PLoS ONE: SIRT3 Forbedrer Glycolysis og spredning i SIRT3-udtrykkende mavekræft Cells

Abstrakt

SIRT3 er et centralt NAD

+ – afhængig protein deacetylase i mitokondrier af pattedyrceller, der fungerer for at forhindre celle aldring og transformation via regulering af mitokondrie metaboliske homeostase. Imidlertid er SIRT3 også fundet at udtrykke i nogle humane tumorer; skal belyses dets rolle i disse SIRT3-udtrykkende tumorceller. Denne undersøgelse viste, at ekspressionen af ​​SIRT3 var forhøjet i en gruppe af gastriske cancerceller sammenlignet med normale gastriske epitelceller. Selvom SIRT3 ekspressionsniveauer blev forøget i de gastriske tumorvæv sammenlignet med de tilstødende ikke-tumorvæv, SIRT3 positive cancerceller var hyppigere påvist i de intestinale gastriske cancere end de diffuse gastriske cancere, hvilket indikerer, at SIRT3 er forbundet med undertyper af gastrisk kræft. Overekspression af SIRT3 fremmet celleproliferation og forbedret ATP generation, glucoseoptagelse, glycogendannelse, MnSOD aktivitet og laktat produktion, der blev inhiberet af SIRT3 knockdown, hvilket indikerer, at SIRT3 spiller en rolle i at omprogrammere bioenergetik i gastriske tumorceller. Yderligere analyse afslørede, at SIRT3 interageret med og deacetyleret lactat dehydrogenase A (IdhA), en central protein i regulering anaerob glycolyse, øge IdhA aktivitet. I konsistens blev en klynge af glycolyse-associerede gener opreguleres i SIRT3-overudtrykkende gastriske tumorceller. Således, ud over de veldokumenterede SIRT3-medieret mitokondrie homeostase i normale celler, kan SIRT3 forbedre glykolyse og celleproliferation i SIRT3-udtrykkende cancerceller

Henvisning:. Cui Y, Qin L, Wu, J., Qu X, Hou C, Sun W, et al. (2015) SIRT3 Forbedrer Glycolysis og spredning i SIRT3-udtrykkende Gastrisk cancerceller. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10,1371 /journal.pone.0129834

Redaktør: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA

Modtaget: 16. april, 2015; Accepteret: 13. maj 2015; Udgivet: 29 juni 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af National Natural Science Foundation of China, Key Program (30930105), National 12-5 Support Plan Projekt for Ministeriet for Videnskab og Teknologi Kina (2012BAH30F03), National Natural Science Foundation of China (31.070.740), den 985 og 211 projekter af Xi’an Jiaotong Universitet (JKL), og National Cancer Institute RO1 tilskud CA152313-01-A1 (JJL).

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

sirtuins, en familie af NAD

+ – afhængige histondeacetylaser (HDAC) i pattedyr celler, er impliceret i en lang række fysiske processer, herunder celleoverlevelse, apoptose, metabolisme, stress reaktioner, aldring og levetid [1,2]. Blandt syv sirtuin medlemmer (SIRT1-7), SIRT3 er den bedst karakteriserede mitokondrie sirtuin, funktion at regulere mitokondrielle proteiner involveret i oxidativ phosphorylering, fedtsyreoxidation, urinstofcyklus, og antioxidanten respons [2-9]. Adskillige undersøgelser har understreget den rolle, SIRT3 i metabolisme og homeostase i normale celler og afslørede nye mål og substrater for SIRT3-afhængig deacetylering [10]. Kim et al rapporterede, at SIRT3 er et centralt mitokondrier protein, og mangel på den SIRT3 ekspression er forbundet med øget mitokondrie-DNA beskadigelse og ældning, samt øget potentiale til Ras-induceret celletransformation og SIRT3-medieret MnSOD aktivering bidrager til mitokondrielle homeostase [11,12]. Til støtte, humane embryonale nyre 293-celler (HEK293) celler udviser en forøget SIRT3 ekspression under oxidativt stress, hvilket fører til deacetylering og aktivering af MnSOD [13]. SIRT3 menes at fungere som et tumorsuppressorgen og spiller en central rolle for forøgelse cellehomeostase mod aldring og carcinogenese.

