PLoS ONE: Deregulering af Microcephalin og ASPM Expression er korreleret med Epithelial kræft i æggestokkene Progression

Abstrakt

Mutationer i

MCPH1

(Microcephalin) og

ASPM

(unormal spindel -lignende mikrocephali forbundet) gener forårsage primær mikrocefali. Begge er centrosomal associerede proteiner involveret i mitose. Microcephalin spiller en vigtig rolle i DNA beskadigelse respons og ASPM er påkrævet for korrekt fordeling af proliferative neuro-epitelceller i den udviklende hjerne. Reduceret

MCPH1

mRNA-ekspression og

ASPM

mRNA overekspression har været impliceret i udviklingen af ​​de menneskelige karcinomer. Epiteliale ovariecancer (EOC) er kendetegnet ved meget aneuploide tumorer. Vi har tidligere rapporteret lav Microcephalin og høje ASPM protein niveauer og foreninger med klinisk-patologiske parametre i maligne celler fra ascitesvæsker. For at bekræfte disse tidligere resultater på en større skala Microcephalin og ASPM ekspressionsniveauerne og lokalisationer blev evalueret ved immunhistokemi i to kohorter; en uddannelse sæt af 25 prøver og en validering sæt af 322 EOC vævsprøver. Resultater blev korreleret til de associerede histopatologiske data. I normale ovariale væv den Microcephalin nukleare farvningsmønster var konsekvent stærk. I kræft væv, identificerede vi lave nukleare Microcephalin ekspression i høj kvalitet og avancerede trin tumorer (

s

0,0001 og p = 0,0438 henholdsvis). ASPM havde moderat til høj nukleare og lav til moderat cytoplasmatisk udtryk i normalt væv. Cytoplasmatisk ASPM udtryk faldt med tumor klasse og trin i serøs undertype af EOC (p = 0,023 og p = 0,011 henholdsvis). Cytoplasmatisk ASPM steget med tumor fase i endometrioide undertype (p = 0,023). Forøgelse tumorindtrængen (T3) og lymfeknuder (N1) også korreleret med et fald i cytoplasmatisk ASPM i EOC (p = 0,02 og p = 0,04 respektivt). Vi har valideret tidligere fund af dereguleret udtryk for Microcephalin og ASPM i EOC ved at bekræfte foreninger for lavt nukleare Microcephalin niveauer og høje cytoplasmatiske ASPM niveauer i en større skala tumorvæv undersøgelse. Microcephalin og ASPM kan vise sig nyttige biomarkører i EOC

Henvisning:. Alsiary R, ​​Brüning-Richardson A, Bond J, Morrison EE, Wilkinson N, Bell SM (2014) Deregulering af Microcephalin og ASPM Expression er korreleret med Epithelial Kræft i æggestokkene Progression. PLoS ONE 9 (5): e97059. doi: 10,1371 /journal.pone.0097059

Redaktør: Xifeng Wu, MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: Februar 15, 2013; Accepteret: 14. april, 2014 Udgivet: 15. maj 2014

Copyright: © 2014 Alsiary et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde og Dr. Brüning-Richardson blev finansieret af Yorkshire Cancer Research [L328] til Drs Morrison, Bond og Bell. The University of Leeds understøtter Dr. Bell, Dr. Bond og Dr. Morrison. Dr. Alsiary af et stipendium fra den saudiarabiske Ministeriet for Videregående Uddannelser, Dr. Wilkinson af Leeds universitetshospitaler NHS Trust. Dr. Wilkinson holder finansiering fra Wellbeing af kvinder. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ca. 225.000 nye tilfælde af kræft i æggestokkene blev diagnosticeret i 2008 på verdensplan, omfattende 4% af alle kvindelige kræftformer [1], [2]. De fleste af ovariecancer er epitel, ofte til stede ved fremskredne stadier og er forbundet med høj dødelighed [3]. Derfor er afgørende for udviklingen af ​​vores forståelse af den molekylære patogenese af epitelial ovariecancer (EOC) undersøge funktion og udtryk af potentielle prognostiske proteiner. Dette er især ønskeligt med hensyn til identifikation af diagnostiske biomarkører for patientbehandling [4].

