PLoS ONE: BPR1K653, en roman Aurora-hæmmer, Udviser potent anti-proliferativ aktivitet i MDR1 (P-gp170) -medieret multiresistente Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Over-ekspressionen af ​​Aurora-kinaser fremmer tumorigenese af celler. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme den prækliniske profil af et hidtil ukendt pan-Aurora kinase inhibitor, BPR1K653, som kandidat til anticancerterapi. Siden udtryk af lægemidlet efflukspumpen, MDR1 nedsættelse af effektiviteten af ​​forskellige kemoterapeutiske forbindelser i menneskelige kræftformer, denne undersøgelse også til formål at afgøre, om styrken af ​​BPR1K653 kunne påvirkes af ekspression af MDR1 i kræftceller.

vigtigste resultater

BPR1K653 specifikt hæmmede aktiviteten af ​​Aurora-A og Aurora-B-kinase ved lave nano-molær koncentrationer

in vitro

. Anti-proliferative aktivitet af BPR1K653 blev evalueret i forskellige humane cancercellelinier. Resultater af klonogene assay viste, at BPR1K653 var potent til målretning forskellige cancercellelinier uanset vævsoprindelse, p53 status, eller ekspression af MDR1. På celleniveau, BPR1K653 induceret endo-replikation og efterfølgende apoptose i både MDR1-negative og MDR1-positive cancerceller. Vigtigere, det viste kraftig aktivitet mod vækst af xenograft tumorer i humane cervical carcinoma KB og KB-afledte MDR1-positive KB-VIN10 celler i nøgne mus. Endelig BPR1K653 udstillede også gunstige farmakokinetiske egenskaber hos rotter.

Konklusioner og betydning

BPR1K653 er en ny potent anti-cancer sammensatte, og dets styrke er ikke påvirket af ekspressionen af ​​det blandingsmisbrug resistente protein, MDR1, i cancerceller. Derfor BPR1K653 er en lovende anti-cancer stof, der har potentiale til forvaltning af forskellige maligniteter, især for patienter med MDR1-relateret modstand stof efter langvarig kemoterapeutiske behandlinger

Henvisning:. Cheung CHA, Lin WH, Hsu JT -A, Hour TC, Yeh TK, Ko S, et al. (2011) BPR1K653, en roman Aurora-hæmmer, Udviser potent anti-proliferativ aktivitet i MDR1 (P-gp170) -medieret multiresistente cancerceller. PLoS ONE 6 (8): e23485. doi: 10,1371 /journal.pone.0023485

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: 13 juni, 2011; Accepteret: 18 Juli 2011; Udgivet: 24 August, 2011

Copyright: © 2011 Cheung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra National Science Council (NSC99-2323-B-400-006, NSC99-2323-B-400-007, NSC99-2120-M-006 til 005), Department of Health (DOH99-TD-C -111-004), og National Health Research Institutes (CA-099-PP-02), Taiwan ROC De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mitose er et vigtigt skridt i celle cyklus, der er stramt reguleret af mange proteiner. Unormal ekspression eller aktivering af disse regulerende proteiner kan resultere i afvigende mitose, hvilket fører til udviklingen af ​​cancere [1], [2]. På molekylært niveau, Aurora kinaser (Aurora-A, Aurora-B og Aurora-C) er serin /threonin-kinaser, der fungerer som centrale regulatorer af mitose. Under normale fysiologiske betingelser, de er afgørende for spindel samling, centrosom modning, kromosomal segregation og cytokinese [3], [4]. Under patologiske tilstande, er det blevet påvist, at Aurora kinaser overeksprimeres i forskellige humane cancere og også spillede en vigtig rolle i processen med tumorigenese [5], [6], [7], [8]. For eksempel er Aurora-A kinase overudtrykt i øvre gastrointestinale adenocarcinomer [6]. Derudover har en korrelation mellem Aurora-A ekspressionsniveauer og tumorprogression blevet påvist i patienter med hoved- og hals pladecellecarcinom [9]. På den anden side, Aurora-B kinase er ofte overudtrykkes i primære NSCLC og maligne gliomer, især glioblastomer [10], [11]. Da overekspression af Aurora-A og Aurora-B er ofte forbundet med tumorigenese, er disse molekyler er målrettet til cancerterapi. Den første proof-of-concept pan-Aurora kinase inhibitor, VX-680 (MK-0457, Tozasertib), blev udviklet i 2004 af Vertex Pharmaceuticals (i samarbejde med Merck) med det formål at målrette kræftceller. Denne specifikke inhibitor har vist effektiv i at målrette kræftceller både