Men nogle tumorceller viser ekspressionen af ​​SIRT3 og potentielle rolle SIRT3 i disse tumorceller , især dens potentielle forhold til den aggressive fænotype, har været kontroversiel [14]. SIRT3 ekspression er lavere eller uopdaget i et array af humane cancere, herunder brystcancer, glioblastom, coloncancer, og osteosarkom, prostata og ovariecancere [11,15,16]. SIRT3 inducerer vækststandsning og apoptose ved selektiv inaktivering af Bcl-2 i HCT116 celler gennem modulering JNK2 signalvej [17]. Desuden er SIRT3 rapporteret at bidrage til øget følsomhed af humane leukæmiceller til kemoterapi eventuelt gennem induktion af mitokondrier-medieret apoptose [18]. På den anden side, SIRT3 ekspression findes også øges i oral cancer, lymfeknude-positiv brystkræft, kræft i spiserøret, og thyroide carcinomer; og den øgede SIRT3 er forbundet med højere malign fænotype og nedregulering af SIRT3 forbedrer tumor følsomhed over for anti-cancerbehandling [19-23]. Disse resultater advare en anden rolle i SIRT3 i specifikke tumorer, der skal være belyst.

Kræftceller er metabolisk aktive og forbruge mere cellulære brændstof end normale celler. Men kræftceller relay på primært på ATP-syntese ved aerob glycolyse, en funktion kaldet Warburg virkning [24]. En sådan aerob glykolyse menes at beskytte kræftceller danner oxidativ stress, da mitokondrie respiration er den vigtigste kilde til intracellulær ROS [25]. Lactat dehydrogenase A (IdhA) er et enzym kontrollerende interomdannelse mellem pyruvat og L-lactat reversibelt ved det endelige trin af anaerob glycolyse [26]. Inhibering af IdhA formindsker tumorigent potentiale med forøget mitokondriel iltforbrug og nedsat mitokondriske membranpotentiale [26] og samlet cellulær ATP-produktion og glycolyse [27].

I denne undersøgelse undersøgte vi potentielle rolle SIRT3 i gastrisk cancerceller, som udtrykker SIRT3. Ekspression af SIRT3 var forbundet med den aggressive vækst, som blev medieret via SIRT3-deacetyleret og aktiveret IdhA, øge glycolyse og ekspression af en gruppe af glycolyse-associerede gener. Således SIRT3-IdhA-medieret glykolyse metabolisme kan være en potentiel terapeutisk mål til behandling af kræftceller, der udtrykker SIRT3.

Materialer og metoder

cellelinjer og kultur

Menneskelig mavekræft cellelinier MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] og AGS [29] og immortaliseret human gastrisk epitelcellelinie GES-1 [30] blev holdt i RPMI-1640-medium (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin, og dyrket ved 37 ° C under en atmosfære af 5% CO2.

Immunopræcipitation og western blot

Subkonfluente celler blev lyseret, og lysaterne blev inkuberet med protein A /G agaroseperler plus den anbefalede mængde af antistoffer mod enten SIRT3 (Cell Signaling Technology) eller IdhA (Santa Cruze) ved 4 ° C natten over. Prøverne blev centrifugeret og separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese og elektroblottet over på nitrocellulosemembraner. Efter blokering med 5% fedtfri mælk i TBST blev membranerne inkuberet med primært antistof ved 4 ° C natten over efterfulgt af inkubation med sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Proteiner af interesse blev visualiseret ved ECL påvisning kit (Thermo Fisher).

Immunhistokemi assay

Patologiske lysbilleder af mavekræft med tilstødende normale væv blev analyseret ved immunohistokemi assay blev udført ved at følge producentens instruktioner. Den Polymer Detection kit til immunhistokemi analyse blev købt fra Zhongshan Golden Bridge Bioteknologi. Kort fortalt blev paraffinsnit afvokset og re-hydreret i ethanol (100%, 90% og 75%). Snittene blev inkuberet med 3% H

2O

2 ved stuetemperatur i 10 minutter og derefter blokeret med ikke-immunt gedeserum ved stuetemperatur i 15 minutter. Snittene blev derefter inkuberet med primært antistof til SIRT3 (Cell Signaling Technology) i 2 timer ved stuetemperatur efterfulgt af anti-kanin sekundært antistof inkubation i 15 minutter ved stuetemperatur. Snittene blev derefter inkuberet med DAB påvisningsreagens i 2 minutter hver, modfarvet med hematoxylin og dehydraded i ethanol (90% og 100%). Snittene blev monteret og farvningen blev analyseret under mikroskopi. Salg

