PLoS ONE: pyruvatkinase M2 og Lactatdehydrogenase A Er overudtrykt i kræft i bugspytkirtlen og korrelerer med dårligt resultat

Abstrakt

Kræft i bugspytkirtlen har en 5-års overlevelse på mindre end 4%. Trods fremskridt i diagnostisk teknologi, kræft i bugspytkirtlen fortsætter med at være diagnosticeret på et sent og uhelbredelig etape. Der er et presserende behov for nøjagtige biomarkører for tidlig diagnose og til at forudsige behandlingsrespons. Da ændring af glukosemetabolismen er et af kendetegnene ved kræftceller, foreslog vi, at pyruvat kinase typen M2 (M2PK) og lactatdehydrogenase A (IdhA) enzymer kunne repræsentere nye diagnostiske markører og potentielle terapeutiske mål i bugspytkirtelkræft. I 266 vævssnit fra normale bugspytkirtlen, pancreas cystiske neoplasmer, pancreas intraepitelialneoplasi (Panin) og kræft, vurderet vi udtryk for PKM2, IdhA, Ki-67 og CD8 + ved immunhistokemi og korreleret disse markører med klinisk-patologiske karakteristika og patientens overlevelse. PKM2 og IdhA udtryk blev også vurderet ved Western blot i 10 humane bugspytkirtelkræft cellelinjer. PKM2 udtryk steg progressivt fra cyste gennem Panin til kræft, mens IdhA blev overudtrykt hele kræftfremkaldende proces. Alle undtagen en cellelinie viste høj ekspression af begge proteiner. Patienter med stærk PKM2 og IdhA udtryk havde signifikant dårligere overlevelse end dem med svag PKM2 og /eller IdhA udtryk (7,0 måneder versus 27,9 måneder, henholdsvis p = 0,003, log rank test). Udtrykket af både PKM2 og IdhA korreleret direkte med Ki-67-ekspression, og omvendt med intratumoral CD8 + celletal. PKM2 var signifikant overudtrykt i dårligt differentierede tumorer og både PKM2 og IdhA blev overudtrykt i større tumorer. Multivariable analyse viste, at kombineret ekspression af PKM2 og IdhA var en uafhængig dårlig prognostisk markør for overlevelse. Afslutningsvis vores resultater viser en høj ekspression mønster af to store glycolytiske enzymer under bugspytkirtlen carcinogenese, med øget udtryk i aggressive tumorer og en betydelig negativ effekt på overlevelse

Henvisning:. Mohammad GH, Olde Damink SWM, Malago M , Dhar DK, Pereira SP (2016) pyruvatkinase M2 og Lactatdehydrogenase A Er overudtrykt i kræft i bugspytkirtlen og korrelerer med dårligt resultat. PLoS ONE 11 (3): e0151635. doi: 10,1371 /journal.pone.0151635

Redaktør: Michael Muders, University Hospital Carl Gustav Carus Dresden, Tyskland

Modtaget: August 5, 2015; Accepteret: 2. marts, 2016 Udgivet: 18 Mar 2016

Copyright: © 2016 Mohammad et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af kræft i bugspytkirtlen Research Fund, The Jason Boas Foundation, NIH tilskud P01 CA084203 og UCLH /UCL Omfattende Biomedical center, som modtager en del af midlerne fra Department of Health ‘s National Institute for Health Research (NIHR) Biomedical Research centre støtteordning. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de mest almindelige gastrointestinale kræftformer og den fjerde mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Kirurgisk resektion er den mest effektive behandling, men patienterne normalt diagnosticeres på et fremskredent stadium, hvor kirurgisk resektion ikke er mulig, hvilket resulterer i en fem års overlevelse på mindre end 4% [2]. Der er få andre effektive behandlingsformer, med palliativ enkelt middel eller en kombination kemoterapi som den vigtigste behandlingsmulighed for patienter med fremskreden sygdom [3,4].

