PLoS ONE: miR-203 Undertrykker spredning og Migration og Fremmer Apoptose af Lung Cancer Cells ved Målretning SRC

abstrakt

SRC, også kendt som proto-onkogen c-Src, er en ikke-receptortyrosinkinase, der spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft ved at fremme overlevelse, angiogenese, proliferation og invasion veje. I denne undersøgelse fandt vi, at SRC proteinniveauer konsekvent var opreguleret i lungekræft væv, men at SRC-mRNA-niveauer varierede tilfældigt, hvilket antyder, at et post-transkriptionel mekanisme var involveret i SRC regulering. Fordi microRNA (miRNA) er stærke post-transkriptionelle regulatorer af genekspression, vi brugte bioinformatik analyser for at søge efter miRNA, der potentielt er målrettet SRC. Vi identificerede bestemte websteder målrettet for miR-203 i 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af SRC. Vi derefter eksperimentelt valideret MIR-203 som en direkte regulator af SRC bruge, celle transfektion og luciferaseassays og viste, at MIR-203 inhiberede SRC ekspression og dermed udløste undertrykkelse af SRC /Ras /ERK-vejen. Endelig viste vi, at undertrykkelsen af ​​SRC af miR-203 undertrykte proliferation og migration og fremmet apoptose af lungekræft celler. Sammenfattende denne undersøgelse giver de første fingerpeg om betydningen af ​​miR-203 som en tumor suppressor i lungekræft celler gennem hæmning af SRC oversættelse

Henvisning:. Wang N, Liang H, Zhou Y, Wang C Zhang S, Pan Y, et al. (2014) miR-203 Undertrykker spredning og Migration og Fremmer Apoptose af Lung Cancer Cells ved Målretning SRC. PLoS ONE 9 (8): e105570. doi: 10,1371 /journal.pone.0105570

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: April 7, 2014 Accepteret: 21 Juli 2014; Udgivet: 20 August, 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Basic Research Program Kina (973 Program) (nr 2014CB542300), National Natural Science Foundation Kina (nr 81.101.330, 31.271.378, og 81.250.044), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (nr BK2011013 og BK2012014), og Research særlig fond for offentlig velfærd Industry of Health (nr 201.302.018). Dette arbejde blev også støttet af programmet for New Century Fremragende Talenter i University fra Undervisningsministeriet, Kina (NCET-12-0261). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er den hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan, og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for ca. 80% af alle tilfælde [1]. Størstedelen af ​​lungekræft (56%) er diagnosticeret på et fjernt tidspunkt fordi tidlig sygdom er typisk asymptomatisk; kun 15% af tilfældene er diagnosticeret på en lokal scene [2]. Faktisk patienter med lungekræft udviser ofte tumorcelleinvasion og metastase før diagnose, hvilket gør de nuværende behandlinger, herunder kirurgi, strålebehandling og kemoterapi, ineffektiv. Den samlede 5-års overlevelsesrate for ikke-småcellet lungekræft er meget lav (17,1%). Derfor studerer det molekylære grundlag for lungekræft er afgørende for at designe nye terapeutiske midler, der vil forbedre overlevelsen.

Med de betydelige fremskridt i vores forståelse af tumor biologi, centrale signalveje involveret i formidling lungekræft vækst og progression er blevet identificeret [3]. Dominerende onkogener og tumor suppressor gener involveret i patogenesen af ​​lungekræft har tiltrukket betydelig interesse, og deres centrale roller og grundlæggende bidrag til dårlig opførsel af kræftceller er blevet klart [4]. Disse gener tilbyde nye mål for biologiske behandlinger. Et sådant mål er SRC (også kendt som c-Src), et proto-onkogen koder for en tyrosinkinase, der ofte overudtrykkes og aktiveres i mange cancertyper, herunder lungekræft [5], [6]. På den molekylære basis, SRC regulerer multiple signalleringskaskader forbundet med tumorudvikling og progression, herunder fokal adhæsionkinase (FAK) pathway, den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) pathway, og Ras /ERK pathway [7]. Derfor til SRC fungerer som et onkogen favorisere proliferation, migration og invasion af forskellige typer af cancerceller [8], [9]. Trods disse nylige fremskridt i vores forståelse af de vigtige roller SRC i tumorigenese, den præcise molekylære mekanisme, gennem hvilken SRC bidrager til lungekræft progression stadig at blive fuldstændigt belyst.