MCPH1

MCPH5

gener koder Microcephalin og den unormale spindel-lignende microcephaly-associeret protein (ASPM) henholdsvis [5], [6].

MCPH1

MCPH5

er to af ti mikrocephali gener identificeret, som er impliceret i autosomal recessiv primære mikrocefali (MCPH) [7] – [13]. Microcephaly er karakteriseret ved reduceret føtal vækst hjerne som følge af mitotiske fejl under embryonale hjernens udvikling [14]. Microcephalin er et nukleart og cytoplasmatisk protein bestående af 835 aminosyrer. Proteinet indeholder tre BRCA1 C-terminalen domæner (BRCT), en

N

terminalt placeret og to i

C

terminalen [5]. Microcephalin er involveret i DNA beskadigelse respons med en yderligere rolle som regulator af kromosomkondensering forhindre celler i at komme ind mitose før DNA-replikation er afsluttet [15] – [17]. Microcephalin er også kendt som BRIT1 (

BRCT

-repeat inhibitor af hTERT-ekspression), som oprindeligt blev identificeret som en transkriptionel repressor af human telomerase revers transkriptase (hTERT), den katalytiske underenhed af human telomerase [18]. Den ASPM protein består af 3477 aminosyrer [6] organiseret i en formodet

N

terminale mikrotubulus bindende domæne [19], [20], to Calponin homologi gentage motiver, over 80 isoleucin-glutamin (IQ) gentagelser [6], [21], som typisk binder calmodulin og et

C

terminalen består af en enkelt Armadillo lignende sekvens og en region involveret i cytokinese [8], [22]. ASPM spiller en rolle i kontrollen mitosespindelen funktion [6], [22]. ASPM er placeret på spindlen poler i metafase og på kernen og centrosom under interfase [6], [22] – [27]. Endvidere ASPM lokaliseres til midterskrog under cytokinese, hvilket antyder, at det spiller en rolle i abscission [22], [27].

Adskillige rækker af beviser indikerer, at Microcephalin og ASPM spille en rolle i carcinogenese. På DNA-niveau, Rai

et al.

Rapporterede, at

MCPH1

kopital blev reduceret i 40% (35/87) af avanceret EOC og i 72% (39/54) af bryst kræfttilfælde [16]. Ligeledes på mRNA-niveauet

MCPH1

mRNA blev reduceret i 63% (19/30) af EOCs [16]. Vi har rapporteret reduceret Microcephalin protein niveauer i 29% (93/319) af invasive ductal brystcarcinomer, med Microcephalin udtryk faldende med stigende brystkræft klasse. Vigtigere, Microcephalin var en uafhængig forudsiger af samlede brystcancer specifik overlevelse [28]. For nylig yderligere to små brystkræft undersøgelser har bekræftet den sammenslutning af reducerede Microcephalin udtryk med tumor progression og prognose [29], [30]. Nedsat Microcephalin udtryk blev også rapporteret i en lille prostatakræft undersøgelse [16], som foreslog, at der eksisterer en negativ korrelation mellem Microcephalin niveauer genomisk stabilitet og kromosomafvigelser. For nylig inaktivering af

MCPH1

ved sletning, promoter methylering og mutationen blev identificeret i en mundtlig pladecellekræft undersøgelse [31]. Denne undersøgelse viste også, at Microcephalin overekspression inhiberede proliferation, invasion og forankringsuafhængig vækst og tumorvækst i nøgne mus støtter tumorsuppressorfunktion af Microcephalin [31].

I modsætning hertil

ASPM

mRNA niveauer blev forøget i tumor og transformerede humane celler [26], [32]. Øget

ASPM

mRNA og protein niveauer blev også identificeret i glioblastoma multiforme (GBM), hvor de blev forbundet med stigende tumor klasse [32], [33]. Desuden

ASPM

mRNA-opregulering blev identificeret i 66% (162/247) af hepatocellulære carcinomer, en observation forbundet med forøget invasion, høj fase og tidlig tumortilbagevenden [34]. For nylig opregulering af ASPM korreleret med reduceret overlevelse patient er også blevet identificeret i bugspytkirtelkræft [35].

