentiering og embryologisk udvikling),

Inhibin beta E

(

INHBE

; apoptotiske funktion),

Trombocyt faktor 4

(

PF4;

regulering af leukocytter menneskehandel),

v-kit Hardy-Zuckerman 4 katte sarkom viral onkogen homolog

(

kIT;

hæmatopoietisk vedligeholdelse, vækst og differentiering),

proteintyrosinphosphatase receptortype N Hotel (

PTPRN,

hormon og neuropeptid sekretion),

Phospholipid scramblase 4

(

PLSCR4;

transbilayer bevægelse af fosfolipider over plasmamembranen),

integrin beta 8 Hotel (

ITGB8;

TGF-beta-aktivering),

S100A15

,

Supplere komponent 1 q underkomponent C kæde Hotel (

C1QC;

udløser supplement klassiske vej og forstærke fagocytose), og

CRISP3

.

(A) Hierarkisk gruppering af patienter med nydiagnosticeret fremskredne ikke-småcellet lungecancer (n = 30) og raske kontroller (n = 20) i henhold til udtrykket af de 69 gener udtrykkes forskelligt blandt stadie IIIB adenocarcinom (AC), fase IV AC, fase III B pladecellekræft (SCC), stadie IV SCC, og raske kontroller (HC). Dataene er præsenteret i en matrix format: Hver række repræsenterer et gen på mikroarrayet og hver søjle en undergruppe af mRNA prøver. Forholdene mellem hybridisering af fluorescerende cDNA-prober var et mål for relativ genekspression i hver forsøgsgruppe prøve til et mRNA prøve reference, og er afbildet efter følgende farveskala: rød indikerer et højt niveau af ekspression; blå, lavt niveau af udtryk; og gul, betyder ekspressionsniveau. (B) Normaliseret median genekspression værdier for cluster 0-3 gener i fem emnekategorier (stadie IIIB AC, fase III B SCC, trin IV AC, stadie IV SCC, HC). Bemærk at klynge 1-gener viste højere udtryk i alle lungecancerpatienter forhold til HC. Cluster 0 gener viste lignende udtryk i stadie IV SCC og HC. Både klynge 2 og 3 gener viste lignende udtryk i trin IIIB SCC og HC. De box plots viser 25

th, 50

th, og 75

th percentiler, maksimum, og minimum.

Bekræftelse af microarray resultater ved hjælp af TaqMan Real-time RT -PCR

for at bekræfte resultaterne med mikroarrays blev ekspressionsniveauerne af seks af de differentielt udtrykte gener med hensyn til fremskreden lungekræft eller kemoterapi behandling vurderet af en uafhængig metode af RNA kvantificering, TaqMan real- RT-PCR, ved anvendelse af de samme RNA-prøver, der blev anvendt til microarray analyse. Sammenligninger af de relative ekspressionsniveauer ved real-time kvantitativ RT-PCR for de 4 gener, der var opreguleret (

S100A15

, p = 0,001, figur 3A;

DOK2

, s 0,001 , figur 3B) eller nedreguleret (

toll-like receptor 7

(

TLR7

, medfødte immunitet), s 0,001, figur 3C;

topoisomerase I mitokondrie

(