PLoS ONE: Den Molekylær underskrift Stroma respons i Prostata Cancer-induceret osteoblastiske knoglemetastaser Highlights Udvidelse af Hæmatopoietisk og Prostata Epitel Stem Cell Niches

Abstrakt

Den gensidige vekselvirkning mellem kræftceller og vævsspecifikke stroma er kritisk for primær og metastatisk tumorvækst progression. Prostata kræftceller kolonisere fortrinsvis knogle (osteotropism), hvor de ændrer den fysiologiske balance mellem osteoblast-medieret knogledannelse og osteoklastisk medieret knogleresorption, og fremkalde overvejende en osteoblastiske respons (osteoinduktion). De molekylære signaler leveret af osteoblaster for overlevelse og vækst af knogle metastatiske prostatacancerceller er stort set ukendte. Vi udnyttet tilstrækkeligt divergens mellem de menneskelige og mus-RNA-sekvenser sammen med omdefinering af stærkt artsspecifikke gen arrays ved computerstøttet og eksperimenterende udelukkelse af cross-hybridiserende oligonucleotidprober. Denne strategi tillod dissektion af stroma (mus) fra cancercellen (human) transkriptom i knoglemetastaser xenograftmodeller af humane osteoinduktive prostatacancerceller (VCap og C4-2B). Som følge heraf genereres vi den osteoblastiske knoglemetastaser-associeret stroma transkriptom (OB-BMST). Subtraktion af gener deles af inflammation, sårheling og desmoplastiske reaktioner, og af vævstype-uafhængig stroma responser på en række ikke-osteotropic og osteotropic primære cancere genereret en kurateret gen signatur ( “kerne” OB-BMST) putativt repræsenterer knoglen marv /knogle-specifik stroma respons på prostatacancer-induceret, osteoblastiske knoglemetastaser. Udtrykket mønster af tre repræsentative Core OB-BMST gener (PTN, EPHA3 og FSCN1) synes at bekræfte knoglen specificiteten af ​​denne reaktion. En robust induktion af gener involveret i osteogenese og angiogenese dominerer både OB-BMST og Core OB-BMST. Dette betyder i en forstærkning af hæmatopoietisk og bemærkelsesværdigt, prostata epitelial stamceller niche komponenter, der kan fungere som en selvforstærkende knogle metastatisk niche giver en vækst støtte specifikt for osteoinduktive prostata kræftceller. Induktion af denne kombinatorisk stamcelle niche er en ny mekanisme, der også kan forklare kræftcellen osteotropism og lokal interferens med hæmatopoiese (myelophthisis). Følgelig kan disse stamceller niche komponenter repræsenterer innovative terapeutiske mål og /eller serum biomarkører i osteoblastiske knoglemetastaser

Henvisning:. Özdemir BC, Hensel J, Secondini C, Wetterwald A, Schwaninger R, Fleischmann A, et al . (2014) Den Molekylær underskrift Stroma respons i Prostata Cancer-induceret osteoblastiske knoglemetastaser Highlights Udvidelse af Hæmatopoietisk og Prostata Epithelial stamcelle nicher. PLoS ONE 9 (12): e114530. doi: 10,1371 /journal.pone.0114530

Redaktør: Adriano Angelucci, University of L’Aquila, Italien

Modtaget: Juni 20, 2014, Accepteret: November 10, 2014; Udgivet: 8. december 2014

Copyright: © 2014 Özdemir et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte filer. De rå udtryk data om GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) som GSE22813

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Europa-Kommissionen (CANCURE-2006 til 020.970 og FP7 Marie Curie ITN PRO-NEST-238.278), og fra den schweiziske National Foundation (3100A0-116237). B.C.Ö. modtaget støtte fra OncoSuisse MD /PhD Scholarship (323630-128865 /1). En del af omkostningerne til microarray hybridisering blev støttet af Institut for Klinisk Forskning, University of Bern, Schweiz. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige solide kræft hos mænd i den vestlige verden. Trods tidlig påvisning og kirurgisk behandling af tumoren, 10-20% af PCA patienter viser knoglemetastaser ved diagnose [1] og 80% af avancerede PCA patienter har knoglemetastaser ved autopsi [2]. Knoglemetastaser er den vigtigste årsag til sygelighed hos disse patienter, og når de er opstillet, er uhelbredelig.