in vitro

in vivo

, og har modtaget godkendelse fra de amerikanske sundhedsmyndigheder (FDA) for at indtaste kliniske forsøg [12 ], [13], [14]. Siden da er der foretaget løbende indsats af forskellige farmaceutiske virksomheder i jagten på potentielle Aurora kinase inhibitorer, der udviser bedre terapeutisk profil og specificitet som sammenlignes med den første generation hæmmer, VX680 [15], [16], [17], [18] [19], [20], [21], [22], [23].

på trods af tidlige succeser udviklingen af ​​forskellige Aurora kinase hæmmere, de seneste undersøgelser viser, at effektiviteten af ​​mange af disse udviklede og klinisk testet inhibitorer, herunder VX680, PHA-739.358 og AZD1152, kan blive påvirket af ekspression af multiresistens protein MDR1 (P-gp170) i ​​kræftceller [24], [25]. Faktisk overekspression af MDR1 også griber ind i en bred vifte af forskellige kemoterapeutiske stoffer [2], [26], [27], [28], [29]. For eksempler, udtryk i det transeuropæiske membran narkotika efflukspumpen, MDR1, reducerer følsomheden af ​​cancerceller til paclitaxel, vincristin (anti-mikrotubuli midler), doxorubicin (DNA interkalerende agent), mitoxantron, VP-16 (topoisomerase II-hæmmere) og imatinib (tyrosinkinasehæmmer) [28], [30], [31], [32], [33], [34]. Der har derfor været stor interesse i at identificere nye antikræftmidler forbindelser, der kan overvinde MDR1-relateret modstand og også udviser forbedrede farmakologiske profiler.

I denne undersøgelse et hidtil ukendt pan-Aurora kinase inhibitor titlen BPR1K653 blev udviklet og dets styrke over for forskellige MDR1-negative og MDR1-positive cancerceller blev evalueret. Resultaterne af den aktuelle undersøgelse viser, at i modsætning til de ovenfor nævnte kemoterapeutiske midler, BPR1K653 er effektiv i at målrette både MDR1-negative og -positive kræftceller

in vitro

in vivo

. Desuden BPR1K653 udviser gunstige farmakokinetiske egenskaber

in vivo

.

Resultater

BPR1K653 er en potent og selektiv pan-Aurora kinase inhibitor

I vitro

kinase inhiberingsassay viste, at BPR1K653 (figur 1A) inhiberede aktiviteten af ​​Aurora-A og -B kinase med en IC

50 værdi på 124 nM og 45 nM (figur 1B og tabel 1). Selektivitet BPR1K653 blev derefter evalueret mod forskellige kinaser. BPR1K653 udviste mindre styrke (dvs. IC

50 10 uM) til inhibering af aktiviteten af ​​ALK, CHK1, cMET, EGFR, FLT3, VEGFR1 og VEGFR2 sammenlignet med Aurora-A og Aurora-B kinase (tabel 1). Den cellulære aktivitet af BPR1K653 blev også undersøgt. Aktivering af Aurora-A kinase kræver en auto-phosphorylering på Thr288-rest, hvorimod phosphorylering af Thr232-rest er en vigtig regulerende mekanisme for Aurora-B-aktivering [35], [36]. Her, afslørede Western blot-analyse, at mængden af ​​fosfor-Aurora-A, -B og -C kinase stede i HCT116 cancerceller behandlet med en pan-Aurora kinase inhibitor, VX680 (positiv kontrol), blev reduceret i en koncentrationsafhængig måde (figur 1C). Reduktion af fosfor-histon H3 (Ser10), et direkte substrat for Aurora-B kinase, er almindeligt anvendt som en indikator for Aurora kinase hæmning i celler. Her VX680 også reduceret mængden af ​​fosfor-histon H3 (Ser10) til stede i celler som forventer (figur 1C). I overensstemmelse med disse resultater, BPR1K653 inducerede en koncentrationsafhængig formindskelse i fosfor-Aurora-A, -B og -C kinase i HCT116-celler. HCT116 celler behandlet med BPR1K653 viste også en koncentrationsafhængig reduktion i fosfor-histon H3 (figur 1C).