En klasse af små, ikke-kodende, single -stranded RNA kaldet microRNA (miRNA) er blevet vist at være involveret i kræft. miRNA binder target mRNA’er på komplementære sites i deres 3′-utranslaterede regioner (3′-UTR’er), hvorved undertrykkelse af ekspressionen af ​​målgenet på posttranskriptionel plan [10], [11]. Gennem denne mekanisme, miRNA regulere en lang række biologiske processer, herunder celleproliferation og differentiering, migration, apoptose, udvikling og metabolisme [10]. På den anden side, er dysfunktion af miRNA impliceret i forskellige humane cancere, herunder lungecancer og miRNA kan fungere som både onkogener og tumor suppressorer under carcinogenese [12], [13]. For eksempel er lav ekspression af lad-7a og høj ekspression af MIR-17-92 klynge forbundet med en dårlig klinisk resultat i lungecancer [14], [15]. Desuden blev det rapporteret, at miR-31 direkte kunne undertrykke tumorsuppressorer LATS2 og PPP2R2A i human lungecancer [16]. Disse resultater understreger behovet for en dybtgående søgen efter miRNA, der er afvigende udtrykt under lunge carcinogenese samt behovet for en intensiv undersøgelse af deres rolle i tumor biologi.

Selv om deregulering af miRNA og SRC play vigtige roller i lungerne carcinogenese, har ingen sammenhæng mellem SRC og miRNA i lungekræft blevet rapporteret. I denne undersøgelse, vi forudsagde, at SRC er et mål for miR-203. Efter måling af ekspressionsniveauerne af MIR-203 og SRC i human lungecancer væv og parret noncancerous vævsprøver, vi har registreret en omvendt korrelation mellem MIR-203 og SRC-proteinniveauer. Endvidere har vi eksperimentelt valideret den direkte hæmning af SRC oversættelse af MIR-203 under anvendelse af celle transfektion og luciferaseassays. Endelig viste vi, at miR-203 hæmmede SRC udtryk og dermed udløste undertrykkelse af de nedstrøms signalveje af SRC, såsom SRC /Ras /ERK-vejen, som i sidste ende undertrykte proliferation og migration og fremmet apoptose af lungekræft celler.

Materialer og metoder

Celler og humane væv

den menneskelige lungecancer cellelinier A549, HCC827, og H1975, og humant normalt lunge fibroblast cellelinje HLF blev købt fra Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). A549, HCC827 og H1975-celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (GIBCO, CA, USA), og HLF celler blev dyrket i F12K suppleret med 10% føtalt bovint serum (GIBCO) og 2,5 g /l NaHCO

3. Alle celler blev inkuberet i en COZ 5%

2 ved 37 ° C i en vandmættet atmosfære. De lunge tumorer og parret normale tilstødende væv blev afledt fra patienter, der gennemgår et kirurgisk indgreb på Tilknyttede Gulou Hospital i Nanjing Universitet (Nanjing, Kina). Derefter blev tumor sektion objektglas underkastet immunhistokemisk analyse af SRC (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Alle patienterne eller deres værger forudsat skriftlige samtykke, og den etiske komité fra Nanjing Universitet godkendt alle aspekter af denne undersøgelse. Vævsfragmenter blev straks nedfrosset i flydende nitrogen på tidspunktet for kirurgi og opbevaret ved -80 ° C. De kliniske træk ved de patienter, er anført i tabel S1 i File S1.

RNA-isolering og kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra de dyrkede celler og humane væv under anvendelse af TRIzol Reagens (Invitrogen , Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Assays til at kvantificere miRNA blev udført under anvendelse Taqman miRNA prober (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, 1 ug totalt RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af AMV-revers transkriptase (Takara, Dalian, Kina) og en hårnåle-RT-primer (Applied Biosystems). Reaktionsbetingelserne var som følger: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 minutter, og 85 ° C i 5 minutter. Real-time PCR blev udført under anvendelse af et TaqMan PCR-kittet på et Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Reaktionerne blev inkuberet i en 96-brønds optisk plade ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Alle reaktioner blev kørt tredobbelt. Efter reaktionen blev tærskelcyklen (C

T) data bestemt under anvendelse fast tærskelværdi indstillinger, og den gennemsnitlige C

T af de tredobbelte PCR’er blev bestemt. En sammenlignende fremgangsmåde C

T blev anvendt til at sammenligne hver betingelse til kontrollerne. De relative niveauer af miRNA i celler og væv blev normaliseret til U6. Mængden af ​​miRNA i forhold til den interne kontrol U6 blev beregnet ved hjælp af 2