Vores seneste EOC undersøgelse bestemmes en sammenhæng mellem Microcephalin og ASPM niveauer med tumor kvalitet og overlevelse i cellelinjer og i primære kulturer af maligne celler afledt fra æggestokkene ascites prøver [36]. I dette arbejde har vi valideret vores oprindelige resultater i en større skala undersøgelse udnytte EOC vævsprøver og har undersøgt roller Microcephalin og ASPM i EOC progression. Vores resultater tyder på, at Microcephalin og ASPM kan være nyttige biomarkører i EOC management.

Materialer og metoder

Etik Statement

Passende etisk godkendelse blev opnået fra den lokale Research Ethics Committee of den Leeds universitetshospitaler NHS Trust, Leeds, UK, (REC henvisning 09 /H1306 /96). Alle deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke, og alle data blev analyseret anonymt.

Patient prøver

En kohorte af 25 tumor arkivering, formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) blokke blev opnået fra histopatologi afdeling af St James ‘Universitetshospital, Leeds og bruges til at skabe den indstillede træning. Prøven sat i denne kohorte repræsenterede fire store (oftest stødt) EOC undertyper (serøs, endometrioide, mucinøse og carcinosarcoma) og var overvejende grad 3 tumorer. Alle blokkene i denne kohorte blev derefter kombineret i én in-house væv microarray (TMA). En normal kohorte bestod af 16 æggestokkene vævsprøver taget fra enten normal æggestok eller fra normalt væv ved siden af ​​tumor plus 4 normal æggeleder og 4 normale endometrium prøver var også tilgængelig.

En anden uafhængig kohorte af 322 EOC prøver blev opnået fra Tissue Array Networks og blev udpeget valideringen sæt. Valideringen sæt bestod af 294 forskellige prøver af fem store EOC undertyper (serøs, endometrioide, adenocarcinom, mucinøs og klar celle), plus 8 normale æggestokkene væv taget fra normal æggestok og 20 fra normalt væv støder op til tumor. De 322 sager var repræsenteret i 616 kerner, med dobbelt kerner for kræfttilfælde og en enkelt kerne for normalt væv. Vævskerner var 0,6 mm i diameter med en tykkelse på 5 um. Kliniske data (kvalitet, patologi diagnose, International Federation of Gynækologi og Obstetrik (FIGO) mellemstationer og TNM mellemstationer [37]) var tilgængelige for denne kohorte. Den gennemsnitlige alder af de 294 patienter var 48 år (interval: 19 til 76 år). Resultaterne for association med alderen blev opnået efter oplysningerne blev dikotomiseret i to grupper ( 50 og ≤50). Detaljerede patient karakteristika valideringen sæt er sammenfattet i tabel 1.

Tissue Microarray Construction

En in-house TMA blev konstrueret fra 25 EOC prøver på Leeds Institut for Kræft og Patologi facilitet efter en protokol beskrevet af Ellis

et al

[38]. Manuelle væv arrayer slag med en diameter på 0,6 mm (Beecher Instruments, Inc) blev brugt til at skabe kernerne. Tissue kerner blev udvalgt fra de mest repræsentative tumor område i hver tumor blok efter gennemgang af den tilhørende hæmatoxylin og eosin farvede lysbilleder af specialist gynækologisk histopatolog (NV).

Immunhistokemi Påvisning af Microcephalin og ASPM

for at optimere Microcephalin og ASPM farvningsprotokol, den i hus EOC TMA snit blev farvet ved hjælp af en række antistof fortyndinger og antigen hentning metoder. Microcephalin og ASPM blev farvet separat under de samme betingelser med undtagelse af antistof hentning og fortynding. Objektglas blev deparaffinised og rehydreret under anvendelse xylen og ethanol serien. For at blokere brint peroxidaseaktivitet blev slides gennemvædet i 3% H

2O

2 i methanol. Antigen genfinding blev udført under anvendelse Vector antigen-genvinding puffer (Vector Laboratories Ltd) i en trykkoger i 4 minutter for Microcephalin og 2 minutter for ASPM. Snit blev blokeret med 1:10 vektor kasein-opløsning (Vector Laboratories) for at reducere ikke-specifik farvning. På TMA sektioner kanin-anti-Microcephalin antistof ab2612 (Abcam) blev anvendt ved 1/300 og kaninen anti-