Aerobic glykolyse er kendetegnende for kræftceller, med produktion af lactat selv i nærvær af rigelige mængder af oxygen, et fænomen kendt som Warburg effekten [5-7]. En vigtig fordel ved forøget glycolyse i tumorceller er produktion af energi uden forbrug af ilt og glycolytiske mellemprodukter, såsom aminosyrer, nukleotider, phospholipider og triglycerider, der anvendes som makromolekyler til syntese af strukturelle elementer af nye celler [5, 6,8,9].

pyruvatkinase (PK) er en tæt reguleret glykolytisk enzym, der katalyserer det sidste trin af glycolyse og medierer overførslen af ​​phosphat fra phosphoenolpyruvat (PEP) til adenosindiphosphat (ADP) til frembringelse pyruvat og energi (ATP) [10-12]. PK har fire forskellige isoenzymer PKM1, PKM2, PKL og PKR, hvis ekspression afhænger af den metaboliske respons af celler. Både L og M-generne koder PK isoenzymer. L-genet koder for både L- og R-PK isoenzymer, mens M-genet koder både M1 og M2 isoenzymer (PKM2) [13-17]. Under tumorigenese, ekspressionen af ​​specifikke PK isoenzymer, f.eks PK-M1 i hjernen og PK-L i leveren, forsvinder og PKM2 ekspression fremherskende [18]. PKM2 ekspression kan oscillere mellem den meget aktive tetramere isoform og den næsten inaktive dimere isoform, afhængigt af den cellulære efterspørgsel af energi eller fremstille anabolske mellemprodukter til celleproliferation. Den tetramere isoform af PKM2 udtrykkes overvejende i normale celler, mens dens dimere isoform normalt findes i tumorceller, deraf navnet tumor PKM2 [11,14,19].

En anden nedstrøms komponent i den glycolytiske pathway er lactat dehydrogenase a (IdhA) enzym, som er en del af LDH familie af 2-hydroxysyre oxidoreduktaser. LDHs er homo- og hetero- tetramere enzymer bestående af to store underenheder, A og B, hvilket resulterer i fem isoenzymer, der katalyserer den reversible omdannelse af pyruvat og lactat. IdhA (også kendt som LDH-5, LDH-M eller A4) er kodet af

LDH-en

gen og dominerer i skeletmuskel og lever, mens LDHB (også kendt som LDH-1, LDH-H eller B4) er kodet af

LDH-b

gen og findes hovedsageligt i hjertet og hjernen [20-24]. LDH-C består hovedsagelig af X-subunits og findes i humane spermatozoer [22,25]. IdhA katalyserer omdannelsen af ​​pyruvat til lactat med regenerering af NAD

+ for at fortsætte produktionen energi ved glykolyse [26-29]. Lactat produceret af IdhA anvendes som et alternativt brændstof ved hjælp af celler, der støder op til blodkar, og glucose er sparet for fjernere celler, som er hypoksisk.

Overekspression af PKM2 eller IdhA er rapporteret i væv af en antal kræfttilfælde, herunder cholangiocarcinoma, colorectal cancer, ikke-småcellet lungekræft og kræft i bugspytkirtlen. Overekspression er associeret med tumor initiering, progression og resistens mod kemoterapi [27,30-32]. I teorien kan ekspressionsprofilen af ​​disse enzymer også repræsentere nyttige diagnostiske eller prognostiske markører i pancreascancer [15,23,33]. Salg

CD8 + T-celler (cytotoksiske T-lymfocytter) er en vigtig undergruppe af tumorinfiltrerende lymfocytter at spille en central rolle i immunresponset anti-tumor. Immunhistokemi undersøgelser har vist en antitumorvirkning af infiltrerende CD8 + -lymfocytter, med forbedrede overlevelsesrater for patienter med pancreas, lunge, ovarie, colorectal, nyre- og øsofageale tumorer [34-39], og en direkte sammenhæng mellem stigende antal CD8 + tumorinfiltrerende lymfocytter (tils) og tumor celle apoptose [40,41].

Formålet med vores undersøgelse var at evaluere udtryk for PKM2 og IdhA i pancreas præneoplastiske læsioner (cyster og pancreas intraepitelialneoplasi, Panin) og kræft og at korrelere det med patientens udfald. Eftersom PKM2 og IdhA er involveret i flere celleproliferation signalveje [42], undersøgte vi også, om ekspressionen af ​​disse glycolytiske enzymer korrelerede med antallet af CD8 + TIL’er og markører for tumor proliferation (Ki-67).