(A) Kemisk struktur af anti-cancer sammensatte BPR1K653. (B) BPR1K653 inhiberede aktiviteten af ​​både Aurora-A og Aurora-B kinase som afsløret af

in vitro

kinase inhiberingsassay. (C) HCT116 cancerceller blev behandlet med forskellige koncentrationer af BPR1K653 og det kommercielt tilgængelige pan-Aurora kinase inhibitor VX680, og ekspressionen af ​​forskellige proteiner blev analyseret ved Western blotting. Tubulin blev anvendt som den interne kontrol.

BPR1K653 hæmmer udbredelsen af ​​flere humane kræftceller, uanset deres væv oprindelse og p53 status

For at bestemme om BPR1K653 kunne hæmme celleproliferation, blev et panel af 11 forskellige cancercellelinjer behandlet med BPR1K653. Til sammenligning blev celler også behandlet med to velkarakteriserede Aurora kinase-inhibitorer, VX680, og PHA739358. Det er blevet påvist, at tab af p53-funktion inducerer multilægemiddelresistens i nogle typer af cancer [37]. Her resultater klongenicitetsassayet afslørede, at BPR1K653 var effektivt (dvs. IC

50 0,5 uM) mod forskellige typer af cancerceller, herunder lunge (A549), oral (høne-1 og OECM-1) livmoderhalskræft (KB) , colon (HT29), blære (NTUB1) og leukæmi /lymfom (MV4-11 og IM9), uanset deres p53 status (tabel 2). Desuden blev styrken af ​​BPR1K653 vist sig at være højere end den for VX680 og PHA739358 i de fleste af de testede cancercellelinier (tabel 2). IC

50 værdier af VX680 og PHA739358 i forskellige cancer cellelinjer (undtagen i OECM-1 celler) var 2-10 folder højere end BPR1K653. IC

50’erne i VX680 og BPR1K653 var lige i OECM-1 celler. Tilsammen vores resultater viste, at BPR1K653 er i stand til at inhibere proliferationen af ​​forskellige typer af cancerceller, uanset deres væv oprindelse og p53 status.

BPR1K653 er lige så potent til inhibering af væksten af ​​multiple lægemiddelresistens protein (MDR1) udtrykkende cancerceller

Det er blevet bredt vist, at overekspression af MDR1 (P-gp, drug efflux pumpe) inducerer resistens over for forskellige kemoterapeutiske midler. For at bestemme om styrken af ​​BPR1K653 ophæves af MDR1-ekspression i cancerceller, tre multilægemiddelresistente MDR1-udtrykkende cancer cellelinjer, KB-VIN10, KB-S15 og NTU0.017 [2], [38], [39], [ ,,,0],40], blev behandlet med BPR1K653. Som vist i tabel 3, IC

50 værdi BPR1K653 til KB-VIN10 og KB-S15 var de samme som for de parentale MDR1-negative KB-celler. IC

50 af BPR1K653 til KB-VIN10, KB-S15 og KB var 14 nM, 11 nM og 12 nM. Derudover IC

50 værdi BPR1K653 til MDR1-udtrykkende NTU0.017 celler var også tilsvarende til den for de parentale MDR1-negative NTUB1 celler (tabel 3). Tidligere undersøgelser har vist, at Aurora kinase inhibitorer, VX680 og PHA739358, er substrater af MDR1 [24], [25]. Konsekvent, alle vores testede MDR1-udtrykkende cancercellelinier viste krydsresistente over for VX680 og PHA739358 (tabel 3). Desuden er niveauet af MDR1-ekspression korrelerede med niveauet af VX680 /PHA-739.358 resistens i KB-VIN10 og KB-S15 cancerceller (figur 2). For yderligere at bestemme, om styrken af ​​VX680 og PHA739358 i KB-VIN10, KB-S15 og NTU0.017 celler faktisk var påvirket af ekspressionen af ​​MDR1, celler blev co-behandlet med MDR1 modulator (negativ regulator), verapamil, og celle levedygtighed blev bestemt. Her blev verapamil behandling (10 uM) er vist at være i stand til at genoprette /forbedre følsomheden over for både VX680 og PHA739358 i alle de testede MDR1-udtrykkende cancerceller (tabel 3). Imidlertid kunne verapamil behandling ikke yderligere forøge følsomheden til BPR1K653 i begge MDR-negative og MDR1-udtrykkende cancerceller (data ikke vist). På den anden side er det blevet påvist, at en KB afledt VP-16 resistent cancercellelinie, KB-7D, over-udtrykker en anden type af den ATP-afhængige multi-drug efflux protein, MPR1 [41]. Interessant nok IC

50 værdi BPR1K653 til KB-7D var også svarer til de parentale MRP1-negative KB-celler (tabel 3).