Plasmid konstruktion og celle transfektions- Salg

SIRT3 hele længde cDNA blev syntetiseret under anvendelse af RT-PCR med total RNA ekstraheret fra GES-1-celler som skabelon (primere: 5’CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3 ‘og 5’ CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3 ‘). CDNA’et blev derefter klonet ind i pcDNA3.1 + ekspressionsvektor (Invitrogen). Den pGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNA plasmid rettet mod menneskelige SIRT3 (5 ‘CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3’) og kontrollen shRNA plasmidet blev opnået fra GenePharma. For at generere stabile transfektanter blev AGS og SGC-7901-celler transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen), og de stabile transfektanter blev udvalgt ved 400ug /ml G418 (Gibco).

Cell spredning og clonogenicity assay

i proliferationsassay blev celler udpladet i en 6-brønds plade ved 2 x 10

4 celler /brønd. Celleproliferation blev beregnet på dag 2, 4, 6, og 8 efter plating. For clonogenicity assay blev cellerne udpladet i en 6-brønds plade med varieret celleantal og dyrket i 14 dage og kolonier blev derefter farvet med krystalviolet, og antallet af kolonier ( 50 celler /koloni) blev talt efter etablerede metoder [31].

Måling af glucose, lactat og glycogen

phenolrødt frit medium blev anvendt til at dyrke celler i 6-brønds plade i 24 timer og niveauet af glukoseoptagelse og lactat generation blev målt ved anvendelse af Glucose Assay Kit og mælkesyre Kit (Jiancheng Bioengineering Institute). De relative værdier blev normaliseret til celleantal af hver brønd. Cellulære glycogenniveauerne blev påvist under anvendelse af Glycogen Assay Kit (BioVision). Kort fortalt, 1 x 10

6 celler blev homogeniseret i 200 pi vand på is, og homogenaterne blev kogt i 5 minutter for at inaktivere enzymerne og centrifugeret ved 13.000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C for at fjerne uopløseligt materiale. Den glykogen produktion blev målt med OD-værdien ved 570 nm.

Måling af ATP produktion

Cellular ATP og ROS niveauer blev målt som beskrevet tidligere [32]. Celler dyrket i en plade med 6 brønde efter forskellige behandlinger, blev lyseret og cellulære ATP-niveauer blev målt med ATP bioluminscensassayet Kit (Sigma). Til måling glycolyse-medieret ATP-produktion, blev celler behandlet med 2 pM rotenon i 24 timer, før målingerne.

Måling af ROS-generering

Cellular ROS generation blev analyseret med 5- (og 6-) carboxy-2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFDA) fremgangsmåde under anvendelse af mikroplade-spektrometer (Thermo Fisher) ved 488 nm /530 nm bølgelængde.

MnSOD aktivitet Salg

Celler dyrket i en 6-brønds plade blev lyseret og MnSOD-aktivitet blev bestemt ved WST-8 ved anvendelsen af ​​et MnSOD-assaykit (Beyotime) ifølge producentens instruktioner.

tumorigenicitet assays i nøgne mus

SGC7901 celler (7,5 x 10

6) med SIRT3 overekspression eller knockdown blev suspenderet i 0,1 ml PBS og inokuleret i enten flanke af 5 uger gamle BALB /c athymiske nøgne mus, og ved 28

th dag efter inokulering, når den maksimale tumorvolumen (~ 1500 mm

3) nåede i kontrolgruppen, blev forsøgene afsluttet og alle tumorer fra hver gruppe blev udskåret og vejet. Den eksperimentelle procedure, der omfatter dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer; Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Xian Jiao Tong University specifikt godkendt denne undersøgelse (protokol # 120.181).

Laktatdehydrogenase assay

lactatdehydrogenaseaktivitet blev bestemt efter de etablerede protokol ved måling af nedsættelse i absorbansen ved bølgelængden 340 nm som følge af oxidationen af ​​NADH [27]. Kort fortalt blev celler dyrket i 10 cm skåle og homogeniseret i PBS på is. Homogenaterne blev tilsat til buffer indeholdende 6,6 mM NADH, 30 mM natriumpyruvat og 0,2 M Tris-HCl, pH 7,3 og blandet. Inkuber blandingen i 5 minutter for at opnå temperaturudligning og derefter optage faldet hastigheden for absorbansen ved 340 nm.