I primære og metastatiske kræftformer neoplastiske celler tæt samspil med forskellige celletyper og den ekstracellulære matrix (ECM), der udgør stroma rum . Dette fører til aktivering af stroma og til gengæld til sekretion af yderligere vækstfaktorer, matrixproteiner og proteaser, som yderligere begunstiger cancercelleproliferation og invasion. Disse heterogene og tovejs interaktioner inden for tumorvæv er grundlæggende for tumorvækst progression [3]. Derfor belysning af mekanismen (r) bestemmelse af initiering og progression af metastatisk vækst er nødvendig for identifikation af nye terapeutiske mål for forebyggelse og /eller behandling af cancer metastaser.

knoglemetastaser aktivering af knoglemarven /knogle (BM /B) stroma af cancerceller ændrer den fysiologiske balance mellem osteoblast (OB) -medieret knogledannelse og osteoklast (OC) -medieret knogleresorption, og forstyrrer hæmatopoiese (myelophthisis). PCa fremkalder overvejende en OB respons, med en deraf følgende stigning i knogledannelse (osteoinduktion) og generering af osteosclerotic læsioner [4]. I stedet brystcancer (MCA) udløser fortrinsvis en OC reaktion, hvilket resulterer i overdreven knogleresorption og dannelse af osteolytiske læsioner [5]. Disse modsatrettede stromale reaktioner kan ligge til grund for forskellige krav support vækst mellem pro-osteolytiske og osteoinduktive kræftceller.

Faktorer frigivet fra knoglen matrix under OC-medieret knogleresorption brændstof spredning af kræftceller, som stimulerer yderligere knogleresorption, hvilket fører til en selvforstærkende, positiv feedback loop. Denne mekanisme, kendt som “Vicious Cycle” hypotese af knogleresorption og tumorvækst i osteolytiske knoglemetastaser er et paradigmatisk eksempel på kræftcelle-stroma interaktion og har givet begrundelsen for at blande sig med knoglen stroma støtte ved hæmning af knogleresorption [6 ]. Imidlertid har de molekylære signaler leveret af obs for overlevelse og vækst af osteoinduktive cancerceller stort set undvigende [4]

Pagets “Seed Jord “hypotese [7] postulerer, at cancerceller (” seed “) fra den primære tumor kan formidle til forskellige væv, men tiden blive etableret sekundær vækst kun i dem, der er tolerante for deres overlevelse og /eller proliferativ ekspansion (den” frugtbare jord “) [8]. Således “Seed Jord “hypotese indbegrebet af tilbøjelighed for visse kræftformer at metastaserer til specifikke væv (væv tropisme). Paget var også den første til at erkende, at MCa metastaserer næsten udelukkende til det aksiale skelet, stedet for den røde marv [7]. Denne observation tyder på, at aktiv hæmatopoiesis kan repræsentere den frugtbare jord til såning af kræftceller, der kan derfor efterligner bloddannende stamceller (HSC’er) for målsøgende, overlevelse og /eller ekspansion i BM /B [9]. Denne hypotese, hvilket indebærer, at BM /B metastatisk niche kan matche med HSC niche, er blevet eksperimentelt valideret ved at vise, at PSA-celler kapre HSC niche (er) for homing i BM /B [10].

de fleste forsøg på at dechifrere kræft gen signaturer fremhæver signalveje kritiske for kræft progression eller forudsige patientens udfald er blevet udført af genekspression profilering i kliniske prøver af bulk-tumorvæv. Naturligvis kan denne strategi ikke diskriminere mellem kræft- og stroma-afledt genekspression. Naef og Huelsken [11] har udviklet en fremgangsmåde til “vævsområderne-specifik transskriptionsprofilering” (TCTP), som muliggør samtidig analyse af genekspression er specifik for cancercellen og det stromale rum

in situ

, uden forudgående celleseparation. Denne fremgangsmåde udnytter forskelle mellem humane og murine RNA-sekvenser og vælger de fleste artsspecifikke oligonukleotidprober af en beregningsmæssig maske. Ved en lignende strategi genereret vi osteoblastiske knoglemetastaser-associeret stroma transkriptom (OB-BMST) definerer for første gang den globale stroma respons i knogle xenograftmodeller af osteoinduktive PCA celler.