Totalt mRNA blev ekstraheret fra celler, og RT-PCR blev udført for at detektere ekspressionen af ​​MDR1 i KB, KB-VIN10 og KB-S15-celler. GAPDH blev anvendt som intern kontrol.

BPR1K653 inducerer endo-replikation i både MDR1-negative og -positive kræftceller

Yderligere eksperimenter blev udført for at bekræfte det anførte, at effektivitet BPR1K653 påvirkes ikke af MDR1-ekspression i celler. Inhibering af Aurora-kinaser inducerer endo-Fordoblelse af celler, hvilket indikerer ved dannelsen af ​​polyploidi [14]. Her resultater af immunfluorescensmikroskopi og flow-cytometri viste klart, at BPR1K653 inducerede dannelsen af ​​polyploidi (populationer 4N) i KB-celler (figur 3A og B, og figur S1A). MDR1-udtrykkende KB-VIN10 celler behandlet med de samme koncentrationer af BPR1K653 som var blevet anvendt til KB-celler også inducerede dannelsen af ​​polyploidi (figur 3A og C, og figur S1A). I modsætning hertil kun VX680 inducerede dannelsen af ​​polyploidi i KB-celler, men ikke i KB-VIN10 celler under samme behandling koncentrationer (figur 3A, B og C). Dog dannes den polyploidi befolkning blev vist i KB-VIN10 celler co-behandlet med 10 pM i MDR-inhibitor, verapamil, og VX680 (figur 3C). Disse resultater er i overensstemmelse med resultaterne af den ovennævnte klonogene assay, at ekspressionen af ​​MDR1 i kræftceller påvirker effektiviteten af ​​VX680 men ikke af BPR1K653.

(A, B og C) KB og KB-VIN10 celler blev behandlet med BPR1K653 og VX680 i 48 timer. (A) Nucleus blev farvet blå med Hoechst farvestof og mikrotubuli var mærket rød med Alexa Fluor®-mærket anti-tubulin antistof. (B og C) Celler blev inkuberet med propidiumiodid og efterfølgende analyseret ved flowcytometri. (D og E) høne-1-celler blev behandlet med BPR1K653 i 48 timer. (D) Nucleus blev farvet blå med Hoechst farvestof. (E) Celler blev inkuberet med propidiumiodid og efterfølgende analyseret ved flowcytometri.

For at bestemme om BPR1K653 også inducerer endo-replikation i andre end KB og dens afledte, HONE-1-celler var cancercellelinier behandlet med BPR1K653 og cellulære indhold blev analyseret ved mikroskopi og flowcytometri. Både immunfluorescensmikroskopi og flowcytometrianalyse viste tydeligt, at BPR1K653 fremmet dannelsen af ​​polyploidi (populationer 4N). I Hone-1 celler i en koncentrationsafhængig måde (figur 3D og E)

BPR1K653 reducerer histon H3 phosphorylering og cyklin B1 udtryk i både MDR1-negative og -positive kræftceller

Western blot-analyse blev udført for at bekræfte, at effektiviteten af ​​BPR1K653 ikke påvirkes af MDR1 udtryk i kræftceller. Histon H3 er en direkte substrat for Aurora-B kinase, og endo-replikerende celler viser sædvanligvis reduktion af ekspressionen af ​​cyclin B1. I dette eksperiment blev inhibering af histon H3 phosphorylering og nedregulering af cyclin B1 ekspression vist i både KB og KB-VIN10 celler behandlet med de samme koncentrationer, 12 (IC

50), 24 (2 × IC

50) og 36 nM (3 × IC

50) af BPR1K653 i en koncentrationsafhængig måde (figur 4A og B). I overensstemmelse med disse resultater, VX680 behandling (dvs. 170 nM og 255 nM) inhiberede også phosphorylering af histon H3 og ekspressionen af ​​cyclin B1 i KB-celler (figur 4A). Imidlertid kunne samme VX680 behandling fremprovokere de ovennævnte molekylære ændringer i MDR1-udtrykkende KB-VIN10 celler. Verapamil behandling (10 uM) blev vist at genoprette følsomheden over for VX680 i KB-VIN10 celler, som indikeret ved en reduktion i Histon H3 phosphorylering og cyclin B1 ekspression (figur 4B).