N

terminal ASPM antistof 216,1 [36] bruges på 1/400. Objektglassene blev inkuberet ved 4 ° C natten over i et fugtigt kammer. Efter tre gange vask med TBS Tween (0,1%) blev objektglassene inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med kanin /mus sekundært, peroxidasekonjugeret EnVision polymer (DAKO). Efter yderligere vaske reaktionsblandingen blev visualiseret ved tilsætning af 2% diaminobenzine + kromogen i DAP substratbuffer i 10 minutter (Dako). Snit blev modfarvet med Mayers hæmatoxylin (VWR International Ltd). Negative kontroller uden primært antistof og positive kontroller af normalt ovarievæv blev inkluderet i hver batch af immunhistokemi.

Microcephalin og ASPM Antibody Validation

For at bestemme farvningen specificiteten af ​​Microcephalin antistof på FFPE prøver blev et immuniserende peptid blokerer eksperiment udført på EOC vævssnit og på 25 core in-house TMA. Antistoffet blev neutraliseret ved præ-absorption med BRIT1 peptid ab13737 (Abcam). Antistoffet blev fortyndet til dens forudbestemte arbejdskoncentration (beskrevet ovenfor) og inkuberet med et tidobbelt overskud af peptid natten over ved 4 ° C før anvendelse til vævet. Vævssnit med neutraliseret antistof blev sammenlignet med tilsvarende vævssnit farvet med antistof alene.

Vi havde allerede bestemt antistof specificitet ASPM antistof 216,1 i tidligere arbejde ved peptid blokerer immunfluorescens eksperimenter [36]. Vi bekræftede yderligere farvningen mønster af antistoffet observeret i IHC ved farvning den samme in-house EOC TMA med et andet antistof (279,3), der genereres mod

C

terminalen af ​​ASPM. Lignende farvning resultater blev opnået med begge antistoffer med kun små forskelle mellem cytoplasmatiske farvning niveauer.

For yderligere validering af specificitet og følsomhed af antistofferne og styre for virkningerne af formalin fiksering og antigen hentning,

MCPH1

ASPM

blev slået ned i U-2 OS cellelinje (ATCC, Manassas, VA, USA) siRNA som tidligere beskrevet [17], [36], [22]. Efter 72 timer celler blev høstet, pelleteret, formalin fast og suspenderet i 1% agar derefter paraffin indlejret og brugt som kontrol for antistof validering.

immunhistokemisk Evaluering

Alle TMA sektioner blev scannet ved hjælp af Aperio Scan Scope slide scanner (Aperio Technologies) på 40x forstørrelse, der bruger morfometri værktøjer i Imagescope software (Aperio). For både Microcephalin og ASPM de replikat kerner til hver prøve blev scoret til farvning intensiteter af nukleare og cytoplasmatisk farvning (intensitet score, 0 = ingen farvning, 1 = svag farvning, 2 = moderat farvning og 3 = stærk farvning) samt andelen af celler med positiv nukleare eller cytoplasmatisk farvning inden kernerne (andel score). For at analysere Microcephalin farvning den semikvantitative Allred (hurtig) 8-enhed blev anvendt [39]. Andelen af ​​positive nukleare eller cytoplasmatiske farvede celler i hver kerne blev defineret som 0 = ingen farvning, 1 = 1% farvning, 2 = 1-10% farvning, 3 = 11-33% farvning, 4 = 34-66% farvning, 5 = 67-100% farvning. Det endelige resultat blev opnået ved at tilsætte intensitet scoringer til andelen scoringer, at opnå et minimum score på 0 og højst score på 8. Sager med en score på 4 eller lavere blev kaldt lav, mens sager med en score på 5 eller 6 var mærket som moderat og prøver med en score på 7 eller 8, blev anset for at udtrykke høje niveauer af Microcephalin. For dataanalyse af ASPM udtryk en lidt mere følsom dataanalyse system blev anvendt, hvor farvningen intensitet blev multipliceret med procentdelen af ​​celler med nukleare eller cytoplasmatisk farvning [40]. den laveste score var således 0 og den højeste 300. Prøver med en score på 0 blev kaldt negativ, prøver med en score på 1-100 lave, prøver med en score på 101-200 moderat og prøver med en score på 201-300 var scoret så højt ekspressionsniveauer. For diskontinuerlig dataanalyse alle negative og lave prøver blev udpeget lav og alle mellemstore og høje prøver blev udpeget høje ASPM niveauer.