-ΔΔCT ligning, hvor ΔΔC

T = (C

T miRNA – C

T U6)

target – (C

T miRNA – C

T U6)

kontrol. At kvantificere SRC-mRNA, 1 ug totalt RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af oligo dT og Thermoscript (Takara) i reaktionen, som blev udført med de følgende betingelser: 42 ° C i 60 min og 70 ° C i 10 min . Dernæst blev realtids-PCR udført under anvendelse af RT produktet, SYBER Green Dye (Invitrogen) og specifikke primere til SRC og GAPDH. Sekvenserne for primerne var som følger: SRC (sense): 5′-CATCCAAGCCTCAGACCCA-3 ‘; SRC (antisense): 5’-TGACACCACGGCATA CAGC-3 ‘; GAPDH (sense): 5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 ‘; og GAPDH (antisense): 5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 ‘. Reaktionerne blev inkuberet ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s. Efter reaktionerne var fuldstændige, C

T-værdier blev bestemt ved at sætte en fast tærskel. Den relative mængde af SRC-mRNA blev normaliseret til GAPDH.

Overekspression og knockdown af MIR-203

Syntetiske pre-MIR-203, anti-MIR-203 og scrambled negative kontroldyr RNA’er blev erhvervet fra Ambion (Austin, TX, USA). Alle celler blev podet i plader med 6 brønde eller 60 mm skåle, og cellerne blev transficeret med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) den følgende dag, når cellerne var ca. 70% sammenflydende. I hver brønd, ens mængder af præ-MIR-203, anti-MIR-203 eller krypteret negativ kontrol-RNA blev anvendt. Cellerne blev høstet 24 timer efter transfektion til kvantitativ RT-PCR og Western blotting.

Luciferase reporter assay

For at teste direkte binding af MIR-203 til målgenet SRC, et luciferase reporter assay blev udført som tidligere beskrevet [17]. Hele 3′-utranslateret region (3′-UTR) af humant SRC blev amplificeret under anvendelse af PCR med humant genomisk DNA som en skabelon. PCR-produkterne blev indsat i p-MIR-reporterplasmid (Ambion), og indsættelse blev bekræftet som korrekte ved sekventering. For at teste bindingsspecificiteten blev sekvenserne, der kommunikerede med MIR-203 frø sekvens muteret (fra AUUUCA til UAAAGU), og mutanten SRC 3′-UTR blev indsat i et tilsvarende luciferase reporter. For luciferase reporter assays, A549-celler blev dyrket i 24-brønds plader, og hver brønd blev transficeret med 1 ug af ildflue-luciferase-reporterplasmid, 1 pg af et β-galactosidase (β-gal) ekspressionsplasmidet (Ambion), og lige store mængder (100 pmol) af præ-mIR-203, anti-mIR-203 eller den krypterede negativ kontrol-RNA under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen). Den β-gal-plasmid blev anvendt som en transfektion kontrol. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne analyseret under anvendelse af et luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI, USA).

Plasmidkonstruktion og siRNA interferens assay

En siRNA-sekvens rettet mod human SRC cDNA blev designet og syntetiseret af GenePharma (Shanghai, Kina). SiRNA-sekvens var 5′-CACUACAAGAUCCGGAAAC-3 ‘. En krypteret siRNA var inkluderet som en negativ kontrol. En mammal ekspressionsplasmid kodende for det humane SRC åbne læseramme (Preceiver-M02-SRC) blev indkøbt fra GeneCopoeia (Germantown, MD, USA). En tom plasmid tjente som en negativ kontrol. SRC ekspressionsvektor og SRC siRNA blev transficeret ind A549-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Total RNA og protein blev isoleret 24 timer efter transfektion. Src mRNA og protein ekspressionsniveauer blev vurderet ved kvantitativ RT-PCR og Western blotting.