Materialer og metoder

patienter

Denne undersøgelse omfattede pancreas biopsi eller kirurgisk resektion prøver fra 266 patienter; 136 fra University College London Hospital NHS Foundation Trust (UCLH) og en anden 130 fra en kommercielt tilgængelig væv microarray (TMA’er) (AccuMaxArray, ISU ABXIS CO., LTD, USA, og Insight Biotechnology Limited, UK). Den UCLH kohorte bestod af 136 patienter med bekræftet bugspytkirtlen duktalt adenokarcinom (PDAC) (n = 61), ampullary adenocarcinom (n = 11), pancreas cystiske læsioner (n = 49), kronisk betændelse i bugspytkirtlen (n = 11) og normal pancreas væv ( n = 4). Disse patienter var blevet behandlet på UCLH mellem januar 2005 og januar 2010. En klinisk database over UCLH patienterne blev skabt gennem CoPath histologi database, som omfattede følgende klinisk-patologiske parametre: køn, alder ved diagnose, prøve typen (biopsi eller resektion), type svulst (ampullary eller ductal), udfald (levende eller død), dødsårsag, længde af opfølgning, hvis live, tilstedeværelse eller fravær af metastatisk sygdom på tidspunktet for histologisk diagnose, uanset om resektion blev gennemført, residual sygdom ( R) status, post-resektion tilbagefald, tid til post-resektion tilbagefald (hvis nogen), kræft stadium, lymfekirtelinvolvering, tilstedeværelse af perineural eller lymphovascular invasion, graden af ​​tumor differentiering, og om patienter modtog kemoterapi (tabel 1). Alle data blev indsamlet fra datoen for histologisk diagnose til dødsdagen eller slutningen af ​​dataindsamlingen den 1. februar 2015. Etik godkendelse komité blev opnået fra det centrale London REC 3 Research etiske komité til at udføre immunhistokemi på lagrede biopsi og resektion prøver knyttet med en klinisk database med behovet for samtykke frafaldes (REC henvisning 06 /Q0512 /106, ændring dato 30 juli 2010). Alle patientprøver blev anonymiseret og de-identificeret før analyse.

Tissue microarray

En anden validering sæt 130 vævsprøver var afledt af kommercielt tilgængelig bugspytkirtlen TMAs. I alt 206 væv borekerner fra 130 patienter (83 mænd, 47 kvinder, median alder 59, rækkevidde 32-80 år) var til stede på TMAs, som omfattede 63 tilfælde af PDAC i to eksemplarer, 19 Panin (10 Panin-1, 7 Panin-2 og 2 Panin-3), 10 kronisk pancreatitis og 38 normale pancreasvæv kerner. Histologisk diagnose af alle tilfælde blev verificeret ved hæmatoxylin og eosin-farvning. Kliniske data med TMA’erne inkluderet tumorstørrelse og stadium grad af tumor differentiering, lymfeknudeinvolvering, metastatiske status og tumor-sites.

Immunhistokemi

Standard immunhistokemi metoder blev anvendt til at detektere ekspressionen af PKM2, IdhA, CD8 og Ki-67. Kort beskrevet paraffinindlejrede snit blev forvarmet i en ovn i 30 minutter ved 60 ° C, og derefter deparaffinised i xylen og hydreret gennem en række gradueret ethanol (70% -95%). Sektionerne blev underkastet varme-medieret antigen-genvinding med citratbuffer (pH 4,0) i en autoklave. Endogen peroxidaseaktivitet blev inhiberet med 3% hydrogenperoxid i 20 minutter, efterfulgt af inkubation med 2,5% normalt hest blokerende serum i 20 minutter. Snittene blev derefter inkuberet med primært antistof i en time ved stuetemperatur i CD8 (CD8a Polyklonalt antistof, Abnova, UK, Cat # PAB11235, 1: 200) og Ki-67 (Polyklonalt til Ki-67, Abcam, UK, Cat # ab15580, 1: 300), og natten over ved 4 ° C i PKM2 (mus monoklonale anti-humant og rotte PKM2, ScheBo®Biotech, Giessen, Tyskland, Cat # S-1, 1: 100) og IdhA (IdhA /LDHC (C28H7) Kanin Monoklonalt antistof, Cell Signaling, UK, Cat # 3558, 1: 250) i PBS. Efter tre vaske med PBS indeholdende 0,5% Tween 20 blev sektionerne inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof i 30 minutter. Primært antistof blev påvist under anvendelse af 3, 3′-diaminobenzidin (DAB) eller 3-amino-9-ethyl-carbazol (AEC) detektionssystem kit. Snittene blev anbragt i hæmatoxylin i 3 minutter, derefter forsigtigt vasket og monteret.