Statistisk analyse

Den ikke-parametrisk Kruskall-Wallis (KW) og Wilcoxon -Mann-Whitney (WMW) testen blev anvendt til at identificere sammenhængen mellem Microcephalin og ASPM med kliniske variabler (sygdom fase, kvalitet, histologi typen, metastaser, lymfeknude involvering og alder af patienter). Alle statistiske tests var to-sidet og en

P

≤ 0,05 værdier blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Microcephalin og ASPM Antibody Karakterisering

Microcephalin og ASPM antistoffer blev oprindeligt optimeret til brug på paraffinindlejrede TMA sektioner. Immunhistokemi med disse antistoffer viste, at Microcephalin og ASPM blev lokaliseret i kernen og i cytoplasmaet i både den normale (figur 1) og EOC vævsprøver (figur 2). Den nukleare Microcephalin farvningsmønster blev afskaffet når antistoffet blev præ-inkuberet i nærvær af peptidet. Men nogle ensartet cytoplasmatisk farvning lavt baggrundsniveau var stadig til stede i alle kerner (figur S1). Derfor har vi ikke medtaget den cytoplasmatiske Microcephalin farvning i yderligere analyse

Normalt æggestokkene epitel demonstrerer stærk Microcephalin udtryk i både kerner og cytoplasma (A D). Og stærke kernekraft og moderat cytoplasmatisk ASPM udtryk (G J). Normal æggeleder demonstrerer heterogene moderat nukleare og svag cytoplasmatisk Microcephalin farvning (B K). Normal Endometrium viser heterogene stærke kernekraft og cytoplasmatisk Microcephalin farvning (C F) og stærke kernekraft og svage cytoplasmatisk ASPM farvning (I L). Alle billeder er x15 forstørrelse.

serøs adenocarcinom TMA-kerner viser nukleare og cytoplasmatisk Microcephalin (A og B) og ASPM udtryk (C og D) hhv. Hvide pil viser nuklear farvning og sort pil viser cytoplasmatisk farvning. A og B er 20x, C og D er 40x forstørrelse.

farvning mønster for ASPM antistof 279,3 udført parallelt med farvning med antistoffet 216,1 afsløret, at cytoplasmatisk farvning var den samme for begge antistoffer. Imidlertid 216,1 viste en mere udtalt mønster nuklear farvning end 279,3 og følgelig dette antistof blev anvendt til at farve EOC validering sæt. Resultater for farvede mønstre af repræsentative kerner og en sammenfatning af farvning resultaterne er vist i figur S2 og tabel S1.

For yderligere at bekræfte gyldigheden af ​​antistofferne til at farve paraffinindlejrede væv blev antistofferne testet på paraffin -embedded U-2 OS-celler med og uden siRNA knockdown for Microcephalin eller ASPM. Knockdown celler til begge gener viste meget svag farvning i forhold til kontrollen siRNA (figur S3).

Microcephalin Expression i Normal og EOC vævsprøver

Normalt æggestokkene, endometrium og æggeleder vævsprøver alle afsløret stærk nuklear Microcephalin farvning. Størstedelen (90%) af normale ovarieepitelceller vist sig positiv Microcephalin farvning mens dette var lidt lavere (70-80%) i endometriet og fallopian rør prøver (figur 1A-F). I første omgang blev ekspressionen af ​​Microcephalin evalueret i den i hus uddannelse sæt TMA. Dichotomous analyse i træningssættet demonstrerede tab af Microcephalin udtryk i 16/22 (73%) tilfælde (tabel 2). I EOC validering sæt, blev lav Microcephalin ekspression identificeret i 30% (89/294) af EOC prøver (tabel 3). Da vi var især interesseret i Microcephalin ekspressionsniveauerne og dens association med tumorudvikling, undersøgte vi vores IHC data til at identificere mulige sammenhænge med de tilknyttede kliniske data. Interessant dikotome analyse i træningssættet demonstrerede tab af Microcephalin udtryk i lønklasse 3 EOC tumorer (tabel 2). Dette resultat blev bekræftet i valideringen sæt med lav nukleare farvning hovedsageligt findes i karakteren 3 tumorer (48%; 53/110 p 0,0001). I lav-grade tumorer, var moderat eller høj nukleare farvning observeret (