Protein ekstraktion og Western blotting

Alle celler blev skyllet med PBS (pH 7,4) og lyseret i RIPA Lysis puffer (Beyotime, Kina) suppleret med en protease og phosphatase-cocktail (Thermo Scientific 78440) på is i 30 minutter. Vævsprøverne blev frosset fast med flydende nitrogen, formalet til et pulver og lyseret i RIPA Lysis buffer indeholdende protease og phosphatase-cocktail på is i 30 minutter. Når det er nødvendigt, blev lydbehandling anvendes til at lette lysis. Cellelysater eller vævshomogenater blev centrifugeret i 10 min (12000 g, 4 ° C). Supernatanten blev opsamlet, og proteinkoncentrationen blev beregnet under anvendelse af et Pierce BCA protein assay kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). De proteinniveauer blev analyseret ved anvendelse western blots med tilsvarende antistoffer. De proteinniveauer blev normaliseret ved at probe de samme blots med en GAPDH antistof. Antistofferne blev erhvervet fra følgende kilder: anti-c-Src (B-12) (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology), anti-ERK1 /2 (pT202 /pY204) (BD Biosciences 612359, USA), anti-ERK1 (BD Biosciences 610031, USA), anti-PKCalpha (H-7) (sc-8393, Santa Cruz Biotechnology) og anti-GAPDH (sc-365.062, Santa Cruz Biotechnology). Ras-aktivitet blev påvist under anvendelse af ras Activation Assay Kit fra Upstate-Millipore (17-218). Proteinbånd blev analyseret ved anvendelse af ImageJ software.

Cellelevedygtighed assay

For at vurdere cellelevedygtighed blev A549-celler podet tredobbelt i 96-brønds plader ved en densitet på 5 x 10

3 brønd i 100 pi kulturmedium. Celleproliferationen indekset blev målt under anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assay (Sigma, USA), der blev udført 12, 24, 36, og 48 h efter transfektion ifølge producentens anvisninger.

cellemigrationsassay

migrationen evne A549-celler transficeret med mIR-203 mimic eller SRC overekspression plasmid blev testet i et Transwell Boyden Chamber (6,5 -mm, Costar, USA). De polycarbonatmembraner (8- um porestørrelse) i bunden af ​​det øvre rum af transbrøndene blev overtrukket med 1% humant fibronectin (R og de vedhæftede og flydende celler blev derefter høstet. Flowcytometrianalyse af apoptotiske celler blev udført under anvendelse af et Annexin V-FITC /PI-farvning kit (BD Biosciences, CA, USA). Efter vaske med kold PBS blev cellerne resuspenderet i bindingspuffer (100 mM HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, og 25 mM CaCl

2) efterfulgt af farvning med Annexin V-FITC /PI ved stuetemperatur i mørke i 15 min. Apoptotiske celler blev derefter evalueret ved gating PI og Annexin V-positive celler på en fluorescens-aktiveret celle-sortering (FACS) flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). Alle forsøg blev udført tre gange.

Statistisk analyse

Alle de billeder af Western blotting er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Kvantitativ RT-PCR, luciferase reporter assay og levedygtigheden celle og apoptose assays blev udført tredobbelt, og hvert eksperiment blev gentaget adskillige gange. De viste data er middelværdier ± SE af mindst tre uafhængige forsøg. Forskellene blev betragtet som statistisk signifikant ved p. 0,05 hjælp Students t-test

Resultater

opregulering af SRC protein, men ikke mRNA, i lungekræft væv

Vi først undersøgt SRC udtryk ved hjælp af både immunhistokemisk analyse og immunoblotanalyse i humane lungekræft væv og tilsvarende noncancerous væv. Vi fandt, at SRC-proteinniveauer var dramatisk højere i lungekræft væv (figur 1, A-C). Selv SRC protein konsekvent blev opreguleret i lungekræft væv, har SRC mRNA-niveauer ikke signifikant forskellig mellem kræft og noncancerous væv (Figur 1D). Endvidere fandt vi, at SRC proteinniveauet var højere i humane lungeadenocarcinom A549-celler sammenlignet med den i normale lunge fibroblast HLF celler (figur S1, A og B i File S1), men SRC mRNA-niveauet var ens i disse to cellelinjer (Figur S1c i File S1). Denne forskel mellem protein og mRNA i SRC-ekspression i lungekræft tyder stærkt på, at en post-transkriptionel mekanisme er involveret i SRC regulering.