Resultater

osteoinduktive PCA celler ændrer BM /B stroma transkriptom

den strategi, der blev vedtaget for at undersøge transkriptom forandringer, der sker specifikt i stroma rum i knogler xenotransplanterede med menneskelige osteoinduktive prostata kræftceller er skitseret i fig. 1A.

A. Flowdiagram skitserer eksperimentel (blå) og bioinformatik (grå) trin, der er vedtaget for at definere en komplet (OB-BMST) og en kurateret ( “Core” OB-BMST) stroma svar signatur (orange). De første to eksperimentelle skridt udgør vævet rum-specifikke transkriptionel profilering (TCTP). B. Heatmap viser differentielt udtrykte probe-sæt mellem xenotransplanteret (C4-2B og VCAP) og kontrol (Ep156T, intakte og humbug) knogler. Ekspressionsniveauet er farvekodet: lav ekspression er repræsenteret i blå, hvorimod høj ekspression er repræsenteret i rødt. C. Venn diagram, der viser antallet af overlappende og unikke gener udtrykkes forskelligt i C4-2B (FDR = 1E-05) og VCAP (FDR = 3E-05) xenotransplanterede knogler. Summen af ​​differentielt udtrykte gener er benævnt OB-BMST. D. Scatter plot, der viser log

2 gange ændring af differentielt udtrykte gener i C4-2B og VCap xenotransplantater. E. Top 30 up-regulerede gener i OB-BMST afledt C4-2B (sorte søjler) og VCAP (grå søjler) xenotransplanterede knogler.

differentielt udtrykte sonde sætter klart adskilt cancer-celle xenotransplanterede knogler fra kontrol knogler, som fremhævet af hierarkisk klyngedannelse (fig. 1B). Den Heatmap viser homogen gruppering inden xenotransplantaterne, men dendrogram stadig viser, at C4-2B og VCAP implanteret adskilt i to grene. Alle kontrolprøver også klynge sammen, tyder på, at et kirurgisk indgreb og podning af ikke-tumorigene, normale humane prostata epitelceller (Ep156T) ikke forårsage store ændringer i genekspression. Derudover Heatmap indikerer, at i xenotransplantater den fremherskende del af gener (64%) blev opreguleret.

Når sammenlignet med sham-opererede knogler, er 654 gener udtrykkes forskelligt i C4-2B xenotransplantater (falsk opdagelse sats, FDR≤1E-05) og 583 gener i VCap xenografter (FDR≤3E-05) (fig. 1C, S1 tabel). Summen af ​​disse differentielt udtrykte gener vil blive omtalt som OB-BMST.

I alt 321 gener fra OB-BMST er fælles for begge C4-2B og VCAP xenografter (Fig. 1C, S1 Table ). Scatter plot af log

2 gange ændring for begge xenografter viser en signifikant sammenhæng (R

2 = 0,96) (fig. 1D), hvilket indikerer en komplet overensstemmelse mellem genregulering for begge modeller af osteoblast knoglemetastaser. Men inden OB-BMST, 333 og 262 gener er unikke for C4-2B og VCap hhv. Forskelle i osteoinduktivt potentiale (VCap C4-2B) og /eller i vækstkinetik (C4-2B VCap) kan forklare denne delvise mangfoldighed af stroma reaktion induceret af de to cellelinier. Ikke desto mindre, blandt top 30 mest up-regulerede gener 18 er fælles for C4-2B og VCAP xenografter (fig. 1E, S1 Table), hvilket indikerer, at begge cellelinier er sammenlignelige til at inducere den fremherskende stroma reaktion.

OB-BMST forbinder med myoepithelial /myofibroblastdifferentiering signatur

for at identificere den celletype hovedansvarlig for OB-BMST udtryk, vi sammenlignede up-regulerede gener i OB-BMST med gen-signaturer tidligere afledt specifik stroma cellepopulationer i mammae tumorer [12]. Denne analyse viser, at OB-BMST hovedsageligt overlapper med myoepithelial /myofibroblastdifferentiering underskrift og, i mindre grad, med fibroblast og EF signaturer (S1 figur).