(A) KB-celler blev behandlet med BPR1K653 og VX680 i 48 timer og ekspression af forskellige proteiner blev bestemt ved Western blot analyse. Relative båndintensiteter blev vist. (B) KB-VIN10 celler blev behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 med /uden verapamil i 48 timer, og ekspression af forskellige proteiner blev bestemt ved Western blot analyse. Relative båndintensiteter blev vist. (C) HONE-1-celler blev behandlet med BPR1K653 i 48 timer, og ekspression af forskellige proteiner blev bestemt ved Western blot analyse. Actin blev anvendt som den interne kontrol.

For at bestemme om BPR1K653 reducerer også histon H3 phosphorylering og cyklin B1 ytringsfrihed i andre end KB og dens afledte, HONE-1 celler kræft cellelinjer blev behandlet med BPR1K653 og intracellulære proteiner blev analyseret ved Western blotting. Western blot-analyse viste klart, at både phosphorylering af histon H3 og ekspression af cyclin B1 var nedsat i BPR1K653-behandlede høne-1-celler (figur 4C).

BPR1K653 inducerer apoptose i både MDR1-negative og -positive kræft celler

Tidligere undersøgelser afslørede, at målretning Aurora kinaser inducerer celle endo-replikation og efterfølgende celle apoptose [14]. For at bestemme om BPR1K653 er i stand til at inducere apoptose i både MDR1-positive og -negativ cancerceller, blev KB og KB-VIN10 celler behandlet med BPR1K653 og apoptotiske egenskaber blev analyseret ved Annexin-V, real-time caspase-3 /-7 aktivitet billedbehandling og TUNEL assays. Her blev både cytoplasmiske volumen og størrelsen af ​​kernen steget i de BPR1K653-behandlede KB og KB-VIN10 celler, hvilket indikerer, at BPR1K653 induceret celle endo-replikation som forventet (figur 5A og C, og figur S1A). Translokation af phosphatidylserin molekyle fra den indre blad af cellemembranen til det ydre membran indikerer forekomsten af ​​tidlig apoptose. Resultater af Annexin-V-assay viste, at BPR1K653 inducerede translokation af phosphatidylserin molekylet i både KB og KB-VIN10 celler, som indikerer den grønne fluorescerende mærke (figur 5A). BPR1K653 også induceret caspase-3 /-7 aktivitet og DNA-fragmentering i både KB og KB-VIN10 celler under samme behandling betingelser (figur 5B, C, D, og ​​figur S1A). I modsætning hertil kun VX680 inducerede translokation af phosphatidylserin molekyle, caspase-3 /-7 aktivitet og DNA-fragmentering i KB-celler og ikke i de MDR1-udtrykkende KB-VIN10 celler (figur 5A, B, C og D). Endvidere spaltning af PARP blev først vist i MDR1-udtrykkende KB-VIN10 celler behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 /verapamil (co-behandling), og ikke med VX680 alene, som det fremgår af western blot-analyse (figur 5E).

(A, B og C) KB og KB-VIN10 celler blev podet på 8-brønds kammerobjektglas natten over. (A) Celler blev behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 i 48 timer. Translokation af phosphatidylserin molekyle i celler blev analyseret ved Annexin-V-FLUOS assay og celler blev set under anvendelse af et UV-aktiveret mikroskop. Generel cellemorfologi blev visualiseret ved fasekontrastmikroskopi. (B) Celler blev behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 i 60 timer og MagicRed ™ -DEVD realtid Caspase-3 /-7 Aktivitet kit (immunokemisystemer Technologies LLC) blev anvendt til at detektere aktiveringen af ​​caspase-3 /-7 i celler som angivet ved den røde fluorescerende emission. Nucleus blev counter-farvet blå af Hoechst 33342, og cellerne blev set i realtid ved hjælp af en UV-aktiveret omvendt mikroskop. (C og D) påvisning af celler med DNA-fragmentering ved TUNEL-assay. KB og KB-VIN10 celler blev behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 i 72 timer. DNA fragmenteringer blev analyseret ved hjælp af TMR-rød