s

0,0001) (Figur 3). Microcephalin nukleare udtryk faldt også med øget tumor fase (

s

= 0,0438) (Figur 4). Patienter over 50 år viste lavere nukleare Microcephalin niveauer (tabel 3), men forskellen var ikke statistisk signifikant (

s

= 0,0581). Ingen væsentlige ændringer i Microcephalin udtryk blev identificeret mellem forskellige patologiske undertyper (

s

= 0,486) (tabel 3). Men de fleste (8/10, 80%) af klare cellecarcinomer vises moderat eller stærk Microcephalin immunfarvning. Det kan afspejle, at 6/8 af disse tilfælde var trin I og eller at de forskellige undertyper af EOC følge forskellige molekylære veje. Vi bemærkede også høje tab af Microcephalin i serøs og mucinøs adenokarcinom (68/207, 33% og 15/44, 34% henholdsvis tabel 3). Figur 5A-D viser ekspressionen af ​​Microcephalin i de forskellige epitelial ovariecancer undertyper.

Ai. Normal ovarie epithelvæv med høj Microcephalin ekspression. Aii-iv. Adenocarcinom TMA-kerner viser stærk Microcephalin udtryk i en lav kvalitet tumor (Aii), moderat Microcephalin i grad 2 (AIII) og lave niveauer af nukleare Microcephalin udtryk i en høj kvalitet tumor (AIV). Alle billeder er 40x forstørrelse. B. Sammenhængen mellem nukleare Microcephalin udtryk falder med stigende tumor bedømmelse (

s

0,0001 ved hjælp af en ANOVA test)

Ai.. Normal ovarie epitelvæv demonstrerer høje Microcephalin ekspressionsniveauer. Aii-4IV Adenocarcinom TMA-kerner viser stærk Microcephalin (Aii), moderat Microcephalin (AIII) og lave niveauer af nukleare Microcephalin udtryk (AIV) i fase 1, 2 og 3 tumorer hhv. Alle billeder er 40x forstørrelse. B. Svage Microcephalin niveauer i kernen er forbundet med fremskreden tumor stadie (

s

= 0,0438 ved hjælp af en ANOVA-test).

A. Clear cell carcinoma og B. endometrioide adenocarcinom både viser stærk Microcephalin udtryk. C. mucinøs adenocarcinom og D. serøs adenocarcinom både præsentere svag Microcephalin udtryk. Alle billeder er x40 forstørrelse. Vejviser

ASPM Expression i Normal og EOC vævsprøver

Den normale æggestokkene epitel, endometrium og æggeleder viste variabel ASPM udtryk, med moderat til høj nukleare udtryk og lav til moderat cytoplasmatisk ASPM farvning (Figur 1G-L). Den ASPM udtryk mønster i EOC blev bestemt ved immunhistokemi hjælp af uddannelse sæt af 25 paraffinindlejrede sektioner. Den farvning mønster i disse tumorprøver var nukleare og cytoplasmisk. I træningssættet, var høj nukleare farvning (kombineret medium og stærk farvning mønster) observeret i high-grade tumorer (9/14, 64,3%), mens høj cytoplasmatisk ASPM var til stede i alle kerner uanset klasse. Men inddele farvning i svag, middel og stærk afslørede en stigning i høje nukleare ASPM niveauer i karakteren 3 tumorer. Samlet set blev andelen af ​​positive nukleare farvning kategoriseret i stærk (21%, 4/19), medium (31,6%, 6/19) og svage (47,4%, 9/19) (tabel 4). Analyse viste, at 10,5% (2/19) af prøverne havde stærk cytoplasmatisk farvning og 89,5% (17/19) havde moderat cytoplasmatisk farvning. Lav cytoplasmatisk farvning blev ikke observeret. Yderligere analyse viste en tendens til øget cytoplasmatisk og nuklear ASPM farvning med bedømmelse (tabel 4).