SIRT3

in vitro

deacetylering assay

Humant SIRT3 rekombinante enzym ( BPS) blev inkuberet med L-laktatdehydrogenase fra bovine hjerte (Sigma) i reaktionspuffer (50 mM NaCl, 4 mM MgCl

2, 10 mM NAD

+, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8,0) med /uden SIRT3 inhibitor nicotinamid (NAM, 10 mM) ved 37 ° C i 1,5 timer, hvorefter reaktionerne blev anvendt til IdhA aktivitetsassay beskrevet som ovenfor.

Real-time PCR

totalt RNA blev isoleret under anvendelse TRIZOL Reagent (Invitrogen), efterfulgt af behandling med phenol /chloroform og udfældning med 2-propanol. Total RNA pellet blev derefter vasket med 75% ethanol og resuspenderes i vand. RNA blev underkastet revers transkription med PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) og kvantitativ real-time PCR-analyse af gener af interesse blev udført ved anvendelse SYBR PremixExTaq II kit (Takara) ifølge producentens instruktioner. Data blev normaliseret til det niveau af γ-tubulin.

Immunofluorescens

AGS celler podet på dækglasset i en plade med 6 brønde blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter og blokeret i 1% BSA i 1 time ved stuetemperatur. Cellerne inkuberes med primære antistoffer mod SIRT3 og IdhA ved 4 ° C natten over, efterfulgt af inkubation med fluorescens-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Kontrastfarvning blev udført med DAPI hjælp immunofluorescens kit (Beyotime). Celler blev monteret og afbildes af laser scanning konfokal mikroskop.

Statistisk analyse

Data præsenteres som gennemsnit ± SE fra mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev udført med uparret tohalet Students t-test, medmindre andet er angivet.

P

0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

SIRT3 udtryk i gastriske kræftceller

SIRT3 er veldefineret i reguleringen mitokondrie homeostase i anti-aging og anti-transformation. For nylig er forskellige resultater rapporteres om til SIRT3-medieret celle hæmning og spredning, hvilket fører til kontroversen af ​​sine roller i kræft [19,20]. For at bestemme den potentielle rolle SIRT3 i gastrisk kræft, blev opdaget udtryk for SIRT3 i 4 gastrisk cancer cellelinjer AGS, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 og en gruppe af mavekræft tumorvæv. Vi fandt, at SIRT3 proteinniveauer var forhøjet i alle 4 gastrisk cancer cellelinjer sammenlignet med de immortaliserede gastriske epitel GES-1-celler (AGS, 1,9-fold; SGC-7901, 1,5-fold; MGC-803, 2,0-fold; og HGC -27, 1,8 gange sammenlignet med GES-1-celler) (fig 1A). I overensstemmelse blev mRNA-niveauer af SIRT3 i disse cellelinier også forøget (AGS, 2,6-fold; SGC-7901, 1,7-fold; MGC-803, 2,5-fold; HGC-27, 2,2 gange) sammenlignet med GES- 1-celler (fig 1B).

A, SIRT3 proteinniveauer blev bestemt ved western blot i 4 gastriske cancer cellelinjer og en udødeliggjort normal gastrisk epitel cellelinie GES-1 (øvre panel). SIRT3 testet i tre separate western blots proteinekspression blev estimeret ved at måle båndintensitet ved anvendelse Image-Pro Plus software og normaliseret med β-actin (nedre panel). B, SIRT3 mRNA-niveauer blev detekteret ved QRT-PCR i 4 gastriske cancercellelinier. Data blev normaliseret til udødeliggjorte normale gastriske epitelceller. I (A, B), er data præsenteret som middel ± S.E. (N = 3; *,

s

0,05, **,

s

0,01). C, SIRT3 ekspression i humane gastriske tumorvæv (n = 29) og tilstødende ikke-tumorvæv (n = 14) blev påvist ved immunhistokemi farvning. SIRT3 ekspressionsniveauerne blev estimeret ved densitet scanning med Image-Pro Plus software og klassificeret som negative, svagt positive og stærkt positive. Scale bar, 50 um. D, SIRT3 udtryk i tumor og tilstødende ikke-tumorvæv blev præsenteret som en procentdel af patientprøver. E, SIRT3 udtryk i tarm (n = 18) og diffus (n = 11) typer af gastrisk tumorvæv blev præsenteret som en procentdel af patientprøver.