Dobbelt immunhistokemi

En dobbelt immunfarvning kit (Picture dobbelt farvning kit, Invitrogen, UK) blev anvendt til co-lokalisering af PKM2 og CD8 eller Ki-67. Kort fortalt blev to forskellige enzymsystemer detektionssystemer anvendes til sekventiel dobbelt farvning med indledende anvendelse af peberrodsperoxidase-system efterfulgt af alkalisk phosphat-systemet. Snit blev inkuberet med anti-PKM2 primært antistof og HRP sekundært antistof og visualisering blev udviklet med DAB detektionssystem. Efter dette trin blev snit vasket med PBS, inkuberet med blokerende serum, efterfulgt af primært antistof (anti-CD8 eller Ki-67) og gede anti-kanin IgG alkalisk phosphatase sekundært antistof. Farve blev udviklet af hurtig rød med tæller farvning af hæmatoxylin.

Evaluering af immunhistokemi farvning

Immunhistokemi blev evalueret ved hjælp af en konference lysmikroskop (AXIO Anvendelsesområde, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Tyskland). blev udført Vurderingen af ​​de immunofarves glider uafhængigt af to observatører, blindede til patient baggrundsinformation, og forskelle mellem de observatører blev løst ved hjælp af en konference mikroskop. En omfattende scoring formel blev anvendt til den semi-kvantitativ vurdering af PKM2 ekspression som beskrevet tidligere [43], med intensiteten af ​​farvning scoret som: 1, svag ekspression; 2, moderat udtryk; eller 3, stærkt udtryk; omfanget af farvning scorede som 1, 33% af tumorcellerne positiv; 2, 33-67% af tumorcellerne positive eller; 3, 67% af tumorcellerne positive. intensitet og omfang scorer blev derefter multipliceret til opnåelse af en enkelt skala fra snesevis af 1, 2, 3, 4, 6, og 9 Pointene for 1-3 blev defineret som svag (eller negativ) farvning, hvorimod scorer 4, 6 og 9 blev betragtet som stærkt (eller positiv) farvning.

antallet af CD8 + TIL’er og Ki-67 positive tumorceller blev også talt uafhængigt af to observatører. I første omgang blev det hele dias scannet ved lav forstørrelse (x40) for at identificere regionen med den højeste koncentration af intratumoral CD8 eller Ki-67-positive tumorceller og derefter fem tilfældige områder inden for denne region blev talt ved stor forstørrelse (x400). Det gennemsnitlige antal CD8 + TIL’er blev beregnet og udtrykt som tæller pr høj effekt felt (HPF). Celleproliferationen index (PI) blev udtrykt som en procentdel af antallet af kerner farves positive for Ki-67 blandt 1000 tumorceller ved anvendelse af en standardiseret gitter.

Cellekulturer Salg

Nine human pancreascancer cellelinier blev indkøbt fra Riken Bioresource Centre (Riken BRC, Tsukuba, Japan) og BxPc-3 cellelinien blev fremskaffet fra PerknElmer (Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA, USA). PANC-1, PK-1, PK-59, PK-45H, PK45P, KLM-1, NOR-P1 og BxPc-3 blev opretholdt i RPMI-1640, MiaPaCa-2 i DMED og KP-4 i DMEM /F12 medium . Alle medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin og 2 mM glutamin (Gibco, Life Technologies, UK). Celler blev holdt i en fugtig atmosfære af 21% O

2, 5% CO

2 ved 37 ° C og høstet med trypsin-EDTA.