I valideringssættet nukleare og cytoplasmatisk farvning blev også observeret. Farvningsmønstrene forskelligt mellem de forskellige tumorprøver og eksempler på lav og høj ASPM ekspression er vist i figur 6A-D. Ingen statistisk signifikante associationer blev identificeret mellem nuklear ASPM udtryk og de kliniske data. Selvom interessant 52/294 (18%) af tilfældene viste høj nukleare ASPM udtryk, som steg med grad. Analyse af valideringen sæt med kontinuerlig dataanalyse afslørede lave niveauer af cytoplasmatisk ASPM signifikant korreleret med high-grade tumorer i serøs undertype (p 0,001) (figur 7A). Diskontinuerlig analyse afslørede, at der var en signifikant korrelation mellem lav cytoplasmatisk ASPM og høj tumor bedømmelse (p = 0,0138) og også tumor FIGO fase (p = 0,032) (tabel 5). Yderligere analyse af de diskontinuerte data ved opdeling i cancer undertyper afslørede, at ud over korrelationen af ​​lav cytoplasmatisk ASPM med høj tumorklassificering, var der også en sammenslutning af faldende ASPM cytoplasmiske niveauer med stigende grad i serøs subtype (p 0,0001) ( figur 7B) og en stigning af ASPM ekspressionsniveauer med stigende tumor fase i endometrioide subtype (p = 0,0229) (figur 7C). En signifikant sammenhæng mellem faldende cytoplasmatisk ASPM farvning og trin i serøs undertype blev også identificeret (p = 0,0017) (Figur 7D). En signifikant sammenhæng mellem cytoplasmatiske ASPM niveauer og patientens alder blev ikke observeret (tabel 5).

A og B. TMA kerne med lav nukleare og cytoplasmatisk ASPM udtryk. C og D. TMA kerne med høj nukleare og cytoplasmatisk ASPM udtryk. Hvid pil angiver nuklear farvning, sort pil angiver cytoplasmatisk farvning. A og C er 6.2x og B, D er 20x forstørrelse hhv.

A. Cytoplasmatiske ASPM niveauet falder med kvalitet i serøs EOC (kontinuerte data, s 0,0001). B. Cytoplasmatisk ASPM niveauet falder med tumor lønklasse i serøs undertype (diskontinuerlige data, p = 0,0239). C. Cytoplasmatisk ASPM niveauerne stiger med sygdom etape i endometrioide EOC (diskontinuerlige data, p = 0,0229). D. Cytoplasmatisk ASPM niveauet falder med sygdom fase i serøs undertype (diskontinuerlige data, p = 0,0017). E. Cytoplasmatisk ASPM niveauet falder med tumor invasion (diskontinuerlige data, p = 0,02). F. Høje cytoplasmiske ASPM niveauer korrelerer med ingen lymfeknuder (p = 0,04). Alle data analyseres ved hjælp af en ANOVA-test.

Forholdet mellem Histopatologisk Iscenesættelse (FIGO og TNM mellemstationer) og Microcephalin og ASPM udtryk

I valideringssættet Microcephalin fandtes at falde med stigende tumor stadie ved brug af FIGO iscenesættelse systemet (

s

= 0,0438) (tabel 3). Tilsvarende ASPM cytoplasmatisk farvning faldt med stigende tumor stadie ved brug af FIGO iscenesættelse systemet (

s

= 0,0032) (tabel 5). Microcephalin og ASPM ekspressionsniveauerne blev yderligere vurderet i forbindelse med sygdommens sværhedsgrad som bestemt af niveauet af tumorindtrængen (T1, T2 og T3). Nuclear Microcephalin ekspressionsniveauer faldt, selv om tumoren var begrænset til æggestokkene (T1; p = 0,0021). Når man sammenligner Microcephalin ekspression i T2 med kontrolgruppen, resultatet blev mere signifikant (p = 0,0009). Der var imidlertid ingen signifikant forskel i Microcephalin udtryk, når prøverne i T1, T2 og T3 grupper blev sammenlignet med hinanden. Desuden har Microcephalin udtryk ikke signifikant korrelerer med regional lymfeknude involvering (p = 0,1162) eller fjernmetastaser (p = 0,5251) (tabel 3).