Immunhistokemi analyse i tumor og tilstødende ikke-tumor normal væv fra en gruppe af mavecancerpatienter viste, at SIRT3-positive celler var hyppigere påviselige i tumorvæv end i normalt væv. Resultaterne viste, at 55,1% af tumorvæv (7% af normale væv) udviste højt niveau (stærk positiv), 41,4% af tumorvæv (28% af normale væv) udviste medium højt niveau (svagt positive), mens 3,5% af tumor væv og 64% af normale væv var negativ i SIRT3 ekspression (fig 1C og 1D, S1A fig). Interessant SIRT3 udtryk i tarm type tumorvæv (15 sager, 93,3% stærk positiv og 6,6% svagt positiv) var signifikant højere end i diffust type tumorvæv (14 tilfælde; 14,3% stærkt positivt, 78,6% svagt positive og 7,1 % negative) (fig 1C og 1E, S1B fig). Disse resultater tyder på, at SIRT3 udtryk øges i nogle tumorer sammenlignet med beslægtede normale væv og SIRT3 udtryk kan være varierer i individuelle tumorer, som skal undersøges nærmere.

SIRT3 niveauer er forbundet med celleproliferation

Så etablerede vi SIRT3 overekspression og knockdown cellelinjer hjælp AGS og SGC-7901 celler. Ekspressionen af ​​SIRT3 i stabile transfektanter blev bekræftet ved Western blot. Overekspression af SIRT3 forøget cellevækst, mens SIRT3 knockdown inhiberede cellevækst af både gastriske cancercellelinier (Fig 2A). Endvidere overekspression af SIRT3 udløst mere kolonidannelse end kontrol transficerede celler, der var i modsætning til kun færre kolonier dannet i SIRT3 knockdown celler (Fig 2B).

A, celle vækst af AGS og SGC-7901 celler med SIRT3 overekspression eller knockdown blev beregnet på dag 2, 4, 6 og 8 efter celle plating. SIRT3 ekspression i stabile transfektanter blev bekræftet ved Western blot. B, clonogenicity af AGS og SGC-7901 celler med SIRT3 overekspression eller knockdown blev målt og præsenteret som den del af kontroltransfektanter (NC eller SCR). C, Overekspression af SIRT3 fremmes tumorbyrde in vivo. SGC-7901 celler med SIRT3 overekspression (venstre panel) eller knockdown (højre panel) blev subkutant injiceret i højre flanke af nøgne mus med de relative kontrolceller (NC eller SCR) i den venstre flanke. Xenotransplantattumorer blev udskåret og vejet på 28

th dag efter celleinokulering. Billeder af højre panel viste xenotransplantattumorer in vivo ved slutningen af ​​eksperimentet. Billeder på op til højre viste dissekerede tumorer fra hver gruppe. Intervallerne og midler til tumorvægte af hver gruppe blev præsenteret i højre panel som middel ± S.E. (N = 5 *,

s

0,05, **,

s

0,01). SIRT3, SIRT3 overekspression; shSIRT3, SIRT3 knockdown; NC (negativ kontrol tom pcDNA3.1) og Scr (scramble shRNA; pGPH1 /GFP /Neo-shRNA) tjener som kontroller til pcDNA3.1-SIRT3 og pGPH1 /GFP /henholdsvis Neo-shSIRT3

for yderligere at fastlægge den rolle, SIRT3 i tumordannelse evne, vi injicerede SIRT3 overekspression og knockdown SGC-7901 celler i flankerne af nøgne mus og tumorvækst blev tilladt for 28 dage efter celle podning (S2 fig). Den gennemsnitlige vægt af tumorerne afledt fra SIRT3 overudtrykker celler var 0.7079g, betydeligt større end den gennemsnitlige tumorvægt af kontrol (NC),

s

= 0,015, (fig 2C, venstre panel). I modsætning hertil er den gennemsnitlige vægt af tumorer afledt fra SIRT3 knockdown celler var 0.0588g, betydeligt mindre end den fra scramble shRNA kontrolceller (SCR) (0.2033g;

s

= 0,009) (fig 2C, højre panel) . Den gennemsnitlige mængde af tumorer afledt SIRT3 overudtrykkende celler blev øget end fra kontrol celler (NC) (Fig 2C, venstre panel op højre hjørne). Tværtimod den gennemsnitlige mængde af tumorer vokser fra SIRT3 knockdown celler var dramatisk lille i forhold til fra kontrolceller (SCR) (fig 2C, højre panel op højre hjørne).