Western Blot

PKM2 og IdhA ekspression blev evalueret i bugspytkirtelkræft cellelinjer ved Western Blotting. Kort fortalt, efter protein ekstraktion blev proteinkoncentrationen målt ved bicinchoninsyre (BCA) assay og 15 pg protein blev kørt på en præ-støbt gel (NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 1.0mm, 10 brønde gel, Invitrogen, USA) og overført til en 0,45 um porestørrelse Polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Invitrogen, USA). Membranen blev blokeret med 5% bovint serumalbumin (BSA) opløsning og inkuberet natten over ved 4 ° C med enten muse-anti-PKM2 (DF-4, ScheBo®Biotech, Giessen, Tyskland, 1: 1000) eller kanin-anti-IdhA antistof (Cell Signaling, UK, 1: 1000), og derefter inkuberet med passende peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (Cell Signaling, UK, 1: 2000). Antigenet antistof-reaktion blev detekteret ved forøget kemiluminescens-substrat (Thermo Scientific, USA). Anti-β-actin-antistof (Cell Signaling, UK) blev anvendt som et protein loading kontrol.

Statistisk analyse

IBM SPSS statistisk software (Version 22, SPSS Inc., Chicago, IL, USA ) blev anvendt til analyse og grafik data. Kaplan-Meier plots og log-rank test blev anvendt til at analysere overlevelse og til at identificere forskelle mellem grupperne. Envejs-ANOVA med Bonferroni post-hoc test blev anvendt til generel sammenligning af flere grupper, med Mann-Whitney U-test for parametriske test og Chi square test for forskelle mellem kategoriske data. Ikke-parametrisk korrelation analyser mellem to kontinuerlige variabler blev udført ved Spearman test. Alle testresultater var to-sidede, med effekter opsummeret bruger 95% konfidensintervaller. Statistisk signifikans blev sat til p. 0,05

Resultater

Angivelse af PKM2 og IdhA i bugspytkirtelkræft

Både PKM2 og IdhA blev overudtrykt i tumorceller forhold til den normale pancreas væv . En variabel ekspressionsmønster af PKM2 blev observeret i tumorvæv, med relativt højere ekspression i dårligt differentieret områder, i at fremme tilknytning tumornoduli og i invasive (muskel- og blodkar) tumorer (Fig 1A, 1B, 1E og 1F). Samlet set blev PKM2 udtryk overvejende forbundet med aggressive tumorer. Præferentiel ekspression af PKM2 blev observeret i binucleated prolifererende celler i tumorknuder (Fig 1D). Ekspression af PKM2 blev bemærket i alle cellekamrene, herunder cellemembranen, cytoplasmaet og /eller kernen (Fig 1C og 1F). I modsætning hertil IdhA ekspression var generelt høj i tumoren samt i præneoplastiske væv og pancreatitis uden et specifikt mønster (figur 2). IdhA ekspression blev også påvist i cellemembranen og /eller cytoplasma og undertiden i kernen.

(A) Well differentieret område af tumor, der viser svag PKM2 ekspression (rød pil), med høj ekspression i ringe differentierede områder ( brun farve, gul pil) (x100 forstørrelse). (B) Stigende margen på tumorknuder med stærk ekspression af PKM2 (rød pil) (x100 forstørrelse). (C) membranøs ekspression af PKM2 (rød pil) (x200 forstørrelse). (D) Heterogen ekspression af PKM2 med fremherskende ekspression i de prolifererende celler (rød pil) (x200 forstørrelse). (E) stærkt positiv tumor ekspression af PKM2 i vaskulær invasion (rød pil) (x100 forstørrelse). (F) Stærkt positiv tumor udtryk for PKM2 med muskulær invasion (rød pil) (x100 forstørrelse).

(A) membranøs udtryk for IdhA (x200 forstørrelse). (B) Cytoplasmisk og nuklear udtryk (x200 forstørrelse). (C) Kraftig ekspression i pancreas cyste med mild ekspression i det omgivende normale pancreasvæv (x50 forstørrelse). (D) Nuklear udtryk for IdhA i bugspytkirtelkræft (x100 forstørrelse). (E) Stærk udtryk i Panin læsion (x100 forstørrelse). . (F) Negativ farvning i normal bugspytkirtlen (x100 forstørrelse)

Lignende udtryk for PKM2 og IdhA blev observeret i UCLH kohorten og TMA prøver, med en farvning score på 3 i 64% og 73% af tumorer, henholdsvis for PKM2, og i 76% af tumorer for IdhA i begge kohorter. Ekspressionsmønsteret i de Langerhanske cancercellelinier var ens for både PKM2 og IdhA, undtagen i KP4 cellelinien, hvori IdhA niveau var stærkere end PKM2 niveau (figur 3). I begge kohorter, pancreatitis prøver også højt udtrykt IdhA sammenlignet med PKM2 ekspression (figur 4).