En brøkdel af OB-BMST ikke specifik for BM /B reaktion på osteoinduktive PCA celler

analysen af ​​ekspressionen af ​​en 7-gen sæt af stærkt opreguleret OB-BMST gener, nemlig periostin (

Postn

), asporin (

AspN

), SPARC-lignende 1 (

Sparcl1

), melanom celleadhæsionsmolekyle (

Mcam

), blodpladeafledt vækstfaktor receptor beta (

Pdgfrb

), fascin homolog 1 (

Fscn1

) og prostata transmembrane protein, androgen induceret en (

Pmepa1

) viste, at disse gener ikke kun induceret i stroma af knogler xenotransplanterede med C4 -2B og VCAP celler (S2A figur), men også i ortotopisk VCAP xenografter (S2B figur) og i ektopiske (S2C Figur) xenografter både C4-2B og VCap celler. Derudover er ekspressionen af ​​7-gensæt inducerede også i knogler xenotransplanterede med pro-osteolytiske PCa cellelinien PC-3 (S2D figur). Endvidere AspN og POSTN ekspression øger ikke blot i stroma af knogle metastatisk human PCa, men også af primær PCa og af knogle metastatisk humant MCA (S3 figur).

Tilsammen resultaterne ovenfor antyder, at en del af den OB-BMST er ikke specifik for BM /B reaktion på osteoinducerende PCA-celler. Men den opdagelse, at proteiner kodet af gener af OB-BMST også overudtrykkes i stroma af humane primære og knogle metastatiske tumorer understreger, den translationelle værdi af OB-BMST.

En fraktion af OB-BMST er specifik for BM /B reaktion på osteoinduktive PCA celler

for at identificere OB-BMST komponent specifikke for de osteoblastiske knoglemetastaser, vi trækkes fra OB-BMST stroma gen underskrifter afledt af inflammatorisk /sårheling og desmoplastiske . reaktioner, og fra ikke-osteotropic og osteotropic kræftformer (. figur 1A)

Denne strategi, der er nævnt, derefter som “curation”, har ført til identifikation af 4 store komponenter i OB-BMST:

1)

en komponent formodet specifik for BM /B stroma reaktion på osteoinduktive PCA celler, fra nu af benævnt “Core OB-BMST”,

2)

en komponent deles med ” inflammatoriske /sårheling /desmoplastiske “respons underskrifter,

3)

en komponent muligvis repræsenterer en” universel “reaktion på kræftceller og

4)

en kandidat” osteotropic “signatur.

Core OB-BMST, der dækker 72,6% af OB-BMST, består af 336 opreguleret og 298 ned-regulerede gener. Af disse 109 og 93, henholdsvis er fælles for både C4-2B og VCAP xenografter (Fig. 2A, S2 tabel). Disse gener vil sandsynligvis være begrænset til BM /B stroma reaktion på osteoinducerende vækst kræftcelle. Imidlertid bør specificitet Core OB-BMST betragtes med forsigtighed, da vores subtraktiv strategi var begrænset til offentligt tilgængelige gen underskrifter og har ikke fundet undersøgelser vedrørende enkelt gen og /eller protein udtryk i en række forskellige kræftformer.

A. Fire-sæt Venn diagram, der viser sammenligning af primær MCA PCa med OB-BMST efter subtraktion af gen signaturer afledt fra desmoplastiske, sårhelende, inflammatorisk og ikke-osteotropic cancere (= “Kurateret 2” OB-BMST, summen af ​​grå og røde områder). Den røde skraverede område omtales som “Core OB-BMST” (komplet liste rapporteret i S2 tabel), gener af det grå område udgør en potentiel osteotropic signatur (komplet liste rapporteret i S6 tabel). B. Top 30 up-regulerede gener af Core OB-BMST afledt C4-2B (sorte søjler) og VCAP (grå søjler) xenotransplanterede knogler.