Udvidet glykolyse i SIRT3 udtrykker gastrisk cancer celler

Vi blev derefter spekulerer på, hvordan cellulære bioenergetik kunne ændres i SIRT3-overekspression gastriske kræftceller. SIRT3 overekspression dramatisk forøget glukoseoptagelse (1,4 gange i AGS og 1,9 gange i SGC-7901), mens SIRT3 knockdown faldt glukoseoptagelse (ca. 40% i begge AGS og SGC-7901) (Fig 3A og 3B). I overensstemmelse med det mønster af glucose forbrug, havde SIRT3 overudtrykker celler forøgede niveauer af lactat sekretion (1,2 gange i AGS og 1,3 gange i SGC-7901), hvorimod SIRT3 knockdown-celler havde nedsat niveau af lactat sekretion (55% i AGS og 45 % i SGC-7901) (fig 3C og 3D). Vi fandt også, at glykogen dannelse var signifikant forhøjet ved SIRT3 overekspression (1,5 gange i AGS og 1,3 gange i SGC-7901), en funktion af hurtig vækst af tumorceller [33], mens reduceret med SIRT3 knockdown (40% i AGS og 70% i SGC-7901) (fig 3E og 3F).

Glucoseoptagelse blev lactat produktion og glycogendannelse målt i AGS (A, C, E) og SGC-7901 (B, D, F ) celler med SIRT3 overekspression eller knockdown. Alle data er præsenteret som gennemsnit ± S.E. (N = 3; *,

s

0,05, **,

s

0,01).

SIRT3 er blevet bevist involveret i deacetylering af globale stofskifte enzymer og vedligeholdelse af basale ATP niveauer i celler både i normal tilstand og i sygdomme [1,2]. Total cellulær ATP og glykolyse ATP generation blev fundet i AGS og SGC-7901 celler med enten SIRT3 overekspression eller SIRT3 knockdown. De samlede cellulære ATP-niveauer blev forøget i SIRT3 overudtrykker celler (omkring 1,3 gange i begge cellelinier), men faldt i SIRT3 knockdown celler (ca. 75% i begge cellelinier) sammenlignet med NC eller Scr kontrolceller (fig 4A og 4B) . Derefter behandlet vi celler med rotenon at inhibere oxidativ phosphorylering, og afprøvet ATP produktion fra glykolyse. Som det er vist i fig 4C og 4D, førte SIRT3 overekspression til en stigning i glycolyse ATP-produktion (1,4 gange i AGS og 1,6 gange i SGC-7901), mens SIRT3 knockdown førte til et signifikant fald i glycolyse ATP-produktion (20% i AGS og 40% i SGC-7901) sammenlignet med NC eller Scr kontrol.

A og B, totalt cellulært ATP-niveauer blev testet i AGS (A) og SGC-7901 (B) celler med SIRT3 overekspression eller slå ned. C og D, AGS (C) og SGC-7901 (D) celler med SIRT3 overekspression eller knockdown blev behandlet med rotenon (2 uM, 24 timer) til at inhibere den oxidative phosphorylering og derefter cytoplasma ATP-niveauer blev målt. Data blev normaliseret ved kontrol (NC eller SCR) celler og præsenteres som gennemsnit ± S.E. (N = 3; *,

s

0,05, **,

s

0,01)

SIRT3 regulerer homeostase af ROS i gastrisk. kræftceller

en række beviser understøtter, at øget ROS niveau er en kritisk karakteristik i kræftceller, som gør kræftceller mere følsomme over for yderligere ROS stress [34]. Her fandt vi, at overekspression af SIRT3 faldt ROS niveauer til 70% og 80% i AGS og SGC-7901 celler, mens hæmning af SIRT3 udtryk øgede ROS niveauer (1,4 gange i AGS celler og 1,6 gange i SGC-7901 celler) henholdsvis (fig 5A og 5B). Efter aftale med litteraturen viser SIRT3 deacetylerer og aktiverer MnSOD (11, 12) i mavens kræftceller blev MnSOD aktivitet forbedret ved SIRT3 overekspression (1,4 gange i AGS celler og 1,2 gange i SGC-7901 celler), men reduceret med SIRT3 knockdown (50% i AGS-celler og 65% i SGC-7901 celler) (fig 5C og 5D), hvilket antyder, at SIRT3 kan beskytte celler mod oxidativ stress-induceret skade ved at genoprette ligevægten intracellulær ROS ved at forbedre MnSOD-aktivitet i gastriske cancerceller.