In Situ

Cell Død Detection kit. Nucleus med DNA-fragmentering blev farvet røde. Nucleus blev counter-farvet blå af DAPI. Celler blev analyseret ved en UV-aktiveret mikroskop. (C) Repræsentative billeder blev vist. (D) Mærkede celler blev talt, og procentdelen af ​​apoptotiske celler blev beregnet som følger: Samlet beløb for den røde fluorescerende mærket (DNA fragmenteret) kerne tilgængelig ÷ Samlet beløb for den blå fluorescerende mærket kerne tilgængelig × 100. Forsøg blev gentaget to gange. (E) BPR1K653 inducerer kløvning af PARP i KB-VIN10 cancerceller. KB-VIN10 celler blev behandlet med enten BPR1K653 (2 × IC

50 i KB) eller VX680 (2 × IC

50 i KB) med /uden verapamil i 72 timer. Spaltningen af ​​PARP blev bestemt ved Western blot analyse. Actin blev anvendt som intern kontrol.

BPR1K653 også induceret apoptose i høne-1 celler, som indikeret ved induktion af caspae-3 /-7 aktivitet

in vitro

(figur S1B).

BPR1K653 undertrykker væksten af ​​både humane MDR1-negative og -positive kræft implanteret

in vivo

Selv om de ovennævnte resultater viste, at BPR1K653 udviser potent anti-cancer effekt

in vitro

, blev udført forsøg for at bestemme, om BPR1K653 er også i stand til at hæmme aktiviteten af ​​Aurora-kinaser og væksten i både MDR1-negative /positive tumorer

in vivo

. KB-celler blev dyrket som

s.c.

Tumorer i nøgne mus. Når veletablerede KB xenotransplantater var palpabel med tumorstørrelse på -75 mm

3, mus blev randomiseret i køretøjet kontrol- og behandlingsgrupper med fem dyr i hver. Den behandlede mus fik enten 15 mg /kg BPR1K653 eller 30 mg /kg VX680

i.p.

I 5 dage /uge i 2 sammenhængende uger. Resultater af immunhistokemisk analyse af tumorvævet sektioner viste, at administration af BPR1K653 reduceret mængden af ​​fosfor-histon H3-positive celler til stede i tumorvæv i sammenligning med kontrollen (10% vs. 60%) (figur 6A). Et fald i antallet af tumorvækst i mus behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 5 dage /uge i 2 sammenhængende uger blev også observeret. Der var et fald ~73% i tumor volumen på dag 30 i dyrene behandlet med BPR1K653 (P 0,05). Desuden var der et fald ~68% i tumor volumen på dag 30 i dyrene behandlet med VX680 (P 0,05, figur 6B). BPR1K653 var veltolereret i en dosis på 15 mg /kg uden tegn på toksicitet i KB xenograft tumor model som tabet af kropsvægt efter behandlingen var mindre end 10% i behandlingsgruppen som sammenlignes med kontrolgruppen (figur 6C ). For at bestemme hvorvidt inhibering af tumorvækst i BPR1K653-behandlede mus var relateret til de stigninger i apoptotiske cancercellepopulationer blev tumorer kirurgisk fjernet fra musene 12 dage efter behandling og vævssnit blev analyseret ved TUNEL-assay. Resultater af TUNEL-assayet viste, at mængden af ​​apoptotiske celler til stede i tumorvæv hos BPR1K653-behandlede mus var signifikant højere end i kontrolmusene (55% vs. 7%) (figur 6D). Dette er i overensstemmelse med resultatet af ovennævnte

in vitro

eksperiment, BPR1K652 er i stand til at inducere apoptose cancerceller. Salg

(A, B, C og D) Nøgne mus der bærer human cervical carcinoma KB xenotransplantater blev behandlet med vehikelkontrol (⧫), 30 mg /kg VX680 i 5 dage /uge i 2 uger (på dag 6-10 og 13-17; ▴) eller 15 mg /kg BPR0L075 i 5 dage /uge i 2 uger (på dag 6-10 og 13-17, •). (A) BPR1K653 behandling reduceret mængden af ​​fosfor-histon H3 positive celler til stede i tumorvæv. Immunhistokemisk analyse af ekspressionen af ​​fosfor-histon H3 i tumor vævssnit de 24 timer efter den anden BPR1K653 administration. Nucleus blev farvet blå /lilla med hematoxylin og fosfor-histon H3 blev mærket i brun farve. Mærkede celler blev talt, og procentdelen af ​​de fosfor-histon H3 positive celler til stede i tumorvæv blev beregnet som følger: Samlet mængde celler med brune farve mærket ÷ Samlet mængde celler tilgængelige × 100. Forsøget blev gentaget to gange. En statistisk signifikant forskel i mængden af ​​fosfor-histon H3-positive celler til stede i tumorvæv i mus behandlet med kontrol versus BPR1K653 betegnes med “*”. * P 0,05. (B) Måling af tumorvolumen. En statistisk signifikant forskel i tumorstørrelsen i mus behandlet med kontrol versus BPR1K653 og VX680 betegnes med “*”. * P 0,05. (C) Måling af animalske vægt. (D) TUNEL analyse af tumor vævssnit 12 dage efter BPR1K653 behandling. Tumor vævssnit blev analyseret af FITC