(A) Repræsentant billede af immunhistokemisk analyse af SRC-ekspression i lungekræft (CL) og normale tilstødende væv (NL) prøver. (B og C) Western blotting-analyse af ekspressionsniveauerne af SRC-proteinet i seks par af CL- og NL prøver. B: repræsentativt billede; C: kvantitativ analyse. (D) Kvantitativ RT-PCR-analyse af de relative ekspressionsniveauer af SRC mRNA i seks par af CL- og NL prøver. * P 0,05; ** P. 0,01

Identifikation af bevarede miR-203 target sites inden for 3′-UTR af SRC

En vigtig form for post-transkriptionel regulering er undertrykkelsen af ​​mRNA udskrifter af miRNA. miRNA er derfor sandsynligt, at spille en biologisk relevant rolle i reguleringen af ​​SRC-ekspression i lungekræft. Tre beregningsmæssige algoritmer, herunder Targetscan [18], Miranda [19], og PicTar [20], blev anvendt i kombination til at identificere potentielle miRNA, der kan målrette SRC. Ved hjælp af disse metoder, blev miR-203 identificeret som en kandidat regulatoriske miRNA af SRC. Den forudsagte interaktion mellem MIR-203 og målstederne i SRC 3′-UTR er illustreret i Figur 2A. Fire potentielle MIR-203 målsteder blev fundet i 3′-UTR af SRC mRNA-sekvens. De minimale fri energi værdier af disse hybrider var -16,9, -20,1, -15,8, og -18,9 kcal /mol henholdsvis som er godt inden for området af ægte miRNA målgruppen par. Desuden forekom perfekt baseparring mellem frøet region (kernesekvensen, der omfatter de første 2-8 baser af det modne miRNA) og de beslægtede mål. Ydermere er MIR-203 bindende sekvenser i SRC 3′-UTR højt konserveret på tværs af arter.

(A) Skematisk beskrivelse af de hypotetiske duplexer dannet af interaktionerne mellem bindingsstederne i SRC 3′- UTR (øverst) og mIR-203 (nederst). Den forudsagte frie energi værdien af ​​hver hybrid er angivet. De steder frø anerkendelse betegnes, og alle nukleotider i disse regioner er stærkt konserverede på tværs af arter, herunder menneske, mus og rotter. (B) Kvantitativ RT-PCR-analyse af ekspressionsniveauerne af MIR-203 (i form af miRNA /U6 forhold) i seks par af CL- og NL prøver. (C) Pearsons korrelation scatter plot af folden ændring af indholdet af miR-203 og SRC protein i humane lunge cancer væv. (D) Pearsons korrelation scatter plot af folden ændring af indholdet af miR-203 og SRC mRNA i humane lunge cancer væv. * P 0,05; ** P. 0,01

Påvisning af en omvendt korrelation mellem miR-203 og SRC-niveauer i lungekræft vævsprøver

miRNA er generelt menes at have ekspressionsmønstre, der er modsat til den for deres mål [21] – [23]. Derefter undersøgte vi, om MIR-203 omvendt var korreleret med SRC i lungekræft. Efter bestemmelse af miR-203 i de samme seks par lungekræft væv og de tilsvarende noncancerous væv, viste vi, at miR-203 niveauer konsekvent blev nedreguleret i lungekræft væv (Figur 2B). Den inverse korrelation mellem miR-203 niveauer og SRC protein niveauer (Figur 2C) og forskellen mellem miR-203 niveauer og SRC mRNA-niveauer (figur 2D), blev yderligere illustreret ved hjælp af Pearsons korrelation scatter plots. Som observeret, en omvendt korrelation mellem miR-203 niveauer og SRC protein niveauer, men ikke mRNA-niveauer, blev observeret i humane lunge cancer væv. Ligeledes MIR-203 niveau var også lavere i A549-celler sammenlignet med den i HLF celler (Figur S1D i File S1). Resultaterne kraftigt indikerede, at en typisk, miRNA-medieret, post-transkriptionel mekanisme regulering var involveret i SRC undertrykkelse.