A og B, cellulære ROS-niveauer i AGS (A) og SGC-7901 (B) celler, der huser SIRT3 overekspression og knockdown blev påvist under anvendelse DCFH2 farvning fremgangsmåde og repræsenteret som relative niveau normaliseret ved kontrol (NC eller SCR). C og D, MnSOD-aktivitet blev målt i celler, der er nævnt i (A og B) og repræsenteret som relativ aktivitet normaliseret ved kontrol (NC eller SCR). Alle data er præsenteret som gennemsnit ± S.E. (N = 3; *,

s

0,05, **,

s

0,01).

SIRT3 deacetylerer og aktiverer IdhA

IdhA spiller en central rolle i tumor initiering, vedligeholdelse og progression. Inhibering af IdhA aktivitet blokke tumorigenicitet og tumorprogression [26,27] og IdhA aktivitet kan reguleres ved acetylering /deacetylering modifikation [35]. Vi spørger om SIRT3 er involveret i reguleringen af ​​IdhA aktivitet. Vi fandt, at i gastriske cancerceller, blev IdhA aktivitet steg betydeligt i SIRT3 overudtrykkende celler, hvorimod faldet i SIRT3 knockdown celler sammenlignet med NC eller Scr kontrolceller separat uden påviselig ændring i IdhA proteinniveauet i de stabile transfektanter (fig 6A). Immunofarvning Resultaterne viste, at IdhA og SIRT3 blev co-lokaliseret i cytoplasmaet (fig 6B), og co-IP-analyse med enten IdhA eller SIRT3 antistof afslørede, at SIRT3 er i stand til at interagere med IdhA (Fig 6C). Desuden blev niveauet af IdhA acetylering faldt i SIRT3 overudtrykker celler, men steg i SIRT3 knockdown celler (Fig 6D). Endvidere

in vitro

IdhA aktivitetsassay udføres under anvendelse kommercielt humant rekombinant SIRT3 og bovin hjerte L-laktatdehydrogenase indikerede, at IdhA aktivitet blev forøget med tilstedeværelsen af ​​SIRT3 i reaktionen, der blev vendt ved tilsætning af SIRT3 inhibitor , nicotinamid (figur 6E). For at identificere potentielle SIRT3 deacetylering site (s) på IdhA, vi søgte database og fundet, at K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 og K318 er potentielle acetylering steder i IdhA, og tidligere undersøgelse rapporterede, at K5 acetylering /deacetylering var impliceret i reguleringen af ​​IdhA aktivitet [35]. Derefter gjorde vi IdhA aktivitet under anvendelse lysin 5 og lysin 318 acetylering efterligner (K5Q /K318Q) eller deacetylering efterligne (K5R /K318R) mutant IdhA, og fandt, at hverken K5 eller K318 var nødvendig for SIRT3-medieret IdhA aktivering (S3 Fig). Yderligere identifikation af SIRT3-medieret IdhA deacetylering er i nød.

A, blev IdhA aktiviteten målt i AGS og SGC-7901 celler med SIRT3 overekspression eller knockdown og repræsenteret som relativ aktivitet normaliseret ved kontrol (NC eller Scr). IdhA ekspression i SIRT3 overekspression og Knockdown AGS celler blev analyseret ved immunblotting. B, co-lokalisering af SIRT3 og IdhA blev detekteret ved immunofarvning i AGS celler med anti-SIRT3 (grøn) og anti-IdhA (røde) antistoffer. Kerner blev conterstained med DAPI (blå). Scale bar, 5 um. C, IdhA blev immunpræcipiteret (IP) efterfulgt af western blot (WB) i IdhA eller SIRT3, eller omvendt, i AGS gastrisk cancerceller. IP med ikke-immunt gede-IgG tjener som en negativ kontrol, og immunoblotting af totale cellelysater (input) tjener som undersøgelsesperioden lige loading kontrol. D, SIRT3-forstærket deacetylering af IdhA i AGS celler blev detekteret ved IP med anti-IdhA efterfulgt af western blot med anti-IdhA og anti-acetyl-lysin antistoffer. Western blot af totale cellelysater med SIRT3 antistof til at vise ekspressionen af ​​transficerede protein. E, IdhA enzymatisk aktivitet blev målt ved hjælp af kommercielle bovine hjerte L-Lactic dehydrogenase og rekombinant humant SIRT3 enzym med /uden SIRT3 inhibitor nikotinamid. F, IdhA enzymatisk aktivitet blev målt ved hjælp af kommercielle rekombinant humant SIRT3 enzym og immunpræcipiteret IdhA fra AGS celler transficeret med K5Q /R eller K318Q /R mutant IdhA med /uden SIRT3 inhibitor nikotinamid og præsenteres som relativ enzymaktivitet normaliseret ved vildtype IdhA uden SIRT3 inhibitor . I A, E og F, er data præsenteret som middel ± S.E. (N = 5 *,