In Situ

afsløring Celledød kit og fluorescerende mikroskopi. Væv behandlet med DNase blev anvendt som positiv kontrol. Grøn fluorescens mærkede nucleus indikerer induktionen af ​​DNA-fragmentering. Forsøget blev gentaget to gange. Kvantitativ analyse blev vist. En statistisk signifikant forskel i mængden af ​​apoptotiske celler til stede i tumorvæv i mus behandlet med kontrol versus BPR1K653 betegnes med “*”. * P 0,05. (E og F) Nøgne mus med P-gp170 /MDR-udtrykkende KB-VIN10 xenograft blev behandlet med vehikelkontrol (⧫), 30 mg /kg VX680 i 5 dage /uge i 3 uger (på dag 12-16, 19 -23 og 26-30; ▴) eller 15 mg /kg BPR0L075 i 5 dage /uge i 3 uger (på dag 12-16, 19-23 og 26-30, •). (E) Måling af tumorvolumen. En statistisk signifikant forskel i tumorstørrelsen i mus behandlet med kontrol versus BPR1K653 og VX680 betegnes med “*”. * P 0,05. (F) Måling af animalske vægt. Data er middelværdien ± SD af tumorvolumen (mm

3) ved hvert tidspunkt (n = 5; * P 0,05).

Især BPR1K653 er også lige så effektivt mod MDR1- udtrykkende tumor xenograft, som det er i dyrkede MDR1-udtrykkende celler. Her blev KB-VIN10 tumor xenograft bruges til at evaluere effekten af ​​BPR1K653 mod MDR1-udtrykkende tumor

in vivo

. På grund af de langsomtvoksende egenskaber af KB-VIN10, den behandlede mus modtog enten 15 mg /kg af BPR1K653 eller 30 mg /kg af VX680

ip

i 5 dage /uge i 3 på hinanden følgende uger i stedet for 2 uger som i KB-implanterede mus. I sammenligning med kontrolmusene, blev væksten af ​​KB-VIN10 tumor signifikant inhiberet i mus behandlet med 15 mg /kg af BPR1K653. Der var et fald -50% i tumor volumen på dag 42 i dyrene behandlet med BPR1K653 (P 0,05). I modsætning hertil VX680 ikke udviser signifikant tumorvækst-inhiberende virkning i mus transplanteret med KB-VIN10 celler (figur 6E). Desuden BPR1K653 var veltolereret i en dosis på 15 mg /kg (5 dage /uge i 3 sammenhængende uger) med ingen tegn på toksicitet i KB-VIN10 xenograft tumor model som tabet af kropsvægt efter behandlingen var mindre end 10 % i behandlingsgruppen som sammenlignes med kontrolgruppen (figur 6F). Således BPR1K653 udøver potent anti-tumoral effekt mod både MDR-negative og MDR-udtrykkende tumorxenoplantater.

farmakokinetik BPR1K653 i rotter

Endelig farmakokinetiske studier af BPR1K653 blev tilgås over en 24 timer periode at undersøge plasmakoncentrationer af BPR1K653 efter en enkelt intravenøs indgivelse (tabel 4). Efter en enkelt administration af BPR1K653 i en dosering på 5 mg /kg til rotter, BPR1K653 opnået en maksimal plasmakoncentration på 10 uM (5463 ng /ml) ved 2 min efter dosering, og den anslåede BPR1K653 plasmakoncentrationen forblev i en koncentration på 3,9 nM (2,1 ng /ml) 24 timer efter dosering. Plasma halveringstid, totale clearance, og fordelingsvolumen ved steady state (Vss) var 3,9 ± 0,7 h, 49,3 ± 10,6 ml /min /kg og 10,6 ± 5,1 l /kg.