De øverste 10 gener af Core Observed BMST liste (fig. 2B, S2 Table) er konserveret fra de øverste 30 mest up-regulerede gener af OB-BMST (fig. 1E, S1 tabel). Blandt de 30 gener af Core OB-BMST, 12 er fælles for C4-2B og VCAP implanteret, mens 13 og 5 er unikke for VCAP og C4-2B hhv. Således i modsætning til OB-BMST top 30-genet liste, Core OB-BMST primært induceret af VCap celler. Mest sandsynligt, dette er en følge af den mere robust OB respons induceret af disse celler, i sammenligning med C4-2B (fig. 1A).

angiogenese og osteogenese er de centrale processer er repræsenteret i OB-BMST og Core OB-BMST

GO vilkår analyse viser, at op-regulerede gener i både OB-BMST og Core OB-BMST fælles for VCAP og C4-2B ( “almindelig” OB-BMST /Core OB-BMST) er stærkt forbundet (FDR 0,05) med anmærkninger vilkår relateret til angiogenese, skelettet udvikling og enzymbundet receptorprotein signalvejen (figur 3 A og B).. ECM organisation og celleadhæsion er også højt repræsenteret i OB-BMST, mens TGF-receptor signalering vises som yderligere udtryk i Core OB-BMST. Down-regulerede gener er hovedsageligt grupperet i GO udtryk vedrørende cellecyklus (fig. 3A og B). Mest sandsynligt, den fuldstændige mangel på hæmatopoiese i BM rum ​​invaderet af cancerceller (myelophthisis) er ansvarlig for dette fænomen.

GO vilkår beriget med den “fælles” OB-BMST (FDR≤5.50E-03) (A) og i “fælles” Core OB-BMST (FDR≤5.0E-01) (B). Protein interaktion netværk ved STRING analyse i den “fælles” OB-BMST (C) og i den “fælles” Core OB-BMST (D). Tykkelsen af ​​linjer korrelerer positivt med den tillid score, der blev opnået for hvert protein-interaktion. Forkortelse:. FDR, falsk opdagelse sats

Proteinet netværksanalyse afslører fibronektin 1 (fn1) som den centrale knude af OB-BMST, med 31 interaktion partnere involveret i ECM remodellering (f.eks BGN, Fbln1 , FMOD, Adamts4, Timp1, Postn, Mmp14), skelettet udvikling (Sparc, COL1A1, MMP13, Serpinh1), Wnt signalering (Sdc1, Ryk, Jup), celleadhæsion (Mcam, Thbs2, Itgb5), angiogenese (jun, NOS3 ), sårheling (GFAP, Lox) og epitelial-til-mesenkymale overgang (Tgfβ3, Snai1). En anden fremtrædende netværk består af 10 kollagen familiemedlemmer og er knyttet til fn1 af Sdc1 og 2 (fig. 3C). Analyse af protein interaktion netværk i Core OB-BMST peger på TGF-receptor og Ephrin signalering (fig. 3D).

Blandt de 67 aktiverede opstrøms regulatorer identificeret for den “fælles” OB-BMST, 15 repræsenterer vækstfaktorer (TGFp1, CTGF, FGF2, Agt IGF, Gdf2, Vegfa, BMP2, Tgfβ3, BMP4, IGF1, Jag1, LEP, Pdgfb, Inhba) og 6 repræsenterer cytokiner (PRL, Idn1, Il17a, CSF1, Osm, Wnt1) (S3 Tabel). For “almindelige” Core OB-BMST, er antallet af aktiverede biologiske opstrøms regulatorer betydeligt begrænset (TGFp1, EphB4, Kdm5b, Nupr1, Igfr1 og FGF2). Kun TGFp1 og FGF2 tilbageholdes fra OB-BMST, og EphB4 fremstår som en aktivator af den kanoniske TGFp-vejen (tabel 1). TGFp1 har den højeste aktivering score, stringens og største antal forudsagte målmolekyler for begge transcriptomes (tabel 1 og S3 tabel).

Analysen af ​​overrepræsenterede sekvens motiver i initiativtagerne til gener Core OB-BMST viser, at kun de up-regulerede gener har betydelig motiv overrepræsentation, nemlig til Foxo4, Meis1 og Maz (tabel 2). Processerne er forbundet med Foxo4-, Meis1- og Maz-bundne gener er angiogenese og vaskulogenese (

P

= 10E-09), celle vejkryds samling og organisation (

P

= 10E-05 ) og kollagen fibril organisation og ekstracellulær matrix organisation (

P

= 10E-03).

Kollektivt, ovenstående resultater tyder stærkt angiogenese og osteogenese som vigtige biologiske processer og TGFp som større signalvej involveret i osteoblast knoglemetastaser.