immunfarvning af MiaPaCa-2-celler med PKM2 (A) og IdhA (B) er vist i det nederste panel. Stærk cytoplasmatisk og nuklear farvning bemærkes i prolifererende celler

PKM2 var stærkt udtrykt af kræft i bugspytkirtlen vævsprøver og var betydeligt højere end i normalt, pancreatitis, pancreas cyster og Panin væv (P 0,001).. Ekspression af IdhA var signifikant højere i bugspytkirtelkræft end i normal bugspytkirtlen (P 0,001)., Mens der var ingen signifikante forskelle i IdhA udtryk mellem kræft i bugspytkirtlen, Panin, pancreas cyster og pancreatitis

Som vist i figur 4, blev gradvist højere PKM2 udtryk observeret langs overgangen til kræft i bugspytkirtlen, med den laveste udtryk i pancreas cyster (19%), mellemprodukt i Panin (37%) og højest i kræft (68%). PKM2 ekspression var ca. fire gange højere i pancreatitis (29%) sammenlignet med normalt pancreasvæv. Selv IdhA udtryk var også signifikant forøget i kræft forhold til den normale pancreas væv (p 0,0001, ANOVA), var der ingen signifikante forskelle mellem kronisk betændelse i bugspytkirtlen, pancreas cyster, Panin og kræft prøver (67%, 59%, 73% og 76 %, henholdsvis).

PKM2 og IdhA udtryk i bugspytkirtelkræft cellelinjer

Ved Western blotting, høj ekspression af PKM2 og IdhA blev påvist i 8 og 9 ud af de 10 bugspytkirtelkræft cellelinjer (figur 3). Ekspressionsniveauet af PKM2 og IdhA svarede i alle cellelinier undtagen i KP4 hvor PKM2 niveau var svagere end IdhA niveau. Ved immunhistokemi, både PKM2 og IdhA havde stærk cytoplasmatisk og nuklear udtryk (figur 3).

Association med klinisk-patologiske parametre

Sammenhængen mellem PKM2 og IdhA udtryk med klinisk-patologiske krav, er vist i tabel 1. Der var en signifikant omvendt korrelation mellem PKM2 udtryk og tumor differentiering i UCLH kohorte, med 83% af PKM2 positive tumorer er mindre differentieret i forhold til 64% af PKM2 negative tumorer (p = 0,047, Chi-square test) (data ikke vist) .

en signifikant højere antal CD8 + tIL blev fundet i tumorer med svag PKM2 eller IdhA udtryk sammenlignet med tumorer, der havde et stærkt udtryk (p = 0,0001, p = 0,005 henholdsvis tabel 1). Desuden blev en signifikant sammenhæng mellem tumorcelleproliferation og udtryk både PKM2 og IdhA overholdes; antallet af tumor kerner udtrykker Ki-67 var mere end 2 gange højere i PKM2 og IdhA udtrykkende tumorer sammenlignet med negative tumorer (PKM2: 27,8 ± 12,9 vs. 12,2 ± 14, p = 0,0001 og IdhA: 25,1 ± 14 vs. 12.3 ± 15,1, p = 0,004). Når farvning scoringer blev CD8 + TIL tælle og antallet af Ki-67 positive celler betragtes som kontinuerlige variabler blev en signifikant omvendt korrelation mellem farvende scorer og CD8 + celletal observeret (PKM2: p 0,001 og IdhA: p = 0,004, Spearman rang korrelation). En væsentlig direkte korrelation bemærket mellem farvning scorer og Ki-67 count (PKM2: p 0,001 og IdhA: p = 0,001, Spearman rank korrelation test) (figur 5 og 6). I TMA kohorte, ekspressionen af ​​PKM2 og IdhA korreleret med tumorstørrelse. PKM2 ekspression blev observeret i 54,5%, 77,8% og 90,9% af tumorer, der var ≤ 2,5, 2.6-3.9 og ≥ 4 cm i størrelse, hhv. Positive IdhA ekspression blev fundet i 59,1%, 77,8% og 100% i tumorer, der var ≤ 2,5, 2,6 til 3,9 og ≥ 4 cm i størrelse, hhv. Der var ingen signifikante forskelle mellem PKM2 eller IdhA udtryk og tumor placering, lymfeknude involvering, T-scene og metastatisk status.