diskussion

Aurora-kinaser er dukket op som vigtige regulatorer af mitose og beviser indikerer abnormiteter i deres udtryk og aktivitet er tæt forbundet med udviklingen og progressionen af ​​forskellige kræftformer. I denne undersøgelse har vi udviklet en ny pan-Aurora kinase inhibitor BPR1K653 og yderligere demonstreret sin effektivitet i at målrette forskellige typer af kræft

in vitro

. Vores gennemtrængelige røntgen co-krystallografiundersøgelser havde demonstreret de fysiske interaktioner mellem precursorforbindelsen for BPR1K653 og Aurora-kinaser [42], og den nuværende

in vitro

kinase hæmning undersøgelse har bekræftet målet specificitet BPR1K653. I overensstemmelse med de molekylære ændringer, der observeres i celler behandlet med Aurora-B kinase specifikke siRNA oligoer og med forskellige pan-Aurora kinase hæmmere såsom VX680 og SNS-314 [14], [43], [44], BPR1K653 behandling inducerer også endo- replikation af celler og reducerer mængden af ​​phosphoryleret histon H3 stede i celler. Desuden BPR1K653 kan fremkalde kræft celle apoptose men ikke autofagi (figur S2), som er det fælles resultat i celler behandlet med Aurora kinaseinhibitorer [43]. Interessant, BPR1K653 er aktiv i alle de testede p53-vildtype /ekskluderet /-mutant cancer cellelinjer ved lave nano-molær koncentration (IC

50 20 nM), på trods af begrænsede evne til anden pan-Aurora kinase inhibitor VX680 at inducere endo-replikation og efterfølgende apoptose er blevet vist i cancerceller med normal p53-afhængig post-mitotisk checkpoint funktion i anden undersøgelse [14]. Tilsammen BPR1K653 selektivt at hæmme Aurora-kinaser, og i modsætning til VX680, det er i stand til at målrette forskellige former for kræftceller uanset deres p53 status.

Lægemiddelresistens er et fælles problem i forvaltningen af ​​neoplastiske sygdomme, og effektiviteten af ​​mange kemoterapeutiske lægemidler er begrænset af det faktum, at de er substrater for efflukspumpen MDR1 (P-gp170). For eksempel Aurora kinase inhibitor AZD1152 /AZD1152-HQPA (Barasertib) blev vist at være substrat for MDR1 [24]. Desuden vores reference Aurora kinase hæmmere, VX680 (Tozasertib) og PHA-739.358 (Danusertib), blev tidligere vist ineffektive i at målrette MDR1-udtrykkende SA-DX5 (doxorubicin resistente), MB-231-PTX og H460-PTX (både paclitaxel resistente) kræftceller af andre forskere [25]. I denne undersøgelse blev BPR1K653 vist sig at være lige så effektiv mod to KB-afledte MDR1-positive cancer cellelinier (KB-VIN10 og KB-S15) og en NTUB1-dervided MDR1-positive cancer cellelinje (NTU0.017)

in vitro

. Denne funktion adskiller sig fra de af de velkarakteriserede Aurora kinase-inhibitorer, VX680 og PHA-739.358, fordi vores testede MDR1-positive cancerceller er mere resistente over for disse kemoterapeutiske midler end deres parentale MDR1-negative celler. Derfor bør fælles inkubation af MDR1-inhibitor, verapamil, blev vist at være effektiv i re-sensibiliserende MDR1-udtrykkende cancerceller for både VX680 og PHA-739.358, mens den samme behandling ikke kunne forøge følsomheden til BPR1K653 i hverken MDR1- negativ (KB og NTUB1) eller MDR1-udtrykkende celler (KB-VIN10, KB-S15 og NTU0.017). Vigtigere er det, BPR1K653 er også effektiv til at hæmme væksten af ​​både MDR1-negative KB og MDR1-udtrykkende KB-VIN10 cancerceller

in vivo

, yderligere underbygger hypotesen om, at overekspression af den fælles stof efflukspumpen MDR1 kunne ikke interferere med effektiviteten af ​​BPR1K653 målrette cancerceller. Da kemoterapeutiske forbindelser såsom paclitaxel, vincristin (anti-mikrotubuli midler), doxorubicin (DNA interkalationsmiddel), tretinoin (

all-trans

retinsyre), mitoxantron, VP-16 (topoisomerase II-hæmmere) og imatinib (