OB-BMST og Core OB-BMST delvist overlapper “stamcelle niche” signaturer

litteraturen undersøgelsen for 96 af de mest up-regulerede gener af Core OB-BMST viser, at 32 gener (33,3%) er involveret i OB rekruttering /funktion, 6 gener (6,3%) i OC rekruttering /funktion, 34 gener (35,4%) i EF rekruttering /funktion og 13 gener ( 13,5%) i MSC differentiering /funktion. Især er 10 gener (10,4%) dokumenterede HSC niche komponenter og 9 gener (9,4%) kræftcelle niche komponenter. Det skal antages, at enkelte gener, kunne sættes på mere end en kategori. Fyrre-én gener (42,7%) er relateret til nogen af ​​kategorierne ovenfor (tabel 3, S4 tabel).

For yderligere at bekræfte bidrag SC niche-relaterede gener til osteoblastiske reaktion, vi sammenlignet både OB-BMST og Core OB-BMST med to SC niche underskrifter offentligt tilgængelige for HSC [13] og for at udvikle prostata (uro-genital mesenkym, UGM) [14]. OB-BMST indeholder 14 gener (45%) af 31 HSC-genet signatur [13] og 208 gener (14,8%) af 1405 UGM-genet signatur (fig. 4A og B). Som en effekt af datasikring, 5 (16%) af de HSC gener og 141 (11%) af UGM gener er bibeholdt i Core OB-BMST (Fig.4C og D, tabel 4 og S5 tabel). Vigtigere er det, 37% og 42% af de up-regulerede gener af OB-BMST og Core OB-BMST henholdsvis repræsenterer gener også opreguleret i UGM signatur.

Venn-diagram, der viser antallet af overlappende OB -BMST (A og B) og Core OB-BMST (C og D) gener med gen-signaturer afledt af det hæmatopoietiske (A og C) og udvikle prostata (B og D) stamceller nicher. Relativ ekspressionsniveauer af

PTN

,

Epha3

,

Cd109

og

Slit3

. E. VCAP (grå,

n

= 3) og C4-2B (sort,

n

= 4) intra-ossøse xenografter; værdier er vist som gange ændring (middel ± SD) i forhold til kontralaterale og sham-opererede knogler. F. VCAP (grå,

n

= 5) ortotopisk xenografter; værdier er vist som gange ændring (middel ± SD) i forhold til intakt og sham-opererede prostata. G. VCAP (grå,

n

= 3) og C4-2B (sort,

n

= 5) subkutane xenotransplantater; værdier er vist som gange ændring (middel ± SD) i forhold til intakt hud. H. PC-3 (lysegrå,

n

= 6) intra-ossøse xenografter; værdier er vist som gange ændring (middel ± SD) i forhold til kontralaterale og sham-opererede ben (

n

= 3-4). *,

P

0,01; **,

P

0,001; ***,

P

0,0001; ****,

P

0,0001. Forkortelser: HSC’er, hæmatopoietiske stamceller; UGM urogenital mesenchym;

PTN

, pleiotrophin;

Epha3

, Ef receptor a3;

Slit3

, snitte homolog 3.

Core OB-BMST SC niche gen

Epha3

er specifik for BM /B stroma reaktion i osteoblastiske knoglemetastaser

opregulering af 4 repræsentative SC niche gener, nemlig pleiotrophin (

PTN

), Ef-receptor a3 (

Epha3

),

Cd109

og Slit homolog 3 (

Slit3

) i VCAP og C4-2B knogle implanteret bekræftes af RT-qPCR-analyse (fig. 4E).

Slit3

og i mindre grad,

Cd109

, er betydeligt opreguleret også i stroma af orthothopic VCap (fig. 4F).

PTN

,

Cd109

er betydeligt opreguleret også i stroma af subkutane C4-2B xenografter (fig. 4G). I modsætning hertil er ingen af ​​de 4 SC niche gener betydeligt induceres i stroma af subkutane VCAP xenotransplantater (fig. 4G). En signifikant induktion af disse gener er også vist i stroma af knogle- xenografter af de pro-osteolytisk PC-3-celler (fig. 4H), men dette er ubetydelig sammenlignet med induktionen i stroma af knogler xenotransplanterede med osteoinducerende C4-2B og VCap celler. Disse resultater viser, at i det mindste i kræft celle xenotransplantater, induktion af

Epha3

udtryk er den mest specifikke for den osteoblastiske reaktion.