Validering af SRC som et direkte mål for miR-203

Sammenhængen mellem miR -203 og SRC blev undersøgt yderligere ved at evaluere SRC udtryk i humane lunge adenocarcinom A549 celler efter overekspression af miR-203. I disse eksperimenter blev MIR-203 overekspression opnået ved transfektion af cellerne med præ-MIR-203 (et syntetisk RNA oligonukleotidduplex efterligner MIR-203 precursor). Som forventet blev MIR-203-niveauer i A549-celler steg mere end 300 gange, når disse celler blev transficeret med præ-MIR-203 (figur 3A). At validere, at transfektion af MIR-203 var vellykket, én af de repræsentative målgener af MIR-203, PKCalpha (REF), blev vurderet, og det blev vist, at PKCalpha var signifikant nedreguleret i A549-celler efter transfektion af MIR-203 (figur S2 i File S1). Ligeledes blev ekspressionen af ​​SRC-proteinet reduceres ved indførelse af MIR-203 i A549-celler (figur 3, B og C). For at bestemme det niveau, hvor MIR-203 påvirket SRC-ekspression, vi gentog ovennævnte eksperimenter og undersøgt ekspressionen af ​​SRC-mRNA efter transfektion. Selvom det intracellulære niveau af MIR-203 blev ændret signifikant efter behandling med præ-MIR-203, har overekspression af MIR-203 ikke påvirker SRC mRNA-stabilitet (figur 3D). På den anden side blev korrelationen mellem MIR-203 og SRC også undersøgt ved at evaluere SRC-ekspression i normale lunge fibroblast HLF celler efter knockdown af MIR-203 med anti-MIR-203 (kemisk modificerede antisense-oligonukleotider designet til specifikt at målrette modne miR- 203) (figur 3A). Banker ned MIR-203 i HLF-celler resulterede i en forøgelse af SRC-protein (figur 3, B og C), men ikke mRNA (figur 3D) niveauer. Disse resultater viser, at MIR-203 regulerer specifikt SRC-proteinekspression på post-transkriptionel niveau, som er en typisk dyr miRNA-medieret regulering mekanisme. For at demonstrere robusthed af testen, vi gentog ovennævnte eksperimenter i yderligere to lunge adenocarcinom cellelinjer, HCC827 og H1975. Ligeledes blev de miR-203 niveauer steget betydeligt, når HCC827 og H1975 celler blev transficeret med pre-miR-203 (figur S3, A og E i File S1). Følgelig blev SRC proteinniveauer undertrykkes, når HCC827 og H1975-celler blev behandlet med præ-MIR-203 (fig S3, B, C, F og G i File S1), men de SRC mRNA niveauer blev ikke påvirket af denne behandling (figur S3, D og H i File S1).

(A) Kvantitativ RT-PCR analyse af miR-203 niveauer i A549 celler behandlet med præ-miR-kontrol eller pre-miR-203 og i HLF celler behandlet med anti-miR-kontrol eller anti-miR-203. (B og C) Western blot-analyse af SRC-proteinniveauer i A549-celler behandlet med præ-MIR-kontrol eller præ-MIR-203 og i HLF-celler behandlet med anti-MIR-kontrol eller anti-MIR-203. B: repræsentativt billede; C: kvantitativ analyse. (D) Kvantitativ RT-PCR-analyse af SRC-mRNA-niveauer i A549-celler behandlet med præ-MIR-kontrol eller præ-MIR-203 og i HLF celler behandlet med anti-MIR-kontrol eller anti-MIR-203. (E) ildflueluciferase reportere indeholdende vildtype (WT) eller mutant (MUT) MIR-203 bindingssteder i SRC 3′-UTR blev cotransficeret ind i A549-celler med præ-MIR-kontrol eller præ-MIR-203 og i HLF celler med anti-miR-kontrol eller anti-miR-203. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne analyseret under anvendelse af et luciferase-assay kit. Resultaterne er beregnet som forholdet af ildflue-luciferase-aktivitet i den præ-MIR-mellem 203 eller anti-MIR-203-transficerede celler normaliseret til kontrolceller. * P 0,05; ** P. 0,01

For at afgøre, om de negative regulerende virkninger, at miR-203 udøves på SRC udtryk blev medieret gennem binding af miR-203 til de formodede steder i 3′-UTR af SRC-mRNA, den fulde længde SRC 3′-UTR indeholder de fire formodede mIR-203-bindingssteder blev fusioneret nedstrøms for ildflue-luciferase-genet i et reporterplasmid. Det resulterende plasmid blev transficeret ind i A549-celler sammen med en transfektionskontrol plasmid (β-gal) og præ-MIR-203. Som forventet overekspressionen af ​​MIR-203 resulterede i en reduktion på over 50% af luciferase reporter aktivitet sammenlignet med celler behandlet med den negative kontrol-RNA (fig 3E). Endvidere har vi introduceret punktmutationer i de tilsvarende komplementære sites i SRC 3′-UTR at eliminere de forudsagte MIR-203-bindingssteder (alle fire indbindingspositionerne var mutant). Denne muterede luciferase reporter var upåvirket af overekspression af MIR-203 (figur 3E). I modsætning hertil, når det resulterende plasmid blev transficeret i HLF celler sammen med en transfektionskontrol plasmid (β-gal) og anti-MIR-203, knockdown af MIR-203 resulterede i en stigning på over 75% af luciferase reporter aktivitet sammenlignet med celler behandlet med den negative kontrol-RNA, mens den muterede luciferase reporter var upåvirket af knockdown af mIR-203 (figur 3E). Dette fund tyder på, at de bindingssteder bidrager væsentligt til at miRNA: mRNA-interaktion medierer den post-transkriptionel repression af SRC udtryk. Afslutningsvis vores resultater viser, at MIR-203 direkte genkender og binder til 3′-UTR af SRC mRNA-transkript og inhiberer SRC oversættelse.