For ASPM, en sammenhæng mellem cytoplasmatiske farvning niveauer og tumorindtrængen var identificeret. Høje cytoplasmiske ASPM niveauer blev fundet ved T1, der faldt betydeligt med T2 og T3 (p = 0,0198) (figur 7E). Høj cytoplasmatisk ASPM også korreleret med ingen lymfeknuder (n0), og det faldt med lymfekirtelinvolvering (N1) (p = 0,04) (figur 7F) (tabel 5).

Discussion

EOC ofte først diagnosticeret på et fremskredent stadium på grund af mangel på symptomer og pålidelige tidlige metoder afsløring. Følgelig identifikation af diagnostiske og prognostiske biomarkører for EOC er af stor klinisk betydning. I dette studie undersøgte vi ekspressionen af ​​to MCPH proteiner, Microcephalin og ASPM, i EOC tumor vævsprøver. EOC viser en høj grad af aneuploidi. DNA skade responset proteiner er en vital forsvar mod i disse proteiner genomisk ustabilitet og fejl kan føre til kræft. Microcephalin har en kendt rolle i DNA-reparation og ASPM for spindel funktion under mitose. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, hvorvidt Microcephalin og ASPM ekspression er forbundet med klinisk-patologiske parametre hos patienter med EOC. Begge proteiner havde vist sig at være dereguleret i andre kræftformer på en måde, der var forbundet med tumor progression [16], [28] -. [30], [36]

For nylig vi rapporteret en sammenslutning af Microcephalin og ASPM niveauer i maligne celler afledt ascitesvæsker fra EOC patienter med forskellige klinik-patologiske parametre [36]. I den nuværende, større undersøgelse skala, nukleare og /eller cytoplasmatisk Microcephalin farvning blev identificeret i tumorcellerne. Vores resultater i træningssættet afslørede en reduktion i nuklear Microcephalin udtryk i 73% (16/22) af EOC tumorer; denne procentdel blev reduceret til 30% (89/294) i valideringen sæt. Denne forskel mellem de to kohorter potentielt afspejler det højere antal klasse 3 tilfælde i træningssættet (73%; 16/22) i forhold til validering sæt (37%, 110/294). I denne undersøgelse lave Microcephalin ekspression blev identificeret i høj kvalitet og avancerede trin tumorer (

s

0,0001 og p = 0,0438 henholdsvis). Disse resultater matcher vores tidligere undersøgelse om æggestokkene ascites prøver, der er angivet, at Microcephalin udtryk blev reduceret i cellekulturer afledt ascites af EOC patienter med fremskredne tumorer [36]. Vores resultater er kompatible med undersøgelser, rapportering reducerede

MCPH1

DNA-kopi nummer i 72% (39/54) af brystkræft [16] og til vores egne resultater af reduceret Microcephalin udtryk i 93/319 (29%) af brystkræft prøver, især i den højere lønklasse tumorer [28].

Tidligere vi identificeret en sammenhæng mellem den unormale lokalisering af Microcephalin med tumor klasse i primære kulturer af maligne celler, der stammer fra ascitesvæsker fra patienter med EOC . I disse celler, cytoplasmisk Microcephalin steg med tumorklassificering. Vi foreslog, at kunne være på grund af

MCPH1

deletionsmutationer i C-terminale BRCT domæner, der tidligere har været vist at resultere i Microcephalin flytter fra en kerne og cytoplasma lokalisering ligner

BRCA1

[41 ], [42], [43]. En nylig undersøgelse karakteriserer forskellige

MCPH1

splejsningsvarianter rapporterede mutation eller sletning af nukleare lokalisering signaler inden for

MCPH1

gen resulterede i en lokalisering ændring fra kerne og cytoplasma [43].