Ekspression af Core OB-BMST proteiner PTN, EPHA3 og FSCN1 er begrænset til human PCa knoglemetastaser

for at kontrollere translationel værdi Core OB-BMST gener, undersøgte vi det protein ekspressionen af ​​to SC-niche komponenter PTN og EPHA3, og af de mest opreguleret gen FSCN1 i normal prostata og knogler, og i den primære og knogle metastatisk PCa.

normalt knogle og hæmatopoietisk marv (fig. 5A) er blottet for PTN immunoreaktivitet. I knoglemetastaser (fig. 5D), obs og nyligt indlejret osteocytter er PTN-positive, men kun i områder med cancer celleinfiltration. Cancerceller er for det meste negative, med undtagelse af få celler i nærhed af knogledannende obs. I normal prostata (fig. 5G) isolerede klynger af luminale celler i nogle acini er PTN-positive, mens hovedparten af ​​acini er blottet for PTN immunoreaktivitet. Sektioner af PCa (fig. 5J) er for det meste negative, med undtagelse af nogle få cancerceller i områder med høj Gleason bedømmelse (ikke vist).

Immunhistokemisk påvisning af PTN (A, D, G og J), EPHA3 (B, E, H og K) og FSCN1 (C, F, i og L) i normal knogle (A, B og C), i osteoblastiske PCa knoglemetastaser (D, E og F), i normal prostata (G , H og i) og i den primære PCa (J, K og L). Mellemværker repræsenterer en højere forstørrelse af udvalgte områder. Scale bar = 50

μ

m. Forkortelser: PTN, pleiotrophin; EPHA3, Ef receptor A3; FSCN1, fascin homolog 1.

Stærkt EPHA3-immunreaktive stjemeformige-lignende celler findes spredt i normal BM (fig. 5B), og med øget tæthed, i tumor stroma af knoglemetastaser (fig. 5E). OBS, osteocytter og anvendelsesforhold er negative, samt hovedparten af ​​kræftceller. I normal prostata ca. halvdelen af ​​de acini er EPHA3 negative, mens der i den anden halvdel diskrete dele af det basale lag er positive (fig. 5H). Positiv farvning findes også i sjældne myofibroblaster. I modsætning hertil i den primære PCa, kræftceller i alle neoplastiske acini er altid EPHA3 negativ, med ingen ændring af farvningen mønster i stroma dækslet (Fig. 5K).

I normale knogle stjerneformede celler i hæmatopoietisk marv er stærkt FSCN1-positive (fig. 5C), men oBS, foring celler, osteocytter og anvendelsesforhold er FSCN1-negative. I modsætning hertil PCa knoglemetastaser (fig. 5F), aktive obs, osteocytter og fibroblastlignende stromaceller omkringliggende områder af cancercellevækst er FSCN1-positive, mens cancerceller er negative. I normal prostata, (fig. 5I) FSCN1 immunoreaktivitet detekteres i EC’er af små kar og i spredte, fibroblastlignende celler. I PCa (fig. 5 I) ekspressionsmønsteret for FSCN1 ligner normal prostatavæv.

Disse resultater yderligere støtte den translationelle værdi af OB-BMST og vise, at Core OB-BMST indeholder gener, som er specifikt induceret i stroma af knogle metastatisk, men ikke af primær PCa.

OB-BMST indeholder også gen-signaturer ikke unikke for osteoblastiske knoglemetastaser

Som beskrevet ovenfor curation strategi har ført til definitionen af ​​3 ekstra komponenter i OB-BMST

En komponent, som dækker 8,7% af OB-BMST gener, matcher med tidligere genereret, inflammatoriske, sårheling og desmoplastiske respons signaturer [15] -. [19 ] (S6 tabel).

En anden komponent dækker 8,8% af OB-BMST og deler gener med underskrifter tidligere hentede fra ikke-osteotropic kræftformer såsom gastrisk [20], pancreas [21], [22], kolorektal [23] og esophageal [24], [25] (S6 tabel).

den sidste komponent dækker 9,9% af OB-BMST og deler 88 gener med underskrifter opnået fra primær MCa [12], [ ,,,0],26] – [29] og PCa [29] – [33], der er kendt for deres høje tilbøjelighed til at metastaserer til knogle (osteotropism) [4], [5] (fig. 2A og S6 tabel). Denne komponent kan repræsentere en signatur forudsige sygdomsprogression som knoglemetastaser. Desværre kunne denne mulighed ikke valideres i PCa da der ikke genekspression datasæt for metastatisk resultat af primær PCa er offentligt tilgængelige.