Suppression af SRC /Ras /ERK signalvejen af ​​MIR-203

Vi analyserede næste de biologiske konsekvenser af faldet SRC udtryk forårsaget af miR-203 i lunge kræftceller. Som en potent onkogen, SRC regulerer proliferation og motilitet af cancerceller ved at påvirke FAK, EGFR, og Ras /ERK signalveje [7]. Derfor undersøgte vi, om undertrykkelse af SRC udtryk på grund af miR-203 regulerer aktiviteterne i molekylerne i SRC /Ras /ERK signalvej. Først, vi valideret effekten af ​​SRC aktivitet på Ras /ERK signalvej i A549 celler. I overensstemmelse med tidligere rapporter [7], [24], knockdown af SRC af siRNA-medieret RNA-interferens resulterede i nedsat SRC-mRNA og protein niveauer (figur 4, A-C), som igen førte til nedsat Ras-GTP og phosphorylerede-ERK1 /2 (figur 4, A og B). I modsætning hertil overekspression af SRC resulterede i øget SRC-mRNA og protein niveauer (figur 4, A-C), som igen førte til øget Ras-GTP og phosphoryleret-ERK1 /2 (figur 4, A og B). Dernæst undersøgte vi, hvis MIR-203 induktion kunne efterligne SRC nedsættelse undertrykke Ras /ERK signalvej. Som forventet overekspression af MIR-203 i A549-celler nedreguleret SRC-proteinet og resulterede i mindre aktive Ras-GTP, hvilket igen førte til mindre phosphoryleret ERK1 /2 (figur 4, D og E). Taget sammen antyder resultaterne, at Ras /ERK, som downstream signalvejen af ​​SRC, kan kontrolleres nøje af MIR-203 /SRC regulatoriske pathway.

(A og B) Western blotting-analyse af proteinet niveauer af SRC, Ras-GTP, total Ras, phosphoryleret ERK1 /2, og ERK1 i A549-celler transficeret med kontrol siRNA, SRC siRNA, kontrol vektor eller SRC vektor. A: repræsentativt billede; B: kvantitativ analyse. (C) Kvantitativ RT-PCR-analyse af SRC-mRNA-niveauer i A549-celler behandlet med kontrol siRNA, SRC siRNA, kontrol vektor eller SRC vektor. (D og E) Western blotting-analyse af proteinniveauer af SRC, Ras-GTP, total Ras, phosphoryleret ERK1 /2, og ERK1 i A549-celler transficeret med præ-MIR-kontrol eller præ-MIR-203. D: repræsentativt billede; E: kvantitativ analyse. * P 0,05; ** P. 0,01

rolle miR-203 i reguleringen SRC i lunge kræftceller

Vi næste fokuseret på at studere den rolle, miR-203 i reguleringen SRC. Fordi SRC er kendt for at være involveret i reguleringen af ​​celleproliferation, apoptose, og migration, vi undersøgt, om miR-203 ville regulere SRC at modulere celleproliferation, apoptose, og migration i A549 celler. Til støtte for den opfattelse, at SRC er afgørende for at fremme spredning [25], A549 celler transficeret med SRC siRNA viste hæmning af celleproliferation (figur S4A i File S1); i modsætning hertil transfektion med SRC-overekspression plasmid, der specielt udtrykker den åbne læseramme i fuld længde (ORF) af SRC uden MIR-203-responsive 3′-UTR, havde en modsat virkning på celleproliferation (figur s4b i File S1). Efterfølgende vurderes vi rollen som MIR-203 på celleproliferation. Som forventet havde A549 celler transficeret med præ-MIR-203 faldt SRC proteinniveauer (figur 5, A og B) og prolifererede til en meget lavere pris (figur 5C). Tabel S1.