s

0,05, **,

s

0,01).

SIRT3 opregulerer gener involveret i cellulær metabolisme

for at karakterisere den molekylære underskrift SIRT3-IdhA medierede bioenergetik i gastrisk kræftceller, målt vi ekspressionen af ​​gener, der er forbundet med glukose transport og glykolyse. Data i figur 7A og 7B viste, at overekspression af SIRT3 i AGS eller SGC-7901 induceret ekspression af HK2 (1,47-fold i AGS celler, 1,3 gange i SGC-7901 celler), MCT4 (2,3 gange i AGS celler, 1,34 fold i SGC-7901 celler) og Glut1 (1,55-fold i AGS celler, 1,38-fold i SGC-7901 celler) på mRNA-niveau testet af real-time PCR. Tværtimod SIRT3 knockdown faldt ekspressionen af ​​genet HK2 til 76%, MCT4 til 73% og Glut1 til 62% i AGS celler, mens HK2 til 80%, MCT4 til 62% og Glut1 til 74% i SGC-7901 celler. Hertil kommer, når SIRT3 blev overudtrykt, blev MCT1 mRNA-niveau steg i AGS celler 1,6 gange, men ikke i SGC-7901 celler, og når SIRT3 blev knockdown, blev MCT1 faldt til 59% i AGS og 65% i SGC-7901 celler henholdsvis

relative mRNA-niveauer af Glut1, HK2, MCT1 og MCT4. blev målt ved QRT-PCR i AGS (A) og SGC-7901 (B) celler med SIRT3 overekspression eller knockdown. Data er præsenteret som gennemsnit ± S.E. (N = 3; *,

s

0,05, **,

s

0,01). (C) Skematisk præsentation af potentiel mekanisme, hvormed SIRT3 udløser cellevækst. SIRT3 deacetylerer og aktiverer IdhA forårsager forøget IdhA aktivitet og cellulære bioenergetik, som sammen med SIRT3-medieret MnSOD aktivering øger celleproliferation.

Diskussion

Denne undersøgelse giver det tyder på, at SIRT3 udtrykte i nogle cancerceller, såsom gastriske cancerceller, kan være forbundet med den øgede aggressivitet ved SIRT3-medieret bioenergetik via deacetylering og aktivering af LADH. Selvom akkumulere beviser indikerer, at SIRT3 spiller en central rolle i beskyttelsen af ​​normale celler mod aldring og malign transformation, dens funktion i allerede transformerede celler, såsom tumorceller, som udtrykker SIRT3 skal undersøges [19]. Manglende SIRT3 i MEF’er fører til genomisk ustabilitet og en høj frekvens af celletransformation medieret af Ras med en øget hyppighed af tumor dannelse og ældning, hvilket tyder på, at SIRT3 er nødvendig forebyggelse af cellulær aldring og carcinogenese [11,15]. Desuden er manglende eller lavere ekspression af SIRT3 påvist i adskillige humane cancere og SIRT3 niveau er forbundet med følsomheden af ​​cancerceller til kemo- og stråleterapi [11,15,16]. Men SIRT3 også vist være overudtrykt i humane kræftformer og i forbindelse med terapi modstand [19,21,36]. Disse resultater antyder, SIRT3 kan målrette forskellige proteiner mellem normale celler og cancerceller, og at SIRT3 ekspression kan varieres på forskellige typer af cancer, såsom de nuværende resultater indikerer, at den intestinale type mavekræft udtrykker et højere SIRT3 end den diffuse