(A) Nå differentierede tumorer med negativ PKM2 udtryk havde stærke infiltration af CD8 + positive T-lymfocytter (x200 forstørrelse). (B) Dårligt differentierede tumorer stærkt positive for PKM2 havde sparsomme infiltration af CD8 + positive T-lymfocytter (x200 forstørrelse). Der var en signifikant negativ korrelation mellem CD8 + positive celler og både PKM2 (C) (D) og IdhA farvning (E) (F).

(A) Tumorer med stærkt positiv PKM2 udtryk havde kernen farvet for Ki-67 (x100 forstørrelse). (B) Tumorer svagt positive for PKM2 havde sparsomme Ki67 farvning (x100 forstørrelse). (C) (D) Korrelation mellem PKM2 farvning og Ki-67 positive celler. (E) (F) Sammenhæng mellem IdhA farvning og Ki-67 positive celler. Der var en signifikant sammenhæng for både PKM2 og IdhA.

Sammenhæng mellem PKM2 og IdhA udtryk og patientoverlevelse

Vi næste undersøgt, om udtryk profil PKM2 og IdhA forudsagt overlevelse. Patienter med tumorer scorer 3 for PKM2 eller IdhA udtryk havde signifikant dårligere overlevelse sammenlignet med dem, der svagt udtrykt PKM2 og /eller IdhA. Af de 72 bugspytkirtelkræft prøver (UCLH kohorte), 46 (64%) kraftigt udtrykt PKM2 og disse patienter havde en median overlevelse på kun 8,9 måneder sammenlignet med 28,9 måneder i de 26 (36%) patienter med svag (negativ) PKM2 tumor udtryk (p = 0,016, log-rank test, figur 7). Ligeledes 55 (76,4%) patienter med positiv IdhA tumor udtryk havde en median overlevelse på 10,9 måneder sammenlignet med 34,5 måneder for de 17 (23,6%) patienter med svag (negativ) IdhA tumor udtryk (p = 0,029, log-rank test, fig 7). Desuden, når ekspressionen profil PKM2 og IdhA blev kombineret, overlevelsen af ​​patienter med negativ ekspression for begge eller positive for en var fire gange længere end dem med en positiv status for både (27.9 måneder vs 7,0 måneder, henholdsvis p = 0,003, log rank test). Blandt de mange overlevelse prædiktorer ved univariate analyse (T-stadiet; p = 0,006, tumor differentiering; p = 0,003, metastatisk status; p = 0,000), af Cox regressionsanalyse kun den kombinerede PKM2 /IdhA ekspression status og tumor differentieringsstatusen var uafhængige overlevelse prædiktorer (p = 0,003, Hazard ratio (HR) = 4,96 og p = 0,015, HR = 3,31, henholdsvis) (tabel i S1 tabel).

Både PKM2 (A) og IdhA (B) havde en betydelig prognostisk indvirkning på patientens overlevelse (p = 0,016, 0,029, log rank test, henholdsvis) og den kombinerede ekspression for begge markører yderligere stratificeret patienterne (C) (p = 0,003, logaritmisk rangeret test). Som forventet, patienter, som gennemgik kirurgisk resektion havde en længere overlevelse end unresected patienter.

Derudover 27 af de 72 patienter (UCLH kohorte) gennemgik kirurgisk resektion for PDAC (n = 16) eller ampullary adenocarcinom ( n = 11). De, der gennemgik kirurgisk resektion havde en signifikant længere overlevelse end dem, der ikke opereres (26,5 vs 7,0 måneder, P 0,0001; log rank test). Som forventet, patienter med ampullary adenocarcinom havde en bedre prognose efter operation end dem med PDAC, med 5 af 11 (45,5%) ampullary carcinom patienter i live efter sidste kontakt, sammenlignet med kun 1 ud af 16 (6,3%) patienter med PDAC (P & lt 0,0001, log rank test)