Diskussion

Dette er den første omfattende transkriptom analyse definerer BM /B stroma reaktion i xenograftmodeller PCa-induceret osteoblastisk knoglemetastaser. Den stroma specificitet denne transkriptom, betegnet OB-BMST, er blevet leveret af TCTP [11], en metode tillader den analytiske dissektion af tumor stroma og kræft celle transcriptomes

in situ

, uden fysisk adskillelse af to rum.

Osteogenesis og angiogenese er de vigtigste processer i OB-BMST og Core OB-BMST

GO vilkår, de vigtigste opstrøms regulatorer og de store effektor celler i OB-BMST og Core OB-BMST indikerer stærkt, at osteogenese og angiogenese er de fremherskende processer i BM /B stroma reaktion af PCa-induceret, osteoblastiske knoglemetastaser. Knapheden af ​​gener relateret til p-piller (4 gener, der koder hæmmere af OC rekruttering /aktivitet og kun to gener, der fremmer OC rekruttering) i Core OB-BMST og manglen på gener, der koder master-faktorer stimulerende OC rekruttering (Rankl, CSF-1 og IL -8) i OB-BMST yderligere støtte den opfattelse, at i osteoblastiske knoglemetastaser, er der ingen stigning i OC rekruttering [34].

osteogenesis.

bidrag osteogenese til OB-BMST /Core OB-BMST kunne forudses og bekræfter robusthed af de to musemodeller af osteoblastiske knoglemetastaser blev vedtaget i denne undersøgelse.

Markers og /eller effektorer af MSC og OB rekruttering og funktion er stærkt beriget i Core OB-BMST, hvor de repræsenterer 40% af de 96 mest up-regulerede gener. Dette indikerer, at Core OB-BMST bedre illustrerer knoglen kontekst-specifikke, stromale reaktion på osteoinduktive kræftceller end den oprindelige OB-BMST. Desuden konstateringen af, at de osteogenese-relaterede gener blandt de øverste 30 Core OB-BMST gener overvejende er fremkaldt af VCAP celler synes at understrege højere osteoinduktive potentiale i disse celler, sammenlignet med C4-2B.

Kræft associeret fibroblaster (CAFS) er en ekstra celle population bidrager til OB-BMST som angivet med:

a)

foreningen med et tidligere hentede myofibroblaster /fibroblaster gen signatur [12],

b)

berigelsen af ​​CAF markører (dvs. Pdgfrb og Sparc) og rekruttere faktorer (TGFp1, Tgfβ3, FGF2 og Pdgfbb) [35],

c)

den centrale position CAF-afledte ECM-proteiner (fn1 og collagener) [36] i proteinet netværket og

d)

udtryk for AspN og POSTN af myofibroblaster i primær og knogle metastatisk PCa. Dette fund er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse rapporterer, at en CAF signatur er overrepræsenteret i knoglemetastaser, i forhold til lunge-, lever- og hjernemetastaser [37].

CAF og OBS deler en fælles celle-of-oprindelse (MSC /pericyt) og en vis grad af markør udtryk, og deres ansættelse induceres af identiske vækstfaktorer. Derfor er det fristende at spekulere, at OBS er en ekstra, knogle-specifik population af CAF og at osteoblastiske reaktion er en vævsspecifik manifestation af desmoplastiske reaktion på kræft celle invasion.

Fscn1

, en af ​​de 7-genet sæt, er den øverste opreguleret gen af ​​Core OB-BMST. Dets kodede protein er kritisk for celle-matrix adhæsion, celle-interaktioner og cellemotilitet. I normal voksent væv, er det udtryk udelukkende af dendritiske celler [38]. I solide cancerformer, er FSCN1 hovedsagelig været forbundet med kræftceller og dens stromale udtryk er generelt blevet overset [39]. Her viser vi for første gang, at der i knoglemetastaser er ekspressionen af ​​dette protein induceret

de novo

i obs og osteocytter, og CAF.