diskussion

der er stigende tegn på, at kræftcellerne har forhøjet glukoseoptagelse med en samtidig stigning i laktat produktion gennem sekventielle katalytisk enzym medierede processer [44,45]. . PKM2 og IdhA er to afgørende glycolytiske enzymer, der letter disse processer til at give kræftceller med en vækst fordel over normale celler. Til dato har serum PKM2 blevet identificeret som en diagnostisk og prognostisk markør med sammenlignelig sensitivitet og specificitet til serum CA19-9 markør i bugspytkirtelkræft [46-48]. Men der er begrænsede data om udtrykket mønster og prognostisk betydning af PKM2 og IdhA i bugspytkirtelkræft [32,49,50]. Så vidt vi ved, vores undersøgelse er den første til at evaluere den prognostiske virkning af kombineret PKM2 og IdhA ekspression i initiering og progression af pancreascancer. En nylig undersøgelse viste overekspression og phosphorylering af begge disse enzymer i kræft i skjoldbruskkirtlen sammenlignet med godartet struma [51]. Vores resultater er enig med deres resultater viser signifikant overekspression af PKM2 og IdhA i pancreascancer forhold til den normale bugspytkirtlen væv.

trinvise initiering og udvikling af kræft i bugspytkirtlen begynder ofte med pancreatitis, duktalt metaplasi, cyste dannelse eller Panin læsioner, der fører til pancreascancer. Interessant, vores resultater viser overekspression af IdhA på et meget tidligt tidspunkt langs carcinogene vej fra pancreatitis gennem cyste /Panin til kræft med det højeste udtryk i de mest aggressive tumorer. I modsætning hertil PKM2 udtryk steg progressivt langs overgangen til kræft i bugspytkirtlen og var lavest i cyster, mellemprodukt i Panin læsioner og højest i kræft. Selv om den nøjagtige mekanisme af denne differentielle ekspression mønster er endnu ikke klarlagt, er det muligt, at præ-neoplastiske læsioner erhverve den glycolytiske fænotype gennem IdhA overekspression og derefter IdhA selv eller andre onkogener inducerer PKM2 overekspression på senere stadier, når tumorcelleproliferation er højere . Faktisk har det for nylig blevet vist, at epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) inducerer β-catenin transaktivering og c-myc ekspression, opregulering IdhA, som igen inducerer opregulering af PKM2 ekspression ved skiftevis splejsning af genet fra M1 til M2 typen [52]. Disse fund kan delvist forklare den konsekvent overekspression af IdhA hele tumorigen proces og den gradvise overekspression af PKM2 langs carcinogene vej. Ekspressionen og enzymatiske aktivitet af IdhA og PKM2 kan også moduleres ved tyrosinphosphorylering ved forskellige rester (Y10 og Y105, henholdsvis) ved den onkogene tyrosinkinase fibroblastvækstfaktorreceptor-1 [53]. Den differentielle ekspression mønster antyder, at PKM2 (eller en kombination af PKM2 og IdhA) ville være et bedre valg til at skelne kræft fra præ-neoplastiske læsioner sammenlignet med IdhA alene, undtagen i pancreatitis hvor begge markører højt udtrykt.

Behandling kræft i bugspytkirtlen er meget udfordrende på grund af sen diagnose, og mangel på passende prognostiske markører og effektive behandlinger. Vores resultater viser, at både PKM2 eller IdhA er betydelige prognostiske markører i bugspytkirtelkræft og kombinationen giver en forbedret lagdeling af resultatet. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere udgivelser viser en signifikant prognostisk effekt af IdhA eller PKM2 ved andre tumorer, herunder pladecellekræft, cholangiocarcinom og gastrisk kræft [43,54,55]. De nøjagtige mekanismer, der er forbundet med overekspression af PKM2 og IdhA der fører til dårlig prognose er fortsat uklare. For ganske nylig Rajeshkumar et al (2015) fandt, at IdhA lille molekyle inhibitor FX11 kan hæmme tumorvækst, reducere tumorcelleproliferation og inducere apoptose i en patient-afledt muse xenotransplantationsmodel af pancreascancer med mutant TP53, mens tumorer huser vildtype TP53 var fuldstændig resistente over for FX11 [56].

kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de mere aggressive tumortyper, med en meget dårlig samlede overlevelse. Resultaterne af vores undersøgelse viser tydeligt opregulering af både PKM2 og IdhA i bugspytkirtelkræft og implicerer høj ekspression af disse to glycolytiske enzymer i udvikling og progression af kræft i bugspytkirtlen gennem øget proliferation, migration, invasion og angiogenese.